分子生物学实验十二讲义教材
分子生物学实验讲义.
分 子 生 物 学 实 验 讲 义内蒙古科技大学数理与生物工程学院自治区基础生物实验示范中心基础生物教学部2009年10月目录实验一质粒DNA的小量提取实验二琼脂糖凝胶电泳实验三大肠杆菌感受态细胞的制备实验四大肠杆菌感受态细胞转化宿主细胞实验五聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片断实验六重组DNA分子的构建实验七质粒DNA的酶切和电泳鉴定实验八植物基因组DNA的提取实验九植物基因组总RNA的提取实验十与人类遗传病相关的核苷酸重复序列的克隆实验一 质粒DNA的小量提取一、目的要求1、掌握用碱变性法提取质粒DNA的技术2、掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法二、基本原理在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒，大小在1kb-200kb 之间，是双链闭合环状的DNA分子。
在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在，其中细菌质粒存在最为普遍，在基因工程中常用作基因载体。
碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA 的方法，此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。
当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、仪器、材料和试剂（一）仪器微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计（二）材料含有质粒的大肠杆菌DH5a（三）试剂及溶液LB培养基、葡萄糖1、用于碱法提取质粒DNA的溶液溶液1（GET）缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HClpH8.0，用前加溶菌酶4mg/Ml。
分子生物学导论--分子生物学实验技术 ppt课件
本次内容
一、核酸杂交 二、分子标记 三、遗传图谱、物理图谱 四、图位克隆 五、重组DNA、细菌转化
精品资料
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• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
10×Buffer
2.0µl
Mg2+（25mM） 1.2µl
Taq酶（5U/µl） 0.1µl
dNTP（25mM） 0.2µl
加水至20µl，混合后，进行 PCR扩增 。
PCR反应程序：
Step1 95℃ 2分钟 Step2 95℃ 30秒 Step3 56℃ 30秒
（SSR引物退火温度在52-65 ℃ 不等。 ） Step4 72℃ 60秒 Step5 GOTO Step2 31循环
对BC3F3（113株）田间成株期鉴定为： R : S = 78 : 35
2.抗条锈病基因Yr5的SSR标记的建立
6个抗病株DNA和6个感病株DNA以2BL上的17对SSR 引物进行PCR扩增和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳多 态性引物Xgwm501对BC3F2（44株）和BC3F3（113株） 进行分析 Xgwm501—195bp、160bp 11.9cM Yr5基因
2、基因重组和连锁理论 连锁图谱构建的理论基础是染色体的交换 与重组。
基因的连锁是位于同一染色体上的基因在遗 传过程中一般倾向于维系在一起。
基因的重组是通过一对同源染色体的两个非 姊妹染色单体之间的交换来实现的。
Sh C P1
Sh C
Sh C
94％
细胞
无交
sh c
换
2024年《分子生物学实验》课程教学大纲
《分子生物学试验》课程教学大纲课程编号： 05030适用专业：生物工程与生物技术试验学时数：36学时试验学分：1教材：主要参考书：《分子生物学试验指导》徐庆华等成栋学院立项教材 2024一、课程说明《分子生物学试验》以介绍分子生物学中的试验方法、试验手段和培育学生试验操作技能为其主要内容。
