安徽工业大学分子生物学实验讲义 实验一
分子生物学实验讲义
分子生物学实验讲义适用专业：生物工程、生物技术课程类别：生物工程专业课、生物技术专业主干课课程性质：必修课实验类别：专业实验考核方式及成绩评定：实验成绩占20％（实验报告8％＋实验操作10％，＋出勤2％）一、学时与学分1.课程总学时：642.课程总学分：43.实验学时：164.实验学分：实验一大肠杆菌感受态细胞的制备一、实验目的：掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法二、实验原理细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA 酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物,将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Ampr等)得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基(含有氨苄青霉素)上。
二、仪器、材料与试剂(一)仪器：1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．-70℃冰箱5．恒温水浴器(二)材料：1．吸头、枪试管、培养皿2．大肠杆菌DH5a3．1.5mL 离心管(三)试剂：1． LB液体培养基：配制每升培养基，应在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(bacto-tryptone) 10g酵母提取物(bacto—yeast extract) 5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7．0，加入去离子水至总体积为1L，固体培养基加入琼脂6g/L,121℃湿热灭菌20min。
2．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置-20℃冰箱保存。
3. 0.1M CaCl2：100ml 0.1M CaCl2配法：CaCl2.2 H2O 1.47g，水定容100ml，高压灭菌四、实验步骤1) 挑取在LB固体培养基上生长的受体菌DH5a单菌落，接种于5 ml LB液体培养基中，37℃摇过夜；2) 取10ul培养液加入100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，按1%接种量转接到100 ml LB液体培养基中，于37℃，300 rpm摇约3小时，可通过测量OD600值（0.4-0.6之间）来检测培养物生长状况；3) 在无菌条件下，将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的2 ml离心管中，冰上放置30 min；4) 4℃，5000 rpm，离心10 min，倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽，回收菌体细胞（重复3－4步）；5) 无菌条件下，用1 ml冰预冷的0.1MCaCl2溶液重悬沉淀，立即放在冰上30 min；6）4℃ 6000 r/min,离心10 min，回收细胞7）每只冰预冷1.5ml离心管加70ul重悬物、30ul 75％甘油分装，（务必放在冰上），置-70℃保存备用五、实验结果每人制备至少制备2管感受态细胞六、思考题制备感受态细胞应注意什么？实验二碱裂解法小量提取质粒DNA一、实验目的：通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒二、实验原理：碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们，E.Coli染色体约4700Kb，SDS是一种阴离子表面活性剂，它和NaOH共同作用既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性， SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来，基因组DNA断裂为线性双链片段，而质粒DNA仍为超螺旋，释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性，基因组DNA全部完全变性，而质粒DNA只有部分变性，然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA为小分子，两条互补链复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等通过离心一起沉淀下来而被除去。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告分子生物学实验报告引言分子生物学是一门研究生物大分子结构、功能和相互作用的学科，通过实验手段揭示生命现象的分子机理。
本实验旨在探究DNA复制过程中的关键步骤，以及RNA转录和蛋白质翻译的基本原理。
实验一：DNA复制DNA复制是细胞分裂过程中必不可少的步骤，它保证了遗传信息的传递和维持。
本实验通过模拟DNA复制过程，研究DNA复制酶的作用和复制的准确性。
材料：- DNA模板- DNA聚合酶- 引物- dNTPs- 缓冲液方法：1. 准备反应体系，包括DNA模板、DNA聚合酶、引物、dNTPs和缓冲液。
2. 在适当的温度下，将反应体系放入PCR仪中进行反应。
3. 取样并进行凝胶电泳分析，观察DNA复制产物。
结果：通过凝胶电泳分析，我们观察到DNA复制产物的出现。
这表明DNA聚合酶能够在模板DNA上合成新的DNA链，并且复制的过程较为准确。
