最新分子生物学实验指导
2024年《分子生物学实验》课程教学大纲
《分子生物学试验》课程教学大纲课程编号： 05030适用专业：生物工程与生物技术试验学时数：36学时试验学分：1教材：主要参考书：《分子生物学试验指导》徐庆华等成栋学院立项教材 2024一、课程说明《分子生物学试验》以介绍分子生物学中的试验方法、试验手段和培育学生试验操作技能为其主要内容。
须要以分子生物学基本理论为基础，其教学目的是为了提高学生在分子生物学技术方面的动手实力，培育学生分析问题和解决问题的实力。
通过试验，要求学生能在原有的相关理论学问基础上较全面和深化理解分子生物学基本原理，驾驭基本的分子生物学试验方法和技巧，初步具备肯定的试验设计实力，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。
本试验课在方法上力求经典，试验内容涉及了质粒DNA的提取及限制性内切酶酶切质粒分析；大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA转化大肠杆菌；应用多聚酶链式反应（PCR）体外基因扩增及产物鉴定；SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量等分子生物学的基本理论。
二、学时安排三、教学内容及教学基本要求试验一碱裂解法小量提取质粒DNA及琼脂糖凝胶电泳检测一、试验特点试验类型：综合试验类别：专业基础安排学时：6 每组人数：2二、试验目的1、驾驭碱裂解法小量提取质粒DNA和试剂盒提取质粒DNA的原理和方法。
2、驾驭琼脂糖凝胶的制备及外源DNA的检测原理。
3、了解质粒DNA的粗略定量方法。
三、试验内容提要1、将单菌落接种于3m1含相应抗生素的LB培育基中，37℃摇菌过夜；2、12,000rpm离心30sec，收集菌体；3、加200u1溶液I(含RNaseA 100ug/ml )，振荡悬浮菌体；4、加200ul新配制的溶液II，颠倒混匀；5、溶液澄清后马上加入预冷的200u1溶液III混匀后冰上放置5~10 min；6、4℃、12,000rpm离心15min，取上清，加0.7倍异丙醇混匀，室温静置5min；7、12,000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀，抽干后溶于适量水或TE，-20℃保存备用。
分子生物学实验教案
机 5m 后关灯，关灯后 10 分钟打开照明灯，即可使用。 11. 电泳系统：
期保存在超低温环境下，就需要一个液氮罐（-196℃）具有经济、省力和较好地保 持细胞生物学特性的优点。 3．培养箱：37℃恒温箱用于细菌的固体培养和细胞培养。
CO2培养箱适用于培养各种细胞，可恒定地提供一定量的CO2（通常 5%），用来维 持培养液的酸度（pH值）。 37℃恒温空气摇床可进行液体细菌的培养。 4. 水浴锅：用于保温。 25-100℃水浴摇床可用于分子杂交试验，各种生物化学酶反应等试验的保温。 25-100℃水浴箱用于常规试验。 5. 烘箱：主用于烘干实验器皿，有些需要温度高些，有些需要温度低些。用于 RNA 方面 的实验用具，需要在 250℃烤箱中烘干，有些塑料用具只能在 42-45℃的烤箱中进行 烘干。 （二）水的净化装置：随着分子生物学的飞速发展，许多实验对水纯度的要求越来越高。 1. 蒸馏水皿：单蒸水常难以满足实验要求。双蒸水、三蒸水配液，许多实验要去离子水。
3
1. 真空加热干燥箱：核酸在硝酸纤维素膜和尼龙膜上固定，用于杂交实验。 2. 电泳凝胶干燥箱：电泳后的凝胶进行脱水干燥的仪器，一般可将凝胶干燥到一些玻
璃纸上，干燥后的凝胶易于保存。 3. 液氮冷冻干燥：适用于活性蛋白质样品的干燥与结晶。 4. 真空泵：许多实验都需要抽真空。如：乙醇沉淀后核酸样品的干燥，电泳凝胶的干
主用于核酸样品琼脂糖凝胶和 PCR 电泳结果的紫外观察和照像。 8. PCR 仪：PTC-200 基因扩增仪
分子生物学实验指导
实验一RT-PCR法钓取小鼠肝脏GAPDH基因一、TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNATRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCOBRL公司推出的产品，其操作方法简捷、方便，lh之内即可完成，所制备的RNA可用于cDNA合成及Northern blot等。
【试剂】TRlZOL试剂氯仿异丙醇75％乙醇（DEPC水配制）无RNase水【操作方法】（1）收获细胞1~5×106；或50-100mg组织，加TRlzol试剂lml匀浆。
（2），移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。
（3）每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温2～3min。
（4）4℃离心，12,000g×15min。
（5）仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。
（6）加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。
（7）4℃离心，12,000g×10min。
（8）弃上清，加75％乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min。
（9）弃上清，真空干燥后，沉淀重悬于50μl无RNase水中。
一70℃保存备用。
二、核酸的定量（1）分光光度法测定核酸浓度。
组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。
例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm 鸟嘌呤：276nM胸腺嘧啶：264.5 nm尿嘧啶259nm。
