分子生物学常用实验指南

生命科学系

2011-2012学年度分子生物学实验

（0801班）

2011-2012学年度分子生物学实验指导

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3)

实验二质粒DNA的转化 (4)

实验三质粒DNA的提取 (5)

实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7)

实验五PCR基因扩增 (9)

实验六DNA重组 (10)

实验七蓝白斑筛选实验 (11)

实验八DNA酶切技术 (13)

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备

一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术

二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。

我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。

三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪

四、材料与试剂：

1.大肠杆菌top10菌株

2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL

3..LB液体及固体培养基

4.50%甘油500mL（灭菌）

五、实验操作步骤：

1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中，

37℃振荡（200r/min）培养过夜。

2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600

应在0.4～0.5之间)

3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷）

4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离

心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。

5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保

温30min。

6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100µL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、

100µL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。

实验二质粒DNA的转化

一、实验目的：掌握质粒DNA的转化技术

二、实验原理: DNA能够黏附于感受态细胞的表面，经过42℃短时间的热激处理

可以促进DNA的吸收。转化菌在非选择培养基中保温一段时间后，质粒DNA所携带的抗性基因（Amp r）得到表达，然后再在选择培养基上培养，使转化的菌株得以正常生长。

三、仪器：1.超净工作台 2. 恒温摇床 3.恒温水浴

四、1.材料与试剂：LB培养基（液体、固体平板）

2.感受态

3.无菌水

五、实验操作步骤：

1.200µL新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2µL（约5～50ng）混匀，冰上放置30min。

同时做一对照试验：200µL感受态+2µL无菌水，其他操作同上述实验完全一样。

2.将上述管放到42℃水浴中，精确计时90秒。

3.冰浴2min。

4.复苏：管中加入LB液体培养基800µL，37℃培养1h（50r/min）

5.涂平板：取200µL复苏细胞，涂布于含AMP的LB培养基上。待大约30min，让菌

液被培养基吸收。

6.菌落培养：倒置平皿，37℃培养12～16h，转化子即可长成菌落。照相。

实验三质粒DNA的提取

一、实验目的：掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法

二、实验原理

碱裂解法提取质粒利用的是环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低至中性后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

三、仪器、材料与试剂

(一)仪器

1．恒温培养箱2．恒温摇床3．小型高速离心机4．漩涡混合器

(二)材料与试剂

材料：带有pGEM-T质粒的大肠杆菌

试剂：1. Solution I [50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl（PH8.0）,10mmol/L EDTA(PH8.0)]

2.. Solution II（0.4mol/L NaOH+2%SDS用前等体积汇合）

3. Solution III (5mol/L乙酸钾60mL,冰乙酸11.5 mL,DH2O28.5mL)

4. TE缓冲液 (PH8.0)[10mmol/L Tris.HCl(PH8.0),1 mmol/L EDTA(PH8.0)]

5. 0.5mo1／L (EDTA)

6. 氯仿：异戊醇（24：1）

7. Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24:1体积比）

8. RTE (含20µg/mLRNA酶A的TE缓冲液)

四、实验步骤

1. 将3mL含Amp的LB液体培养基加入到试管中，接入含pGEM-T质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜；

2.将菌液加入1.5mL离心管中，4000r/min,5min,弃上清；重复一次，增加菌的收集量；

3.在离心管中加入100µL溶液I,涡旋混匀，室温放置10min；

4.加入200µL溶液II，轻轻混匀（颠倒5～10次），待逐渐变清亮后，冰浴2min（操作要轻柔，裂解时间不要超过5min）；

5.加入150µL溶液III（冰上预冷的）加盖，轻轻颠倒混匀数次。在冰上静置15min 让质粒DNA复性；