讨论：DNA复制的准确性是生命传递遗传信息的基础。
DNA聚合酶具有校正功能，能够识别和修复错误的碱基配对。
这种精确性保证了基因组的稳定性和可靠性。
实验二：RNA转录RNA转录是将DNA信息转录成RNA的过程，它是基因表达的第一步。
本实验旨在研究RNA转录的机制和调控。
材料：- DNA模板- RNA聚合酶- 引物- NTPs- 缓冲液方法：1. 准备反应体系，包括DNA模板、RNA聚合酶、引物、NTPs和缓冲液。
2. 在适当的温度下，将反应体系放入PCR仪中进行反应。
3. 取样并进行凝胶电泳分析，观察转录产物。
结果：凝胶电泳分析显示出RNA转录产物的出现。
这表明RNA聚合酶能够在DNA模板上合成RNA链。
讨论：RNA转录是基因表达的第一步，它决定了细胞内特定基因的表达水平。
RNA聚合酶通过与DNA模板的互作用，选择性地合成特定的RNA链。
这种选择性转录是基因调控的关键。
实验三：蛋白质翻译蛋白质翻译是将RNA信息翻译成蛋白质的过程，它是生物体内蛋白质合成的关键步骤。
分子生物学实验讲义
实验一植物基因组DNA的分离一、相关知识分离植物DNA是分子生物学实验的一个基本要求。
不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。
例如，在构建用于筛选植物基因或其他诸如RFLP这样的遗传标记基因组DNA文库时，需要使用高相对分子质量、高纯度的DNA；而在进行遗传分析时，对DNA的纯度要求就可以低一些。
一般而言，一个好的DNA分离程序应符合以下三个主要标准：（1）所得DNA的纯度应满足下游操作的要求，用于RFLP分析的DNA，其纯度的要求为可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到膜上进行Southern杂交；用于PCR分析的DNA则不应含干扰PCR反应的污染物；（2）所得DNA应当完整，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型；（3）所得的DNA应有足够的量。
如果对植物进行大规模筛选，还应当满足操作程序应当快速、简便、价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂这样的要求。
二、实验原理植物DNA的提取程序应包括以下几项：首先，必须粉碎（或消化）细胞壁以释放出细胞内溶物。
分离总基因组DNA常用的破壁方法是将植物组织胀水，然后研磨成细粉；或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉沫。
其次，必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中，这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。
去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。
通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子——镁离子。
最后，一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。
剧烈振荡或Tip头小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。
分离高相对分子质量的DNA还只是工作的一部分。
因为在粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。
大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处理过的RNase除去。
但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，往往用一些DNA纯化试剂盒来进一步纯化DNA。
分子生物学实验讲义
实验质粒DNA的碱裂解法提取与纯化一、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA, 大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份, 通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态, 但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上, 随着染色体的复制而复制, 并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子, 重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取, 本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法, 其基本原理为: 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时, 蛋白质与DNA发生变性, 当加入中和液后, 质粒DNA分子能够迅速复性, 呈溶解状态, 离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状, 离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如, 氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法, 但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA, 经过苯酚、氯仿抽提, RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA, 所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求, 故在分子生物学实验室中常用。