须要以分子生物学基本理论为基础，其教学目的是为了提高学生在分子生物学技术方面的动手实力，培育学生分析问题和解决问题的实力。
通过试验，要求学生能在原有的相关理论学问基础上较全面和深化理解分子生物学基本原理，驾驭基本的分子生物学试验方法和技巧，初步具备肯定的试验设计实力，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。
本试验课在方法上力求经典，试验内容涉及了质粒DNA的提取及限制性内切酶酶切质粒分析；大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA转化大肠杆菌；应用多聚酶链式反应（PCR）体外基因扩增及产物鉴定；SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量等分子生物学的基本理论。
二、学时安排三、教学内容及教学基本要求试验一碱裂解法小量提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳检测一、试验特点试验类型：综合试验类别：专业基础安排学时：6 每组人数：2二、试验目的1、驾驭碱裂解法小量提取质粒DNA和试剂盒提取质粒DNA的原理和方法。
2、驾驭琼脂糖凝胶的制备及外源DNA的检测原理。
3、了解质粒DNA的粗略定量方法。
三、试验内容提要1、将单菌落接种于3m1含相应抗生素的LB培育基中，37℃摇菌过夜；2、12,000rpm离心30sec，收集菌体；3、加200u1溶液I(含RNaseA 100ug/ml )，振荡悬浮菌体；4、加200ul新配制的溶液II，颠倒混匀；5、溶液澄清后马上加入预冷的200u1溶液III混匀后冰上放置5~10 min；6、4℃、12,000rpm离心15min，取上清，加0.7倍异丙醇混匀，室温静置5min；7、12,000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀，抽干后溶于适量水或TE，-20℃保存备用。
分子生物学实验讲义
实验质粒DNA的碱裂解法提取与纯化一、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA, 大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份, 通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态, 但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上, 随着染色体的复制而复制, 并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子, 重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取, 本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法, 其基本原理为: 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时, 蛋白质与DNA发生变性, 当加入中和液后, 质粒DNA分子能够迅速复性, 呈溶解状态, 离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状, 离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如, 氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法, 但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA, 经过苯酚、氯仿抽提, RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA, 所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求, 故在分子生物学实验室中常用。