这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。
在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。
另外，还可以通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值，然后根据其比值来估计核酸的纯度。
DNA样品的比值为1.8，RNA样品的比值为2.0。
分子生物学基本实验操作
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
药学本科分子生物学实验指导
实验项目一：总RNA的提取（必做）一、实验学时：6学时二、实验目的通过本实验学习总RNA的提取和分析方法。
三、实验内容利用匀浆裂解细胞，采用TRilzol试剂盒抽提RNA去除蛋白质和DNA。
四、实验要求学会提取基因组RNA的方法和操作过程提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1％的二乙基焦碳酸盐(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理。
塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用0.1%DEPC处理。
五、实验所需仪器设备与试剂仪器：移液器及吸头，电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪等试剂：TRIzol 试剂、氯仿、异丙醇、75% 乙醇（DEPC H2O 配制）、DEPC H2O六、实验原理TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。
最大特点是可同时分离一个样品的RNA\DNA\蛋白质.TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。
取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；七、实验步骤1. 颈椎脱臼法处死大鼠，打开大鼠腹腔，取出肝脏2. 将肝脏用ddH2O冲洗几遍，去除血液3. 将大鼠肝脏放入研钵，用剪刀剪成绿豆大小的组织块，4．冷冻离心机冷却到4℃（预冷半个小时）。
准备冰盒。
5．戴口罩，戴手套。
6. 每个EP管中，加入100mg左右的组织，加入1mL Trizol 试剂，7. 超声破碎仪破碎细胞8. 剧烈震荡30秒，室温静置10分钟。
9．加入200uL氯仿（三氯甲烷），剧烈震荡30秒，室温静置5分钟。
10. 离心：4℃，13,000rpm，10min。
11．取新EP管。
将上层水相（约600uL）加入新EP管，12. 再加入500uL异丙醇，室温静置10分钟。
13. 离心：4℃，13,000rpm，10min。
14. 去上清夜，加入20-30 uL DEPC水，55℃10min，以完全溶解RNA。
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南1. 引言本指南旨在提供大学生物专业的教师和学生们关于分子生物学实验的具体操作步骤与技巧。
分子生物学是现代生命科学研究中至关重要的一部分，通过实验操作可以加深对分子级别生命现象的理解。
在这个指南中，我们将介绍几个常见的分子生物学实验，并提供详细步骤以及相关注意事项。
2. 实验1：DNA提取2.1 实验原理在本节中，我们将介绍DNA提取实验的基本原理和背景知识。
这包括了DNA 提取方法、材料准备和实验目标等内容。
2.2 实验步骤•样品准备：选择适当来源（如水果、血液等）并根据实验要求进行预处理。
•细胞破碎：使用细胞裂解缓冲液和搅拌器将样品细胞破碎。
•DNA沉淀：添加盐和酒精使DNA沉淀出来，并用无菌水洗涤。
•DNA溶解：使用缓冲液溶解沉淀的DNA。
2.3 注意事项•材料应严格按照实验要求选用，确保实验结果的可重复性。
•使用无菌操作技巧以避免外源性DNA污染。
•注意个人安全，佩戴实验室所需的防护装备。
3. 实验2：PCR扩增反应3.1 实验原理在本节中，我们将介绍PCR（聚合酶链式反应）扩增反应的原理和背景知识。
这包括了PCR技术的基本原理、引物设计和酶选择等内容。
3.2 实验步骤•反应体系准备：根据实验目标计算并配置PCR反应所需的试剂和底物。
•DNA模板制备：提取样品中的DNA，并以适当浓度加入到PCR反应中。
•PCR反应设置：配置好PCR反应管，包括引物、酶和缓冲液等。
•PCR条件设定：根据要扩增的序列特点合理设定温度和时间参数。
3.3 注意事项•注意使用不同样本DNA之间相互污染的可能性，避免交叉污染。
•检查引物设计是否正确并符合预期扩增目标。
4. 实验3：凝胶电泳分析4.1 实验原理在本节中，我们将介绍凝胶电泳分析的原理和背景知识。
这包括了DNA迁移速度、凝胶类型选择和标记物设计等内容。
4.2 实验步骤•凝胶制备：根据实验需要配置适当浓度的琼脂糖凝胶。
高中生物实验指南：分子生物学实验操作手册
高中生物实验指南：分子生物学实验操作手册1. 简介分子生物学是研究生物体内分子结构、组成、功能以及相互作用的科学。
在高中生物学课程中，通过进行一系列分子生物学实验，可以加深对基因、DNA、RNA等内容的理解，并培养学生动手实践和科学探究的能力。
本操作手册将介绍一些适合高中副标准课程的基本分子生物学实验，帮助教师和学生更好地开展这方面的实验教学。
2. 实验一：提取DNA2.1 实验目的了解DNA的结构和提取过程，并掌握提取DNA的基本方法。
2.2 材料与仪器•成熟香蕉或其他植物材料•盐水溶液（含氯化钠）•蛋白酶（如葡萄胺酸酶）•洗涤剂（如洗衣粉）•咖啡滤纸或滤纸漏斗•烧杯•酒精1.将香蕉剥皮后放入砧板上，用刀将香蕉捣碎成泥状。
2.在烧杯中加入适量的盐水溶液，并将捣碎的香蕉放入其中搅拌均匀。
3.加入少量蛋白酶和洗涤剂，再次搅拌均匀，让细胞破裂释放DNA。
4.将混合物过滤到另一个烧杯中，通过滤纸除去大颗粒的残渣。