二、实验试剂1.溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖, 25mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml, 0.5M EDTA（pH 8.0）10ml, 葡萄糖4.730g, 加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min , 贮存于4℃。
2.溶液Ⅱ: 0.2N NaOH, 1% SDS。
2N NaOH 1ml, 10%SDS 1ml, 加ddH2O至10ml。
分子生物学教案内容-实验
4
教学目的
掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作技术，学会用SSCP技术进行基因分型。
教学重点
聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析基因多态性的原理及操作技术，基因分型
教学难点
聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，基因分型
教具和
媒体使用
黑板教学
教学方法
讲授法、实验操作法
教
学
过
程
讲授新课40分钟
一、实验目的掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作技术，学会用SSCP技术进行基因分型。
30个循环
3. PCR产物检测
实验操作170分钟
总结、分析5分钟
思考题
作业
1．PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？
2．用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？
讲次
6
日期
2013-12-2
2013-12-4
节次
1-3,7节
授课内容
实验六SSCP技术分析基因多态性
二、实验原理聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP）是近年来发展起来的一种基因分析方法。其基本原理为：将PCR扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。
分子生物学实验讲义
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分子生物学实验课件
分子生物学实验课件实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取一、实验目的学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。
二、实验材料、设备及试剂1、实验材料大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp-2、实验设备恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅3、试剂酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素三、实验步骤液体LB（Luria-Bertain）培养基配方：蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml）酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml）氯化钠 1.0% （1 g/100 ml）PH 7.0固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！(1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。
(2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容至100ml。
(3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。
(4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。
(5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培养基。
(6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。
并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。
(7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。
当高压锅温度（气压）指示器指示锅温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。
待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅物品。
(8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。
分子生物学实验报告全解（有图有真相）讲解