二、实验试剂1.溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖, 25mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml, 0.5M EDTA（pH 8.0）10ml, 葡萄糖4.730g, 加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min , 贮存于4℃。
2.溶液Ⅱ: 0.2N NaOH, 1% SDS。
2N NaOH 1ml, 10%SDS 1ml, 加ddH2O至10ml。
分子生物学导论--分子生物学实验技术 ppt课件
1. 将1 g叶片用液氮速冻后，迅速研磨成白色粉末，置入1.5 ml 离心管中； 2. 加入600 ul 预热的cTAB提取液65℃水浴提取1 hr，其中每10 min颠倒混
匀1次； 3. 取出离心管，冰浴冷却5 min 后，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1），轻
1、根据带的深浅（明暗），估计含量
2、根据杂带的多少，判断纯度
3、根据和对比带（marker）比较, 大概知道片段的大小
Polyacrylamide (聚丙稀酰 胺):
has high resolving capability, and can resolve DNA/RNA that differ from each other as little as a single base pair/nucleotide.
4. 因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(OligodT)NA也可用于Northern blot试 验。
提取植物RNA时，要注意的问题：
1）一般用机械研磨的方法破碎植物 组织细胞；
2）要加入蛋白质变性剂，使核蛋白 与RNA分离并释放出RNA；
2.2 植物总RNA的提取与电泳
由于RNA是基因表达过程中非常重要的生物分子，如 mRNA,它携带了DNA的全部编码信息。 RNA的分离是研究基因功能的重要基础之一，在分子生 物学中占有重要的地位。提取的mRNA可用于Northern验。
Agarose (琼脂糖):
(1) a much less resolving
4 kb 3 kb
power than
2 kb
polyacrylamide,
1 kb
(2) but can separate DNA
分子生物学实验讲义
质白蛋品样知得小大量子分准标据根后毕完泳电在以可则 �品样准标量子分质白蛋用使时同
再不率移迁泳电的中胶凝 EGAP-SDS 在质白蛋�此因。状形的似相现呈中液溶在物合复质
。失消异差荷电的间之子分 �荷电负的度密等均有带都物合复质白蛋-SDS 种各使 �别差荷电 的身本子分质白蛋了盖掩而因 �量电带的有原子分质白蛋过超远远量荷电且 �荷电负量大有 与能则�SDS 入加中胶凝 EGAP 和品样白蛋在�剂性活面表种一是 SDS�应效荷电�2 带根酸硫基烷二十于由。子分 SDS 层一盖覆面表质白蛋使�合结团基水疏的上子分质白蛋
50.0 4. 0
铵酸硫过 %01 DEMET %1 lCH-sirT 8.6Hp L/lom 5.0 SDS %01 水馏蒸
57.0 50.0 �
8. 0
52.1
5. 2 � )lm(液溶胶缩浓%5
lCH-sirT 8.8 Hp L/lom 5.1
0.4
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液备贮胶凝 %01
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2024年《分子生物学》全册配套完整教学课件pptx
运输功能
如载体蛋白，血红蛋白等 ，在生物体内运输各种物 质。
免疫功能
如抗体蛋白，参与生物体 的免疫应答。
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蛋白质的功能与调控
调节功能
如激素，生长因子等，调节生物 体的生长发育和代谢过程。
2024/2/29
储存功能
如植物种子中的贮藏蛋白，动物体 内的肌红蛋白等，储存能量和营养 物质。
个性化医疗