5.将过滤后的溶液倒入试管中，并缓慢地倾斜试管，在溶液与酒精接触的界面处，会出现白色粘稠物质，即提取到的DNA。
2.4 实验结果及分析实验中提取到的DNA呈现为白色细丝状物质。
通过这个实验可以观察到DNA 在水相和酒精相之间的界面上凝聚堆积。
说明了DNA在酒精中不溶性，从而便于提取。
3. 实验二：PCR扩增3.1 实验目的了解聚合酶链式反应（PCR）的原理和基本步骤，并能够进行PCR扩增实验。
3.2 材料与仪器•PCR试剂盒（含模板DNA、引物、聚合酶等）•热循环仪•PCR试管或反应管1.准备PCR反应体系，按照试剂盒说明书的要求加入模板DNA、引物和聚合酶等。
2.将装有反应溶液的PCR管放入热循环仪中。
3.设置PCR的温度程序，包括变性、退火和延伸阶段。
4.启动热循环仪开始PCR扩增反应。
5.完成PCR后，可以通过凝胶电泳等方法检测扩增产物。
3.4 实验结果及分析通过PCR扩增，可以在较短的时间内大量复制并放大目标基因片段。
现代分子生物学技术及实验技巧
现代分子生物学技术及实验技巧1 自由基技术自由基技术是分子生物学中的一种技术，它能够探测分子物质中的自由基浓度以及自由基的反应，从而深入研究分子物质的性质。
自由基技术采用的是自由基信号分子，通过对其进行观察或者对其进行探测和量化，可以了解分子物质的反应过程和分子物质中自由基的浓度。
2 聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术是一种分子生物学技术，是一种能够进行DNA 复制的技术。
聚合酶链式反应技术可以迅速扩增DNA片段，因此被广泛应用于DNA检验、生物工程、基因工程等领域。
聚合酶链式反应技术的原理是，在适当的酶和DNA单链片段存在的条件下，通过反复进行变性、退火和扩增等步骤，将DNA片段快速扩增至数量足够进行检验。
3 基因编辑技术基因编辑技术是一种通过人工干预改变生物个体基因组序列的技术。
基因编辑技术主要应用于基因治疗、育种、制药等领域，能够快速地对基因组进行编辑，从而改变生物的基因表达及特性。
现如今，基因编辑已经成为研究生命科学、探求生命本质的一项重要技术手段。
4 蛋白结晶技术蛋白结晶技术是一项关键提取遗传工程、药物研发和生物晶体学所需的蛋白质结晶技术，是在分子生物学中应用广泛的一种实验技术。
它可用于发现新药物、解决蛋白质功能、交互和酶学机制等多方面的问题，从而促进分子生物学、药学、生物技术、医药化学等领域的发展。
蛋白结晶技术的发展，对于建立高清晰度的蛋白质立体结构图库至关重要，对于发现生命科学的秘密有重要的作用。
5 特异性溶解曲线PCR技术特异性溶解曲线PCR技术是一种在PCR扩增反应中，通过检测DNA 的特征溶解温度来区分目标DNA和异质DNA的技术。
该技术结合了不需要胶回的扩增、高诊断准确性和高速度等优点，极大地提高了实验效率。
特异性溶解曲线PCR技术的应用使DNA的扩增和监测更加精确、简单和操作高效，可以广泛地应用于生命科学研究、临床试验等领域。
分子生物学实验指导
实验一、动、植物组织总RNA的提取一、材料、试剂和仪器材料：动物组织，一次性塑料手套，200 μl、1000 μl吸头。
试剂：TRIzol总RNA提取试剂，氯仿，异丙醇，0.1％DEPC，75％乙醇（用RNase-free 水配制），RNase-free水。
仪器：烘箱，超低温冰箱，高速冷冻离心机，普通离心机，高压灭菌锅，微量取样器，研钵二、提取操作步骤1、匀浆处理：a、动物组织：以鼠肝脏RNA提取为例。
取新鲜或-70'C冻存组织，大约10-30 mg组织加1m1 TRIquick，用一次性组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。
b、单层培养细胞：直接在培养板中加入TRIquick裂解细胞，每10cm2面积加1ml TRIquick。
用取样器吹打混匀。
c、细胞悬液：离心收集细胞。
每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1 ml TRIquick。
d、血液处理：直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，8，000-10，000 rpm离心1分钟。
彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。
每100-200 μl 血液收集的白细胞沉淀加入1 ml TRIquick。
2、将匀浆样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。
如不连续进行实验，加入TRIquick的匀浆样品可在－70'C下保存1-2个月。
3、可选步骤：4℃12，000 rpm离心5-10分钟，取上清。
如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。
取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4、每使用1ml TRIquick向匀浆样品中加0.2 ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟，使其自然分相。
如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀2分钟代替。
5、4℃12，000 rpm离心10-15分钟。
分子生物学实验指导
北京化工大学分子生物学实验指导实验一 少量质粒DNA的制备一、实验目的（1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。
（2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。
（3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。