分⼦⽣物学实验报告全解（有图有真相）讲解分⼦⽣物学实验报告慕蓝有志班梦想学院⽬录实验⼀细菌的培养 (2)实验⼆质粒DNA的提取 (4)实验三琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (7)实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (9)实验五聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (11)实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (14)实验七RNA分离与纯化 (17)实验⼋RT-PCR扩增⽬的基因cDNA (19)实验九质粒载体和外源DNA的连接反应 (21)实验⼗感受态细胞的制备及转化 (23)实验⼗⼀克隆的筛选和快速鉴定 (25)实验⼗⼆地⾼⾟标记的Southern杂交 (27)实验⼗三阿拉伯糖诱导绿⾊荧光蛋⽩的表达 (31)思考题 (32)分⼦实验⼼得总结 (33)实验⼀细菌的培养⼀、⽬的学习细菌的培养⽅法及培养基的配置。
⼆、原理在基因⼯程实验和分⼦⽣物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因⽂库的建⽴等都离不开细菌。
特别是常⽤的⼤肠杆菌。
⼤肠杆菌是含有长约3000kb的环状染⾊体的棒状细胞。
它能在仅含碳⽔化合物和提供氮、磷和微量元素的⽆机盐的培养基上快速⽣长。
当⼤肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进⼊⼀个滞后期。
然后进⼊对数⽣长期，以20~30min复制⼀代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速⽣长的浓度时，菌体密度就达到⼀个⽐较恒定的值，这⼀时期叫做细菌⽣长的饱和期。
此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。
培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。
实验室中最常⽤的是LB培养基。
三、实验材料、试剂与主要仪器（⼀）实验材料⼤肠杆菌（⼆）试剂1. 胰蛋⽩胨2. 酵母提取物3. 氯化钠4. 1mol/L NaOH5. 琼脂粉6. 抗⽣素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1. 培养⽫2. 带帽试管3. 涂布器4. 灭菌锅5. ⽆菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌⽛签等）6. 恒温摇床四、操作步骤（⼀）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950m1去离⼦⽔中加⼊：细菌培养⽤胰蛋⽩胨10g细菌培养⽤酵母提取物5gNaCl 10g摇动容器直⾄溶质完全溶解，⽤1mol/L NaOH调节pH位⾄7.0。
分子生物学实验教学讲义
实验一人血液基因组DNA的提取1．吸取500μl 红细胞裂解液到一个1.5ml 离心管。
2．将抗凝全血（使用前回复到室温）颠倒混匀后，吸取100μl 加到上述装有红细胞裂解液离心管中，颠倒6-8 次，并倒置轻弹管壁，确保充分混匀。
3．室温放置10 分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。
4．12,000 rpm 离心20 秒，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团和大约10μl 的残留上清。
离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入900μl 红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3，4。
5. 涡旋振荡15 秒重悬白细胞团，充分分散白细胞团。
白细胞的重悬分散对下一步裂解非常重要，白细胞未打散就加入裂解液，会导致白细胞不能充分裂解，形成肉眼可见团块。
6．加入300μl 细胞核裂解液到重悬的白细胞，迅速有力吹打几次混匀以裂解白细胞，由于基因组DNA 立刻释放出来，这个时候混合物会马上变得十分粘稠，立刻停止吹打（以免剪切断基因组DNA），颠倒旋转离心管10 次保证裂解液和所有的白细胞接触并裂解。
这一步对是否获得满意的裂解效果和基因组完整性很关键。
吹打力量如果太小，不足以迅速将细胞团打散并和裂解液混匀，形成肉眼可见团块无法裂解完全（裂解液如果是和细胞团块而不是分散的细胞接触，立刻会和细胞团块表面作用后形成粘稠的屏障，不容易再渗透入团块内部）。
裂解液和细胞接触后基因组DNA立刻释放出来，这个时候吹打力量过大，又易造成基因组断裂。
正确做法，就是迅速有力的吹打几次，几秒钟后基因组释放出来（变粘稠）立刻停止吹打，或者改用大口径枪头（剪去枪头尖）轻柔吹打或者颠倒混匀。
如果还有肉眼可见团块，可在65℃温育30-60 分钟（不要超过一小时）至裂解完全。
7．可选步骤：在裂解物中加入RNase A（10mg/ml）至终浓度100μg/ml，颠倒25 次混匀，37℃温育15 分钟去除残留RNA.然后冷却回室温。
硕士研究生分子生物学实验讲义
硕士研究生分子生物学实验讲义————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期:ﻩ分子生物学实验讲义(硕士研究生试用)山西医科大学基础医学院生物化学与分子生物学实验室2010.6实验一动物组织蛋白质的提取【目的要求】1．掌握动物组织蛋白质的提取方法。
2.了解动物组织蛋白质提取的原理。
【实验原理】由于蛋白质种类很多,性质上的差异很大，即或是同类蛋白质,因选用材料不同,使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。