根据患者的基因信息，制定个 性化的治疗方案。
药物基因组学
预测患者对药物的反应和副作 用，指导合理用药。
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基因治疗的原理与应用
基因治疗的原理
通过导入正常基因或修复缺陷基因， 从而治疗由基因突变引起的疾病。
遗传性疾病的治疗
如视网膜色素变性、腺苷脱氨酶缺乏 症等。
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癌症治疗
利用基因编辑技术，修复或敲除癌症 相关基因，抑制肿瘤生长。
基因表达调控的层次
基因表达调控可分为转录前调控、转录水平调控、转录后调控和翻 译水平调控等多个层次。
基因表达调控的意义
基因表达调控对于生物体的生长发育、代谢、免疫应答等生理过程具 有重要意义，同时也是疾病发生发展的重要因素。
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原核生物的基因表达调控
1 2 3
原核生物基因表达调控的特点
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DNA损伤的修复机制
直接修复
针对某些简单的DNA损伤，如碱 基错配，可通过特定的酶直接进行 修复。
碱基切除修复
通过识别并切除受损碱基，再合成 新的DNA片段进行修复。
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核苷酸切除修复
针对较严重的DNA损伤，如嘧啶 二聚体，通过切除一段包含受损部
南京大学分子生物学实验课讲义
分子生物学实验课讲义第一讲实验室纪律、实验室安全及分子生物学基本操作1．所有必修及选修该实验课的学生必须按时进入实验室并按分组名单就座，不得擅自调整组号，有特殊原因不能来上课者须提供书面请假条及相关证明。
2．上课期间须关闭手机铃声，不得使用任何音乐播放器，禁止讨论与实验课无关的话题，禁止阅读与实验课无关的读物。
3．严格按照正确的操作规程使用仪器，用后须关闭电源，不要用手直接触摸有害试剂，废弃物品须丢在指定位置。
4．保持实验台面整洁，如有污染，须及时清理，实验室地面卫生由值日学生在实验结束后统一打扫。
5．分子生物学实验每个组常用器材包括一套取液器（20 μl、200 μl及1000 μl 共三把）、取液器吸头以及离心管等。
6．20 μl取液器的量程为1 μl ～20 μl，200 μl取液器量程为20 μl ～200 μl，1000 μl取液器量程为200 μl ～1000 μl，20 μl取液器和200 μl取液器配黄色吸头，1000 μl取液器配蓝色吸头。
7．吸取液体前，首先要选择合适的取液器（例如吸取400 μl液体就应该选择1000 μl取液器），然后将取液器调至所需刻度，插好吸头，按下取液器顶端按钮，将吸头尖端伸至液面下1～2 mm处，缓慢松开按钮，最后把所吸液体打入离心管或其它容器（打的时候可稍快）。
8．离心管最好在使用之前做上记号，以免不同样品之间产生混淆，离心管在离心机中必须平衡放置，并且离心管把要向外以便确定可能产生的沉淀的位置。
第二讲柱离心法小量提取质粒DNA实验原理：质粒是细菌中独立于染色体之外的较小的环状双链DNA，它通常携带某种药物（如氨苄青霉素，卡那霉素，链霉素，四环素等）的抗性基因，具有独立的复制原点，并且具有较高的拷贝数（从几个到几百个不等）。
柱离心法首先用碱使大肠杆菌裂解，并使其中的DNA（包括质粒及细菌的染色体DNA）全部变性，再用酸性缓冲液中和，质粒DNA由于分子较小，很快复性，而染色体DNA分子巨大，几乎不能复性，最后和细胞碎片及膜蛋白共沉淀被离心去除，上清液中含有复性的质粒DNA，蛋白质，RNA，并且盐浓度较高，在这种条件下，质粒DNA能够牢固地结合在离心柱中的吸附基质上，而大多数蛋白质和RNA在离心时被穿过，残留在吸附基质上的少量蛋白质和RNA可以用漂洗液洗去，最后，吸附在离心柱上的质粒DNA用低离子强度的溶液或水洗脱。
分子生物学实验讲义
分子生物学实验讲义周天鸿李月琴朱嘉明前言自1989年起，我系就开设了《基因工程实验》课程，该实验课程的主要授课内容围绕着“重组质粒在大肠杆菌中的克隆与鉴定”而展开，包括：①PCR扩增分离目的DNA片段；②载体质粒的抽提、纯化及检测；③载体及目的DNA片段的限制性核酸内切酶酶切与连接；④重组质粒转化大肠杆菌；⑤重组子的筛选、重组质粒的抽提与鉴定。