二、实验原理质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。
质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。
从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。
根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。
目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。
在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。
质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。
严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。
每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。
松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。
该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。
现代分子生物学实验原理与技术
2.实验方案 1 基因操作实验的主要目的有三个：
①分离目的基因,获取DNA信息； ②分析基因结构； ③分析基因功能,
2 试验流程设计 首先,应确定使用怎样的研究方案； 其次,根据试验规模和研究室情况； 最后,根据研究人员生活规律确定试验时间,
3.实验方法 在设计实验方法时应考虑 ①能否达到实验目的； ②是否符合实验室现状； ③是否符合自己的喜好,
步骤：①胰蛋白酶8g
酵母提取物4g
三角瓶
NaCl 8g
②加双蒸水至800ml,混合均匀,
③高温高压灭菌,室温保存,
2 制作平板
材料：煤气灯或酒精灯
水平台面
1L三角瓶
铝箔纸
直径9cm的培养基
药匙
试剂
琼脂粉
步骤：①胰蛋白酶8g
酵母提取物4g
三角瓶
NaCl 8g
琼脂粉
②铝箔纸封口,混匀,灭菌, ③待冷却至60℃左右,分装至培养皿, ④水平台上凝固, ⑤倒置塑料袋中4℃保存,
烧,将初始培养菌转入大量培养基中,盖上 盖子,再灼烧瓶口,
④37℃震荡过夜, 3 菌落测定
平台期
对数生长期
诱0时
为指数生长期,A 6＞00 1.0 为平台期,A =1.6000为10 个/ml8,
①在煤气灯旁用微量移液器吸 培养液,转至Eppendrof管, ②打开分光光度计,调整波长 至600nm,
注意： 1、若需要加入抗生素,待冷却至60℃ ,分装前加 入, 2、直径9cm的平皿,每皿25ml为宜, 3、尽量缩短平皿开盖时间,分装的培养基很快凝 固,因此操作要快, 4、凝结在盖上的水珠可能至污染,故倒转存放, 5、氨苄青霉素易失活,添加后的平皿应在数 （ZHOU）内使用,
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验I. 实验概述分子生物学是生物学的一个重要分支，主要研究生物分子的结构、功能及其在生命过程中的作用。
在现代生命科学研究中，分子生物学技术的应用越来越广泛，包括基因克隆、基因表达、蛋白质结构、信号转导等多个方面。
本实验将介绍几种基本的分子生物学实验操作，包括DNA的提取、PCR扩增、电泳检测和蛋白质的SDS-PAGE分析，旨在提高学生对分子生物学基础知识和实验技能的掌握。
II. 实验材料及设备1. 细菌培养基、磷酸盐缓冲液、EDTA、裂解液等试剂；2. 离心管、洗涤管、PCR管、电泳槽等设备；3. 离心机、PCR仪、电泳仪等设备。
III. 实验步骤1. DNA的提取(1) 收集细胞收集需要提取DNA的细胞，如细菌、白细胞等。
将细胞转移到1.5mL离心管中。
(2) 细胞裂解加入200μl裂解液，轻轻摇晃离心管，使细胞充分裂解。
离心管可置于65°C水浴中处理10分钟，使DNA完全裂解。
(3) DNA提取加入500μl磷酸盐缓冲液和10μl EDTA，混匀后离心5分钟。
取上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，并轻轻倒置，使DNA在异丙醇界面上结团。
放置室温下10分钟，使用洗涤管将DNA结团转移到另一离心管中。
加入70%乙醇溶液洗涤2-3次，最后去除乙醇，用无菌水溶解DNA。
2. PCR扩增(1) 设计引物、制备PCR反应液按照所需扩增的DNA序列设计引物，制备PCR反应液，包括所需模板DNA、引物、Taq聚合酶、MgCl2等。
(2) PCR条件将PCR反应管放置PCR仪中，经过若干个循环，达到最终PCR产物的扩增。
PCR条件通常应选择对应引物特异性、Tm温度适中，并根据Taq聚合酶的活性和反应体系的最适条件优化所得。
常用的PCR条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，Tm温度退火30s，72℃延伸1min，循环30-35次，最后72℃加延伸10min。
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导分子生物学实验指导动植物检疫专业2012，2分子生物学实验注意事项1．课前要提前预习实验内容，了解实验设计的原理，理清实验顺序，制定实验方案（没有方案或方案不合理者不能进入实验操作）。
2．由于实验内容多，时间短，多数实验需要同时或穿插进行，一定要做好统筹安排。
3．实验课中的所有单项实验都属于一个整体流程。
实验时间安排上没有上下午晚上等严格的作息安排，一切服从实验进度，必须在理论课上课期间完成。
4．实验的每一步都要详细地记录操作内容、时间、步骤、结果等，以备查询！5．对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作（尤其是微量移液器！）。