但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。
因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。
蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。
故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。
温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。
提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用,将细胞内蛋白质提取出来,并与其它不需要的物质分开。
但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液(如血浆、消化液等)中，可以不必经过提取直接进行分离。
蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。
蛋白质经细胞破碎后,用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来,再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。
ﻫ【试剂器材】1．实验小鼠2．0．9%NaCｌ3．动物组织蛋白裂解缓冲液Trｉs 5０mＭＮaCl 15０mＭEＤTA 0.５mMDTT1mMTriｔｏn X－100 1%去氧胆酸钠0.5%SDS０.1%4．ＰMSF/异丙醇储备液10０ｍM（１74mg/１0ml)于-20℃储存5．-2０℃储存的冰块【操作步骤】1.颈椎脱臼处死小鼠,75%酒精擦拭皮肤,剪开腹部,剪切肝脏组织，称取0.6g，置于含预冷0.9%NaＣl(6ｍL）的平皿中。
分子生物学实验1
送测序及生物信息学分析
转化大肠杆菌DH5a 转化大肠杆菌
PCR检测筛选阳性转化子 PCR检测筛选阳性转化子
实验概况
实验时间：12月4日——12月8日 实验分工： 记录：陈倩 操作：米热、陈倩、李明惠、田江、上官俊红 每次实验前讨论，各有分工，实验中协调有序， 互帮互助
提取甘薯总RNA 提取甘薯总
反转录成cDNA第一链 反转录成 第一链 PCR扩增目的基因 扩增目的基因
关键： 关键：按顺序加液，并且每次都加到液面下 过程： 过程：变性——退火——延伸（循环）——电泳 泳 试剂： MiniQ H2O 10×PCR buffer 25mM MgCl2 试剂： 10mM dNTP mix 引物1(10µM) F-ADK 引物2(10µM) R-ADK Taq(2 to 5 units/ul) 模板（cDNA 结果： 结果：见图（无条带） 分析： 分析：点样少、模板浓度低，扩增的量少。
大肠杆菌感受态制备、 大肠杆菌感受态制备、转化
方法： 方法：CaCl2法 关键：是否将沉淀吹打混匀，水浴加热的时间。无 菌操作。 过程：接种——震荡过夜——离心——吹打混匀— —静置——离心——静置（2-7小时）——融化—— DNA与感受态细胞混匀——水浴加热——静置—— 加LB——复苏——离心——涂布——倒置培养—— 挑菌落。 试剂：LB液体培养基 分析： 分析： CaCl2 结果： 结果：见图（数量很少，无菌落重叠）
总RNA
提取甘薯总RNA▲
PCR—ADK
反转录成cDNA第一链
Байду номын сангаас
菌 落
▲大肠杆菌感受态制备
DNA
▲DNA的提取与检测
ADK菌检 菌检
实验小插曲
加氯仿振荡后离心，离心前清液在底层，离心后 未见分层； 摇匀后重新离心，离心后溶液分层，但上清液是 黄绿色； 摇匀后第三次离心，离心后分层成功。 为什么呢？？？ 与我们组有同样情况的第二组和我们都使用的是旋 涡仪振荡，其他小组使用手动摇匀。
分子生物学实验讲义
分子生物学实验讲义掌握质粒DNA小量快速提取法；了解DNA限制性核酸内切酶酶切鉴定原理。
质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子。
其分子量大小在1－200kb 之间。
是具有双链闭合环状结构的DNA分子，质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。
质粒一般独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能却赋予宿主细胞某些表型。
所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodium dodecylsulfate, SDS）可使细胞壁裂解。
细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。
再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。
共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）质粒以超螺旋形式存在。
若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的DNA分子叫作开环DNA（open circular DNA, 简称ocDNA）。
在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。
限制性内切酶是分子生物学研究中的一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度的DNA片段。
如：EcoR?和Hind?的识别序列和切口是：EcoR?：G?AATTCHind?：A?AGCTT限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。