上述实验内容基本体现和反映了当时学科发展的水平，在国内高校相应的课程教学中处于领先水平，并因此在1992年获得的省级教学成果二等奖。
二十多年来，基因工程实验技术和其它各种相应技术取得了飞速发展，目前已发展产生了一套较完整的现代分子生物学实验技术体系。
随着生命科学的发展，分子生物学实验技术已应用到生物科学研究的各个领域，为了在授课内容中体现本学科的发展水平，建立先进完整的能培养高素质人才的课程体系，我们在原有实验课程基础上进行了新的摸索和建设，重新编写成本分子生物学实验教材，使本课程能够跟踪本科一流教学发展，适度先行一步，为培养高质量的人才和精品课程建设服务。
由于分子生物学实验技术体系庞大，又处于飞速发展时期，新技术和新方法不断涌现，在有限的学时内，我们只能介绍一些最为基本内容，希望学生通过本课程的学习，得到分子生物学实验的最基本的技术训练，为今后从事相应的工作打下基础。
本实验设计主要参考书为Jodeph Sambrook，David W. Russill编著的《Molecular clong》第三版，F. 奥斯伯等编著的《精编分子生物学实验指南》，卢圣栋等编著的《现代分子生物学实验技术》，刘进元等编著的《分子生物学实验指导》，魏群等编著的《分子生物学实验指导》，郝福英等编著的《分子生物学实验技术》等。
本实验以综合性实验为主要教学内容，将多个实验设计成一个彼此连贯、前后呼应的系列实验。
实验的主要内容是将质粒pEGFP－N1的绿色荧光蛋白基因EGFP亚克隆到质粒pUC18中进行克隆和表达，由此将分子生物学的一些最基本的实验技术包含在整个实验过程中，使同学们经过本课程的训练能掌握分子生物学实验的基本技能。
分子生物学实验讲义(2020版-)
《分子生物学》实验讲义实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍实验二质粒DNA分离纯化实验三琼脂糖凝胶电泳实验四聚合酶链反应(PCR)检测质粒DNA实验五限制酶切鉴定质粒DNA实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍一、实验目的了解分子生物学实验特点，了解分子生物学实验室常用设备及基本实验操作。
二、实验内容1.分子生物学实验知识⑴严格操作规程分子生物学实验一般比较复杂，如所用试剂多、操作步骤多、实验时间长等，因此为保证实验效果，在实验室中一定要有整体观念，严格按照操作规程进行。
⑵耐心细致操作实验中不能急于求成，特别是对于初入门者，应反复操作，积累经验。
⑶习惯微量操作在分子生物学实验中，试剂的用量往往很少，常常细到1ul液体、ug或ng固体，这是平常肉眼很难看到的，所以刚刚接触实验的人往往感到不习惯，总是担心要取的东西能否看到、准不准确，操作的样品会不会丢失，总是想加大反应体积，以为越多越好。
这些观念都是错误的。
只有定时定量加入液体，才能保证实验成功，所以平时应加以练习，逐渐建立微量操作的观念才能解决好问题。
⑷防止实验污染分子生物学实验的对象主要是核酸，不同生物材料的DNA和DNA之间，不同的样品之间，核酸酶等蛋白酶与核酸之间，产物与反应物之间都有可能造成污染，最终导致实验的失败。
故要从所用试剂、仪器设备、耗材及操作人员等方面进行防止污染的操作。
⑸正确处理试剂分子生物学实验中对试剂的要求十分严格，包括试剂的等级、配制、除菌储备等各方面均有严格要求。
⑹注意实验安全分子生物学实验中，操作者常会接触一些对人体有害的试剂，必须实验安全要求进行实验操作，否则会给实验室甚至整个人类带来巨大的危害。