在操作的过程中发现任何意外的现象都要及时向任课教师汇报。
6．写作实验报告或实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表说明详细，讨论分析透彻。
7．在实验室内不能大声喧哗。
8．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地丢弃！特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。
9．实验结束后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。
10．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。
11．实验时损坏的任何物品都要及时申报。
实验一质粒DNA的提取1．目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。
2．原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。
在pH12.0 12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。
尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。
当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。
3．器材超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。
《分子生物学》实验指导书
《分子生物学》实验指导书实验学时：32学时适用专业：生物科学、生物技术实验目录实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定 (1)实验二聚合酶链式反应扩增DNA片段 (3)实验三大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化 (4)实验四植物基因组DNA提取及电泳 (6)实验五植物基因组RNA提取及电泳 (7)实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定实验项目类型：综合性一、实验目的1. 学习质粒的相关基本知识，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法。
2. 学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。
二、实验原理碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异来实现分离的。
在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。
当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。
三、实验仪器与材料1. 材料：含pSV的E.coli JM109菌株、1.5ml塑料离心管、离心管架、EB、酚、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、吸头等。
2. 溶液或试剂：LB培养基、溶液Ⅰ、溶液II（0.4mol/L NaOH、2%SDS用前等体积混合）、溶液Ⅲ、分离液：酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1、无水乙醇、70%乙醇等。
3. 仪器或其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、恒温振荡摇床、高压蒸汽灭菌锅、涡旋振荡器、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温培养箱、制冰机等。
四、操作步骤质粒DNA的提取步骤：1. 用灭菌的牙签挑取白色单菌落接种于另外已制备好的LB琼脂平板上，保存菌种，并把牙签放入盛3 ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
临床分子生物学检验技术实验指导
临床分子生物学检验技术实验指导简介临床分子生物学检验技术是一种在临床医学中应用的分子生物学技术，通过分析和检测个体的基因组、蛋白质组和代谢产物等分子级别的信息，以帮助诊断和治疗疾病。
本文档将指导您进行一系列临床分子生物学检验技术实验，包括基因扩增、基因测序和蛋白质分析等。
基因扩增实验实验材料•反应体系：DNA模板、引物、dNTPs、酶切酶、Taq聚合酶、缓冲液等•实验仪器：热循环仪、电泳仪等•实验耗材：离心管、PCR管、琼脂糖凝胶、电泳试剂等实验步骤1.准备反应体系：–将PCR管中添加所需的反应体系成分，包括DNA模板、引物、dNTPs、酶切酶、Taq聚合酶和缓冲液等，按照所需体积进行计量。
–将PCR管密封。
2.设置热循环仪参数：–根据扩增反应的需求，设置热循环仪的参数，如退火温度、延伸温度和循环次数等。
3.进行扩增反应：–将PCR管放入热循环仪中，开始扩增反应。
4.等待扩增反应结束：–根据所设定的循环次数，等待扩增反应结束。
5.进行电泳分析：–取出PCR管中的反应体系，加入加载缓冲液，并将其倒入琼脂糖凝胶槽中。
–以合适的电压和时间进行电泳分析。
6.结果分析：–通过电泳图，观察扩增产物带的大小和强度，判断扩增是否成功。
基因测序实验实验材料•反应体系：DNA样本、引物、dNTPs、酶切酶、DNA聚合酶、缓冲液等•实验仪器：测序仪•实验耗材：离心管、测序管等实验步骤1.提取DNA样本：–从待测样本中提取DNA，使用适当的提取试剂盒进行提取。
2.准备反应体系：–将测序反应所需的反应体系成分，包括DNA 样本、引物、dNTPs、酶切酶、DNA聚合酶和缓冲液等，按照所需体积进行计量。