生物化学与分子生物学实验课讲义
实验一SDS碱裂解法小量制备质粒一、实验目的1．掌握SDS碱裂解法小量制备质粒的原理和方法。
2．掌握高速离心机、微量移液器等常规仪器的正确使用。
二、实验原理对培养的含有大量质粒的菌液，离心收集菌体，用含一定浓度葡萄糖的缓冲液悬浮菌体，采用碱性SDS裂解细菌的细胞壁，使质粒缓和释放出来。
同时整个溶液的pH为12-12.5，使断裂成线性细菌染色体DNA变成单链、相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上，当液体的pH 调至中性并有高浓度存在下，大部分蛋白质和细菌染色体形成沉淀，而共价闭环质粒DNA 仍为可溶状态，离心获得含有大量质粒上清液，用RNA酶A处理除去RNA，用苯酚氯仿除去残留蛋白质，再利用核酸不溶于有机溶剂的性质，从而使其在适当浓度的亲水性有机溶剂中（乙醇、异丙醇、PEG8000）沉淀析出。
三、材料、试剂和仪器1．试剂GT116（含psiRNA质粒）菌种LB液体培养基溶液I、溶液II、溶液III、无水乙醇、氯仿、异戊醇、Tris饱和酚、RNA酶A、TE、STE、卡那霉素（配方见附录）2．仪器和材料超净台、高速离心机、微量移液器、灭菌eppendorf管和tips、37℃摇床、旋涡混匀器四、实验操作步骤1．在超净台内从平板上挑取单菌落或用以其它方式保存的菌种接种于3ml LB培养基，在37℃培养15-18个小时。
2．向1 个2ml的离心管里加约1.5ml的菌液。
不要把菌液溅出造成污染。
3．10000 rpm离心2分钟。
注意离心机上放置的管重力要平衡，保护离心机。
4．弃上清液于废液瓶中。
5．重复离心一次，尽量弃去上清。
6．加入100ul冰冷的溶液I，然后剧烈振荡混匀，置冰上。
7．加入200ul溶液II，轻柔混匀，置冰上4分钟。
8．加入150ul冰冷的溶液III，轻柔混匀，置冰上5分钟。
9．12000 rpm离心5分钟。
把上清液转移到另一1.5ml离心管中（约450ul）。
10．加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）混合液，剧烈振荡，12000 rpm离心2分钟，小心的收取上层溶液（约450ul）于另一1.5ml离心管中。
分子生物学实验讲义(2020版-)
《分子生物学》实验讲义实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍实验二质粒DNA分离纯化实验三琼脂糖凝胶电泳实验四聚合酶链反应(PCR)检测质粒DNA实验五限制酶切鉴定质粒DNA实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍一、实验目的了解分子生物学实验特点，了解分子生物学实验室常用设备及基本实验操作。
二、实验内容1.分子生物学实验知识⑴严格操作规程分子生物学实验一般比较复杂，如所用试剂多、操作步骤多、实验时间长等，因此为保证实验效果，在实验室中一定要有整体观念，严格按照操作规程进行。
⑵耐心细致操作实验中不能急于求成，特别是对于初入门者，应反复操作，积累经验。
⑶习惯微量操作在分子生物学实验中，试剂的用量往往很少，常常细到1ul液体、ug或ng固体，这是平常肉眼很难看到的，所以刚刚接触实验的人往往感到不习惯，总是担心要取的东西能否看到、准不准确，操作的样品会不会丢失，总是想加大反应体积，以为越多越好。
这些观念都是错误的。
只有定时定量加入液体，才能保证实验成功，所以平时应加以练习，逐渐建立微量操作的观念才能解决好问题。
⑷防止实验污染分子生物学实验的对象主要是核酸，不同生物材料的DNA和DNA之间，不同的样品之间，核酸酶等蛋白酶与核酸之间，产物与反应物之间都有可能造成污染，最终导致实验的失败。
故要从所用试剂、仪器设备、耗材及操作人员等方面进行防止污染的操作。
⑸正确处理试剂分子生物学实验中对试剂的要求十分严格，包括试剂的等级、配制、除菌储备等各方面均有严格要求。
⑹注意实验安全分子生物学实验中，操作者常会接触一些对人体有害的试剂，必须实验安全要求进行实验操作，否则会给实验室甚至整个人类带来巨大的危害。
2.分子生物学实验常用仪器介绍⑴微量取液器⑵水纯化装置（离子交换器、超纯水装置）⑶离心机（低速、高速、超速）⑷电泳装置（电泳仪、电泳槽）⑸灭菌设备（高压蒸汽灭菌锅、过滤除菌器）⑹超净工作台⑺PCR仪⑻凝胶成像系统（紫外分析仪、核酸凝胶电泳图谱的记录）⑼温度控制设备（冷冻设备、培养箱、水浴箱、烤箱）⑽其它设备（紫外可见分光光度计、微波炉、凝胶干燥器、真空干燥仪）3.分子生物学基本实验操作⑴基因组DNA的分离与纯化（核酸浓度和纯度测定）⑵真核细胞mRNA的分离与纯化⑶质粒DNA的提取⑷PCR基因扩增实验⑸限制性内切酶酶切实验⑹DNA重组技术⑺DNA转移技术⑻DNA测序：化学法、双脱氧链终止法⑼核酸探针的制备技术：末端标记、PCR法制探针、非放射性探针⑽分子杂交技术：Southern印迹、Northern印迹和Western印迹4.微量移液器的使用可调节微量移液器标准操作程序（适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液）：⑴调节数字至所需体积；⑵装上吸嘴（不同规格的移液器用不同的吸头），注意气密性）；⑶按到第一档，垂直进入液面几毫米；⑷缓慢松开控制按钮（否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸入移液器内部吸入体积减少）；⑸停顿1s后将吸嘴提离开液面；⑹平稳按压打出液体。
分子生物学实验讲义