2.分子生物学实验常用仪器介绍⑴微量取液器⑵水纯化装置（离子交换器、超纯水装置）⑶离心机（低速、高速、超速）⑷电泳装置（电泳仪、电泳槽）⑸灭菌设备（高压蒸汽灭菌锅、过滤除菌器）⑹超净工作台⑺PCR仪⑻凝胶成像系统（紫外分析仪、核酸凝胶电泳图谱的记录）⑼温度控制设备（冷冻设备、培养箱、水浴箱、烤箱）⑽其它设备（紫外可见分光光度计、微波炉、凝胶干燥器、真空干燥仪）3.分子生物学基本实验操作⑴基因组DNA的分离与纯化（核酸浓度和纯度测定）⑵真核细胞mRNA的分离与纯化⑶质粒DNA的提取⑷PCR基因扩增实验⑸限制性内切酶酶切实验⑹DNA重组技术⑺DNA转移技术⑻DNA测序：化学法、双脱氧链终止法⑼核酸探针的制备技术：末端标记、PCR法制探针、非放射性探针⑽分子杂交技术：Southern印迹、Northern印迹和Western印迹4.微量移液器的使用可调节微量移液器标准操作程序（适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液）：⑴调节数字至所需体积；⑵装上吸嘴（不同规格的移液器用不同的吸头），注意气密性）；⑶按到第一档，垂直进入液面几毫米；⑷缓慢松开控制按钮（否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸入移液器内部吸入体积减少）；⑸停顿1s后将吸嘴提离开液面；⑹平稳按压打出液体。
分子生物学全套课件(2024)
2024/1/26
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蛋白质在细胞中的作用
蛋白质可以作为酶催化生物体内 的化学反应，维持生命活动的正 常进行。
蛋白质可以作为载体运输物质， 如血红蛋白运输氧气和二氧化碳 。
蛋白质可以作为抗体参与免疫反 应，保护机体免受病原体的侵害 。
蛋白质是细胞结构和功能的基础 ，参与细胞的各种生命活动，如 催化、运输、免疫、调节等。
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基因表达调控的分子机制
DNA结合蛋白的作用
识别并结合特定DNA序列，影响基因转录。
染色质结构与基因表达
染色质结构的变化可影响基因的可及性和转 录活性。
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信号转导与基因表达调控
细胞外信号通过信号转导途径影响基因表达 。
转录后调控机制
包括mRNA剪接、转运、定位和降解等过程 对基因表达的调控。
比较基因组学分析
通过比较不同物种或不同个体之间的基因组差异，揭示物种进化、基 因功能等生物学问题。
生物信息学在基因组学中的应用
利用生物信息学方法对基因组数据进行挖掘和分析，发现新的基因、 突变位点以及与疾病相关的遗传变异等。
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THANK YOU
感谢观看
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DNA的复制与修复
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02
03
DNA复制的过程
起始、延伸和终止三个阶 段，涉及多种蛋白质和酶 的参与。
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DNA复制的特点
半保留复制、半不连续复 制等。
DNA修复的机制
直接修复、切除修复、重 组修复和SOS修复等，用 于纠正复制过程中产生的 错误。
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DNA的转录与表达
分子生物学 讲义(2011-2012-2)
实验课程教学讲义单位生命科学与技术学院2011-2012 学年度第 2学期专业生物技术班级 2009级3/4/5/6班考试科目分子生物学实验任课老师姜立春制定（修改）日期2012 年2月20日分子生物学实验室使用规则1. 进入实验室的实验人员，必须听从任课教师的安排，班级干部负责和督促安全和卫生工作，每个学生要严格遵守。
2. 必须严格执行仪器设备运行记录制度，记录仪器运行状况、使用时间及使用人员等。
发现仪器有故障者，有义务立即向认可老师、管理员或实验室主任报告，严禁擅自处理、拆卸、调整仪器主要部件，凡自行拆卸者一经发现将给予严重处罚。
仪器用后切断电源，各种按钮回到原位，并做好清洁工作。
3. 实验室公用物品用完之后按原样放回，不得擅自借出或带出到其它实验室。
在确实需要的情况下，应向实验室管理人员提出请求。
4. 使用易燃易爆气体时，盛装气体的气瓶应与实验室相应设施隔离。
使用电炉、酒精灯等要远离化学易燃物品。
5. 所有实验室存储的样品、试剂必须如实写好标签，如样品应有样品名称、存放时间、存放人。