–将反应体系混合均匀。
3.进行测序反应：–将反应体系转移到测序管中，加入测序仪所需的荧光探针。
–将测序管放入测序仪中，开始测序反应。
4.等待测序反应结束：–根据所设定的反应时间，等待测序反应结束。
5.结果分析：–通过测序仪输出的测序图谱，解读每个碱基的荧光信号，得到待测DNA序列。
《分子生物学检验技术》实验指导
《分子生物学检验技术》实验指导【实验目的】1、把握动物组织DNA提取的方法；2、把握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。
【实验原理】获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。
因此，DNA样品质量的好坏将直截了当关系到实验的成败。
较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。
DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。
本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为操纵组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去兴奋该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K 可水解蛋白质，消化DNA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。
260nm处DNA有最大吸取峰，测DNA的A260，可运算其浓度。
而蛋白质在280nm处有最大吸取峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。
【实验器材和试剂】1、动物小白鼠2、设备移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。
3、试剂（1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K（7）生理盐水，4℃贮存（8）无水乙醇、70%乙醇【操作步骤】1、制备肝匀浆迅速处死小白鼠，称取新奇肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 μl Buffer CL。
最新分子生物学实验教学教案
基因表达载体构建
载体选择
根据实验需求和目的基因的特性选择合适的载体，如 质粒、噬菌体、病毒等。
载体构建
对载体进行改造，如添加启动子、终止子、选择标记 等，以便于目的基因的表达和筛选。
目的基因与载体连接
将目的基因与表达载体进行连接，形成重组DNA分子 。
重组蛋白表达与纯化
重组蛋白表达
将重组DNA分子导入受体细胞，如细菌、酵母或哺乳动物细胞等，通过细胞培养使目的基因得以表达 。
通过去除蛋白质、DNA和其他杂质，获得高质量 的RNA。
3
RNA定量
使用分光光度计或荧光定量仪测定RNA浓度和纯 度。
蛋白质提取与纯化
细胞裂解
使用化学或物理方法破坏细胞膜，释放蛋白质 。
蛋白质纯化
通过去除其他细胞成分，如核酸、多糖等，获 得纯净的蛋白质。
蛋白质定量
使用Bradford法、Lowry法等方法测定蛋白质浓度。
核酸电泳分析
核酸样品准备
将DNA或RNA样品与载样缓冲液混合 ，加热变性后进行电泳。
电泳条件选择
核酸条带检测
使用荧光染料或放射性同位素标记的 探针与核酸条带结合，通过荧光扫描 仪或放射自显影仪检测条带位置和强 度。
根据核酸分子大小和电荷选择合适的 电泳条件，如电压、电流和电泳时间 等。
CHAPTER 03
重组蛋白纯化
对表达的重组蛋白进行分离和纯化，常用的方法包括层析、电泳、亲和层析等。纯化的目的是去除杂 质，获得高纯度的重组蛋白。
案例分析：绿色荧光蛋白的表达与纯化
绿色荧光蛋白（GFP）是一种常用的报告基因，其发光特性使得它成为研究基因表达和蛋白质定位的 有力工具。
在本案例中，我们将详细介绍如何构建GFP表达载体，将其导入受体细胞进行表达，并对表达的GFP 进行纯化和分析。通过本案例的学习，学生可以掌握基因克隆与表达实验的基本技能和方法。
分子生物学实验教学教案
分子生物学实验教学教案一、实验原理及目的1. 实验原理：介绍PCR（聚合酶链反应）的原理及应用。
解释DNA提取、扩增和测序的基本步骤。
说明基因克隆、表达和纯化的过程。
2. 实验目的：让学生掌握PCR技术的操作步骤和技巧。
培养学生对DNA提取、扩增和测序的基本能力。
培养学生进行基因克隆、表达和纯化的实验技能。
二、实验材料及试剂1. 实验材料：学生分组，每组一份实验材料套装，包括DNA模板、引物、酶、dNTPs等。
2. 实验试剂：PCR反应混合物（含PCR缓冲液、酶、引物、dNTPs）DNA提取试剂盒琼脂糖凝胶核酸染料电泳缓冲液转移缓冲液洗涤缓冲液三、实验步骤及注意事项1. 实验步骤：按照实验材料及试剂的准备要求，准备实验所需的材料和试剂。
按照实验原理，进行PCR反应、DNA提取、扩增和测序等实验操作。
观察并记录实验结果，进行数据分析和解释。
2. 注意事项：实验操作过程中要严格遵守实验室安全规定，佩戴好个人防护装备。
在进行PCR反应时，要准确控制温度和时间，避免非特异性扩增。
在操作DNA时，要避免核酸的降解和污染。
四、实验结果与分析1. 实验结果：观察PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳结果，记录DNA条带的大小和亮度。
分析DNA提取、扩增和测序的结果，确定目标基因的存在和序列。
2. 结果分析：根据实验结果，分析实验操作的准确性和可行性。
比较不同实验条件下的结果，探讨实验条件的优化方法。
结合理论知识，解释实验结果的生物学意义。
1. 实验报告内容：实验目的、原理和步骤的概述。
实验材料和试剂的使用情况。
实验结果的描述和数据记录。