实验一大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化一、实验目的1．了解和掌握大肠杆菌感受态细胞制备的原理和基本操作方法2．了解和掌握质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法二、实验原理用物理或者化学的方法处理细菌细胞，能让细胞处于一种容易吸收外源DNA的状态，即感受态。
制备感受态的方法和多，如CaCl2法、特殊试剂诱导法、原生质体法、电击法等。
转化是将外源DNA分子引入受体细胞的过程，所用的受体细胞一般是不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（Rˉ，Mˉ）。
CaCl2转化法的原理是由于细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA与Ca离子形成羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经热激处理后，菌体细胞膜通透性发生改变，从而吸收DNA复合物。
CaCl2转化法在细菌的转化研究工作中得到了广泛的应用和不断的改进，使不同菌株的转化效率大大提高。
本实验以大肠杆菌DH5a菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温，实现转化。
由于pBS质粒（图1）带有氨苄青霉素抗性基因（Amp r），可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pBS质粒，则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS质粒。
转化子繁殖后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
图1 质粒pBS图谱三、实验材料、仪器设备及试剂1．实验材料大肠杆菌DH5α菌株（菌液中加入50％甘油，冻存－70℃，可供下次使用）、pBS质粒（Amp r）2．仪器设备高压灭菌锅、恒温摇床、超净工作台、分光光度计、冷冻高速离心机、恒温水浴锅、50 mL离心管、1.5 mL Eppendorf离心管、移液器及枪头、试管、培养皿、碎冰、超低温冰箱3．试剂及溶液（1）LB培养基（1 L）：NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，固体培养基含琼脂15 g，高压灭菌；（2）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成50 mg／mL水溶液，过滤除菌，－20℃保存备用；（3）0.1 mol／L CaCl2：超纯水配置，高压灭菌；（4）双蒸水，高压灭菌；四、实验步骤1．大肠杆菌感受态细胞的制备（1）取大肠杆菌DH5a菌株在LB平板上划线，37℃倒置培养12 h。
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安徽工业大学
分子生物学实验讲义
主编：谢峻
2013-8-20
目录
目录 (2)
实验一分子生物学常用到的仪器及使用方法 (3)
实验一分子生物学常用到的仪器及使用方法
一、实验目的
1. 了解分子生物学实验的常规仪器、设备、耗材；
2. 掌握常用仪器的功能和使用方法；
3. 掌握单道移液器的使用方法和技巧；掌握移液器的使用和维护保养注意事项。
二、实验内容
常规仪器：
（一）温度控制系统：
1. 冰箱：根据药品、试剂及多种生物制剂保存的需要，必须具备不同控温级别的冰
箱，最常使用的有：4℃、-20℃、-80℃冰箱。
4℃适合储存某些溶液、试剂、药品等。
-20℃适用于某些试剂、药品、酶、血清、配好的抗生素和DNA、蛋白质样品等。
-80℃适合某些长期低温保存的样品、纯化的样品、特殊的低温处理消化液等的保存。
0-10℃适合低温条件下的电泳、层析、透析等实验。
2. 液氮罐：有些实验材料、某些器官组织、细胞株、菌株及纯化的样品等，要求速
冻和长期保存在超低温环境下，就需要一个液氮罐（-196℃）具有经济、
省力和较好地保持细胞生物学特性的优点。
3. 培养箱：
37℃生化恒温培养箱：用于细菌的固体培养。
CO2培养箱：适用于培养各种细胞，可恒定地提供一定量的CO2（通常5%），用
来维持培养液的酸度（pH值）。
37℃恒温空气摇床：可进行液体细菌的培养。
4. 水浴锅：用于保温。
25-100℃水浴摇床可用于分子杂交试验，各种生物化学酶反应等试验的保温。
25-100℃水浴箱用于常规试验。
5. 烘箱：主用于烘干实验器皿，有些需要温度高些，有些需要温度低些。
用于RNA
方面的实验用具，需要在250℃烤箱中烘干，有些塑料用具只能在42-45℃的烤
箱中进行烘干。
（二）水的净化装置：随着分子生物学的飞速发展，许多实验对水纯度的要求越来越高。
1. 蒸馏水皿：单蒸水常难以满足实验要求。
双蒸水、三蒸水配液，许多实验要去离
子水。
多次蒸馏水可除去水中挥发性杂质，不能完全除去水中溶解的
气体杂质（Mn2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等）。
2. 离子交换器：用离子交换法制取的水，称去离子水。
去离子不能除去水中的非离
子型杂质，其中常含有有机物。
3. 超纯水：采用多级过滤、高性能离子交换单元、超滤过滤器、反渗透技术、紫外
灯、除TOC装置等多种处理方法，使电阻率达到18.2 mΩ·cm（25℃）。
4. 其他常用水：
中国国家实验室分析用水标准（GB6682-92）
指标名称一级水二级水三级水
mΩ
mΩ >0.2
电阻MΩ·cm（25℃） >10
mΩ >1
可氧化物（以O计）mg/L - 0.08 0.40
蒸发残渣（mg/L） - 1.0 2.0
（三）菌消毒设备：分子生物学所用大部分试剂，而且实验用具都应严格消毒灭菌。
1．高压蒸汽灭菌锅：用于小批量物品的随时消毒。