配制的试剂应有试剂名称、浓度、配制时间和配制人等。
6 所有在实验室冰箱或冰柜里存放的物品用完后需及时处理。
实验室管理人员将定期清理无标识和过期的样品。
7. 实验室使用有毒物质或进行能产生有危害气体的实验，应在不燃结构的通风橱内进行。
8. 实验过程所产生的感染性培养物、菌株及相关生物制品及其它具感染性实验室废弃物，应视为医疗垃圾进行相应的特定处理。
9. 带有放射性的废弃物必须放入指定的具有明显标志的容器内封闭保存，报有关部门统一处理。
10. 实验室内禁止吸烟、用餐，保证通风洁净，闲杂人员不得入内。
11. 实验工作完毕后，做好整理工作，关闭电源、水源、气源和门窗。
12. 实验室人员应保证消防通道畅通，消防设施齐全。
如发生意外事故，应立即采取必要措施，并及时报告实验室负责人、值班人员和报警。
仪器使用注意事项分子生物学操作中会涉及一系列仪器，使用不当导致实验失败、减少仪器使用寿命或损坏仪器。
分子生物学实验教案大纲目录
分子生物学实验教案大纲目录实验名称：分子生物学实验大纲：I.实验目的II.实验原理III.实验材料和仪器IV.实验步骤V.结果与讨论VI.实验总结目录：I.实验目的A.理解分子生物学的基本原理B.学习基本的实验技术和操作方法C.掌握基本的数据分析和结果解读方法II.实验原理A.DNA的提取和纯化方法B.聚合酶链式反应（PCR）的原理和步骤C.凝胶电泳检测和分析DNA片段D.基因克隆和重组DNA的技术和方法III.实验材料和仪器A.实验材料1.细菌培养基和培养物2.DNA提取试剂盒3.PCR试剂盒4.凝胶电泳试剂和缓冲液5.DNA标尺B.实验仪器1.离心机2.恒温水浴3.PCR仪4.凝胶电泳装置5.UV透射仪IV.实验步骤A.DNA提取和纯化1.细胞样本的处理和预处理2.DNA提取试剂盒的使用方法和步骤B.聚合酶链式反应（PCR）1.反应体系的准备和优化2.PCR反应程序和条件的设置3.PCR反应产物的凝胶电泳分析C.凝胶电泳分析和数据解读1.凝胶制备和加载样品2.凝胶电泳条件和运行3.结果的观察和解读D.基因克隆和重组DNA1.DNA片段的放大和纯化2. Vector DNA的选择和预处理3. DNA片段与Vector DNA的连接和转化4.转化物的筛选和确认V.结果与讨论A.实验结果的展示和解释B.实验数据的分析和讨论C.实验中的出现的问题和改进方法的探讨VI.实验总结A.实验结果的总结和归纳B.实验中的技术要点和注意事项总结C.对实验结果和数据的评价和建议A.分子生物学实验相关的教材和参考书目。
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(5) 加样：上层胶凝后，拆掉制胶装置，取下蓝色胶条，再安 装好制胶装置。添加电极缓冲液，不漏时置于电极架上，小心 取出样品梳；可加样。用微量进样器加样，注意添加Marker。 （6）电泳：加样完毕，往槽中加电极缓冲液，淹没电极架下 缘。盖好槽盖，插好电极，冰浴中开始电泳。 （7）染色：电泳毕，小心将剥下的胶片置于培养皿内，倒入 染色液，约染40分钟。 （8）脱色：将染色液倒入回收瓶中，于培养皿内注入脱色液， 1-2小时更换1次新液，直至底色脱净为止。注意回收脱色液 （活性炭吸附后可重复使用）。 （9）照相及扫描。
(pH6.8)
样品制备： （1）诱导后，取500ul菌液，8000 rpm，2min。 （2）弃上清，用800ul PBS 重悬，8000 rpm,2 min。
弃上清。同样步骤再洗一次。 （3）然后加15ul的PBS和15ul的上样buffer。 （4）沸水浴煮沸10min，12000 rpm,离心10 min。 （5）取上清液10ul进行电泳。
溶解后用浓HCl（12N）粗调pH，用1NHCl精调pH，定容至200ml。4C贮存。 （6）10%AP：1g AP溶于9mlD.D.W.,现配为好。 （7）TEMED：冰箱保存。 （8）样品缓冲液：1.0ml 0.5MTris-HCl (pH6.8)；0.8ml 甘油；1.6ml 10%SDS；
0.4ml 2-巯基乙醇；4.0mlD.D.W. ；混匀后，4C备用。 （9）无水乙醇 （10）脱色剂：500ml 无水乙醇；160ml 醋酸，定容至2000ml，室温备用. （11）染色液：
D.D.W.