实验结果分析的结论和讨论。
报告要条理清晰，语言简练，数据准确。
结果图要清晰，图例说明详细。
报告要包括实验操作中的问题和解决方法。
报告要结合实验结果，提出实验现象的解释和相关问题的讨论。
六、实验技能与技巧训练1. 实验技能：培训学生进行PCR反应的技巧，包括DNA模板的制备、引物的设计、反应混合物的配置等。
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分子生物学实验指导分子生物学实验指导（补充讲义）南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心二OO九年十二月目录实验总RNA的提取、定量与RT-PCR………………………………………………1实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7)实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13)附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19)附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19)实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR一、总RNA的提取与定量目的：从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。
原理：在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。
rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。
mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。
利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。
RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。
目前常用的是Trizol法。
Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。
TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。
异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。
酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。
取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。
对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。
分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。
在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseⅠ处理RNA样品，避免出现假阳性。
共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。
蛋白质可用于western blotting。
核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，单链DNA和RNA浓度为40μg/ml，单链寡核苷酸的含量为33μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。
纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。
若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。
270nm存在高吸收表明有酚的干扰。
紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。
仪器和主要试剂：1. 紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管2. Trizol试剂3. 氯仿4. 异丙醇5. 75℅乙醇6. 无RNase的水或0.5℅SDS (溶液均需用DEPC处理过的水配制)实验方法：[本次实验采用TaKaRa 公司的RNAiso Plus试剂]（一）RNA提取1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml Trizol，用匀浆仪进行匀浆处理。
样品体积不应超过Trizol体积10℅。
b.单层培养细胞直接在培养板中加入Trizol裂解细胞，每10cm2面积加1ml，用移液器吸打几次。
Trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。
Trizol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml Trizol，反复吸打。
加Trizol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。
一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。
(注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与Trizol的比例，细胞的数量不能过多。
)2. 将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。