大批实验物品、试剂、培养基可
使用大型消毒且定时进行消毒。
2. 紫外线：紫外线照射灭菌方便，但灭菌效果与距离有关，用于无菌室，超净台和
塑料用具的消毒。
3. 滤器滤膜：不耐高温、高压的试剂用其灭菌。
4. 灼烧灭菌：主用于金属器械急需时采用。
（四）计量系统：
1. 称量系统：台秤、托盘天平、万分之一天平、十万分之一天平等
2. 液体体积的度量：
精：单道移液器、多道移液器
粗：量筒、移液管、刻度试管
3. pH值测量：pH计、pH试纸
4. OD值测量：OD值是许多溶液中溶质定量的方便指标之一，通过所产生的单色光而
测定某一溶液对该单色光的吸收值，利用它可进行蛋白质、核酸等溶
液定量和纯度的初步判断。
紫外-可见分光光度计
快速核酸蛋白分析仪
酶标仪
（五）离心机：离心技术是研究生物的结构和功能中不可缺少的一种物理技术手段。
因为各种物质在沉淀系数、浮力、和质量等方面有差异，可利用强大的离
心力场，使其分离、纯化和浓缩。
目前有各种各样的离心机。
可供少于
0.05 ml到几升的样品离心之用。
离心技术应用广泛，包括收集和分离细
胞、细胞器和生物大分子等。
根据其转速及分离体积的不同，可分为以
下几种类型：
1. 普通台式离心机：最大转速16800 rpm/m，常用于收集细胞、细菌等。
2. 台式高速冷冻离心机：主要用于高分子蛋白质、核酸、细胞、细菌的沉淀和
收集。
3. 迷你离心机：最大转速6000 rpm /m，常用于短暂离心，以小量收集或制备核
酸。
（六）超净工作台：内有紫外灯、照明灯等灭菌的设备，是一种提供局部洁净度的设备。
其原理是鼓风机驱动空气，经过低、中效的过滤器后，通过工作台
面，使实验操作区域成为无菌的环境。
1. 超净台按气流方向的不同大致有2种类型：
1.1 侧流式：净化后气流，从左侧或右侧通过工作台面，流向对侧，或者从上
往下或从下往上流向对侧，他们都能形成气流屏障而保障台面无
菌。
缺点：在净化气流和外边气体交界处，可因气体的流向而出
现负压，使少量的未净化气体混入，而造成污染。
1.2 外流式：气流是面向操作人员的方向流动，从而保证外面气体不能混入。
缺点：在进行有害物质实验时，对操作人员不利，但可采用有机
玻璃把上半部分遮挡起来，使气流往下方流出。
2. 超净台按工作人数、大小的不同有多种类型：
2.1 单人单面
2.2 单人双面
2.3 双人单面
2.4 双人双面
（七）电泳系统：电泳技术是检测、鉴定各种生物大分子的纯度、含量及描述它们的特征，甚至还是分离、纯化、回收和浓缩样品的工具之一。
核酸和蛋白
质等都带有电荷，当它们被置于电场中时，能够移动。
电泳装置由两
部分组成：电源装置和电泳槽装置。
1. 电泳装置：电源需经稳流通过稳压器，既能提供稳定的直流电，又能输出稳
定的电压。
可用于三种：
1.1 常度稳压电泳仪：输出电压0 - 500V 0 -15 mA
1.2 中度稳压电泳仪：输出电压400 - 1000 V
1.3 高度稳压电泳仪：输出电压1000 V以上的电源装置
2. 电泳槽装置：分两种
1.1 水平式电泳槽：一般分为微型电泳槽和大号水平式电泳槽
1.2 垂直式电泳槽：分垂直平板电泳槽和圆柱形电泳槽装置
（八）PCR仪：Polymerase Chain Reaction仪，也称DNA热循环仪、基因扩增仪，它是使一对寡核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成
拷贝数百万倍的靶序列DNA片段，它的每一循环包括在3种不同温度进
行的DNA变性，引物复性，DNA聚合酶催化的延伸反应3个过程。
单道移液器的使用方法和技巧
（一） 使用步骤
1. 量程的调节
1.1 在调节量程时，速度适中，切勿过快。
1.2 在调节过程中，千万不要调出量程，否则会卡住内部机械装置而损坏移液
枪。
2. 枪头（吸液嘴）的装配
2.1 在将枪头（pipette tips）套上移液枪时，切勿使劲在枪头盒子上敲几下，
这是错误的做法，因为这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产
生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住。
正确的方法
是将移液枪（器）垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动，使其紧密
结合。
如果是多道（如8道或12道）移液枪，则可以将移液枪的第一道对
准第一个枪头，然后倾斜地插入，往前后方向摇动即可卡紧。
枪头卡紧的
标志是略为超过O型环，并可以看到连接部分形成清晰的密封圈。
3. 移液的方法
3.1 吸放液体时，移液器应始终保持竖直状态，将枪头插入液面下2-3毫米。
在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密
度与水不同的液体时）。
4. 移液器的正确放置
4.1 使用完毕，将其垂直挂在移液枪架上，但千万要小心别掉下来。
当移液器
枪头里有液体时，切勿将移液器水平放置或倒置，以免液体倒流腐蚀活
塞弹簧。
（二） 移液器（移液枪）维护保养时的注意事项
1. 使用完毕，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保
护弹簧。
2. 定期校准。
3. 使用前要检查是否有漏液现象。
方法是吸取液体后悬空垂直放置几秒中，看
看液面是否下降。
如果漏液，原因大致有一下几方面：
3.1 枪头与移液器是否套紧；
3.2 枪头与移液器是否匹配；
3.3 移液器弹簧活塞是否正常；
3.4 如果是易挥发的液体（许多有机溶剂都如此），则可能是饱和蒸汽压的问
题。
可以先吸放几次液体，然后再移液。
三、预习思考题
1.可调式单道取液器的在使用过程中尤其应注意哪些事项？
2.提取RNA的水应用何种纯度的水，此外，在使用前还应作哪些处理？。