Acr/Bis储存 1.5MTris- 10%SDS
液
HCl (pH8.8)
10%AP
TEMED
1.6ml 2.0ml 1.3ml 50l
50l 4l
混匀后灌胶，上铺一层无水乙醇，分层后倒出乙醇，吸干 依次加入下列试剂配制5%的上层胶（2ml）：
1.4ml 0.33ml 0.25ml 20l 20l 4l
不同浓度的聚丙烯酰胺适用于不同范围的蛋白质分子量大小的测定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以人工合成的聚丙烯酰胺凝胶作为支持剂的一 种电泳方法。聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺简称Acr(Acrylamide)和甲叉双丙烯 酰胺简称Bis在催化剂作用下聚合而成。TEMED称为四甲基乙二胺作为催化 剂，AP过硫酸铵作为活化剂。AP活化TEMED，活化的TEMED催化丙烯酰胺结 合成长链，并由甲叉双丙烯酰胺的横链连接起来，形成立体的网状结构， 因此甲叉双丙烯酰胺是一种引入横链的交联剂。这样一定比例的丙烯酰胺 (简称Acr)和甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在AP和TEMED催化下就能够形成一种 具有多孔、多分枝而又相互连接的聚丙烯酰胺凝胶。
紫外分光光度法测定核酸含量和纯度鉴定 限制性内切酶酶切质粒DNA 凝胶电泳回收和纯化DNA片段 细菌感受态的制备 质粒DNA的转化 目的基因的PCR扩增与检测 原核蛋白质SDS-PAGE电泳 考试
1.实验目的： 利用SDS-PAGE电泳检测表达蛋白，确定蛋白质的分子量。并掌握
其原理与方法。 2.实验原理：
300ml 脱色液；0.6g考马斯亮兰R250；溶解，过滤，棕色瓶室温贮存。
目前常采用的不连续系统的主要特点在于1. 使用两种不同浓度的凝胶系 统；2.两种凝胶基质中与电泳槽中使用的缓冲溶液成分和pH值是不相同
的。板状电泳中，电泳凝胶分为两层；上层胶为低浓度的大孔胶，称为 浓缩胶或成层胶，此胶的缓冲液是Tris-HCI,pH6.8;下层胶则为高浓度的 小孔胶，称为分离胶或电泳胶，此胶的缓冲液是Tris-HCI,pH8.8;电极缓 冲液则是Tris-HCI,甘氨酸,pH8.3。
聚丙烯酰胺胶液灌入玻璃管中，凝固后垂直电泳称为管状电泳，灌 入两块玻璃板之间的狭缝中，凝固后垂直电泳称为板状电泳。聚丙烯酰胺 凝胶电泳系统，可以仅有一种浓度的凝胶，一种pH值和一种缓冲液组成， 称为连续系统；也可以有两种以上不同浓度的凝胶、pH值及缓冲液组成， 称为不连续系统。
3.材料与仪器 诱导的细菌裂解液，制胶夹，电极架，移液器
4.试剂与配制 配制储存液：（1）30%凝胶贮液（W/V）： 29.2g Acr（丙烯酰胺）；0.8g Bis（甲叉双丙 烯 酰胺） 用D.D.W.溶解，定容至100毫升。过滤，4C，棕色瓶避光保存有效期为30天。
（2）10%SDS: 10gSDS溶于100mlD.D.W.,过滤，室温备用。 （3）电极缓冲液（pH8.3）：3.0g Tris(三羟甲基氨基甲烷)；14.4g 甘氨酸；1g SDS，
用D.D.W.溶解后定容至1000毫升。室温贮存。 （4）1.5MTris-HCl 缓冲液(pH8.8)：36.342g Tris；120.ml D.D.W
溶解后用浓HCl粗调pH,而后用1NHCl精调pH至8.8,定容至200毫升。4C贮存。 （5）0.5MTris-HCl缓冲液（pH6.8）: 12.114g Tris；150ml D.D.W.
天然蛋白质在电场中泳动的迁移率主要取决于所带电荷的多少、 分子量的大小以及分子形状等因素。1967年Shapiro等人发现，在有阴 离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate -SDS)存在时，蛋 白质的迁移率主要取决于它的分子量大小，而与其所带电荷的多少以 及形态无关。
分子生物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ实验
实验十二 原核蛋白质SDS-PAGE电泳技术
第3周
第4周 第5周 第7周 第8周 第9周 第10周 第11周 第12周 第13周 第14周 第15周 第17周
分子生物学实验仪器设备简介和实验有关内容介绍
从植物组织提取DNA 从动物组织提取DNA 原核细胞质粒DNA的提取 核酸的琼脂糖凝胶电泳
非连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中存在有三种物理效应：（1）样 品的浓缩效应，（2）分子筛效应，（3）电荷效应，由于这三种物理效 应，使样品分离效果好，分辨率高。
5. 操作步骤: （1）用无水乙醇把电泳槽、玻璃板等一 系列用品擦洗干净。 （2）安装好制胶装置。
依次加入下列试剂配制12%的下层胶（5ml）：