3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8 ℃10000×g离心10 min，取上清。
离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。
取澄清的匀浆液进行下一步操作。
4. 每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3 min。
(注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。
)5. 2-8℃10000×g离心15 min。
样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。
RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60℅。
6. 把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。
每使用1ml Trizol加入0.5ml异丙醇，室温放置10 min。
7. 2-8℃10000g离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
移去上清。
8. 用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。
每使用1ml Trizol至少加1ml 75℅乙醇。
2-8℃不超过7500g离心5 min，弃上清。
9. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10min。
加入25-200μl无RNase的水，-70℃保存。
（二）紫外吸收检测RNA的浓度和纯度2 1. 紫外分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。
2. 取RNA样品2μl，用水稀释50倍，转入分光光度计的石英比色杯中。
3. 在260nm和280nm分别读出样品OD值。
根据260nm时1 OD单位的单链RNA = 40μg/ml和稀释倍数，可以计算出样品RNA的浓度和产量。
4. 若OD260/OD280小于2，说明可能有DNA片段污染，可以考虑用无RNase的DNase处理样品，若小于1.8，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化RNA。
注意事项：1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA是可加入少许糖原以促进RNA沉淀。
例如加1ml Trizol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。
糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。
2. 匀浆后加氯仿之前样品可在-60～-70℃保存至少一个月。
RNA沉淀可保存在75%酒精中2-8℃一个星期以上或-5--20℃一年以上。
3. 预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10 μg，肾3-4 μg，骨骼肌和脑组织1-1.5 μg，胎盘1-4 μg，上皮细胞8-15 μg，成纤维细胞5-7 μg。
4. 蛋白聚糖和多糖污染:沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1ml Trizol 在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8mol/L柠檬酸钠和1.2mol/L NaCl)混合离心，按之前操作进行。
这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。
从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。
5. 预防RNase污染措施：经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。
使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。
RNA在Trizol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。
玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5mol/L NaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。
配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01℅v/v，放置过夜，高压灭菌。
注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。
RNA的提取常见问题分析二、逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)原理：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
(一) 反转录酶的选择1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA 酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScript Ⅱ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
(二) 合成cDNA引物的选择1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。