第二章 细胞生物学研究方法

第二章细胞生物学研究方法

姓名：李淼学号：09352044 班级：生科一班日期：10.12

我们知道，细胞层面的概念与发现离不开技术的支持，本章则为我们列举了几类基本的细胞生物学研究方法，它们是显微成像技术、细胞化学技术、细胞分选技术、细胞工程技术、分离技术以及分子生物学方法等。

显微镜的镜像形成需要3个基本因素：照明系统、被观察的样品、聚焦和成像的透镜系统。显微镜主要分为光学显微镜和电子显微镜，但两者的成像原理是相同的。光和电子都有波的行为，当光和电子穿过透镜到达焦距点时，由于波的干涉性质而成像。实际上通过透镜观察到的样品的镜像是衍射的结果。显微镜具有以下性质：分辨率（最重要）、最大分辨率、分辨极限与放大率。

我们需要了解常用的显微镜及其样品制备方法。光学显微镜包括普通双筒显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜和倒置显微镜。相差显微镜使相位差变成振幅差，有利于我们管擦无色、透明、活细胞中的结构。暗视野显微镜使被检物体在黑暗的视野中呈现明亮的像，用以观察未经染色的活体或胶体粒子。

光学显微镜的样品粗略可以分为两类：整体和切片。对于切片要经过以下步骤处理才可以在光镜下看清楚：固定（具有缓冲作用的醛类固定液）、包埋（液体石蜡或树脂）和切片、染色、放射自显影。放射自显影的原理是利用放射性同位素所发射出来的带电离子作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，在显影液中成为可见的“像”，从而定位定量检测生物大分子。

电子显微镜的电子束波长比可见光短100000倍，所以大大提高了显微镜的分辨率。将在光学显微镜中观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构称为亚显微结构或超微结构。主要的电子显微镜包括透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）、扫描透射电子显微镜（STEM）、高压电子显微镜（HVEM）。投射电子显微镜是让电子穿透样品，而扫描电子显微镜是让电子束在样品表面扫描。扫描透射电子显微镜比较复杂，具有两者的功能，但技术要求高，需要非常高的真空度。高压电子显微镜的电压特别高，会大大减少造成染色体畸变的可能，细胞切片可以较厚。

电子显微镜的样品制备也需要固定、包埋、切片、染色等步骤，差别之一在于样品要更薄，需要使用超薄切片机。另一个差别在于样品不是放在玻片上而是载网上。还有几项技术用于电子显微镜的样品制备，包括负染色、喷镀技术、冷冻断裂复型和冷冻蚀刻。负染色由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。在图像中背景是黑暗的，而未被包埋的样品颗粒则透明光亮。

细胞化学技术包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术和其他细胞化学技术。酶细胞化学技术是在酶的作用下产生反应产物，经捕捉反应来间接证明酶定位的反应，具有特异性。免疫细胞化学技术是利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。免疫细胞化学技术就是利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术。

细胞分选技术主要借助流式细胞仪实现细胞和染色体的分选。，包括测量细胞的大小、形状、细胞DNA、RNA含量和细胞总蛋白。细胞分选中所用的探针是能够同待分选细胞表面特征性蛋白结合的抗体。染色体分选中使用的探针是同目标染色体互补的寡聚核苷酸，能够形成稳定的杂交体。

细胞工程技术包括细胞培养、细胞融合、单克隆抗体技术、细胞核移植克隆技术等。细胞培养要注意动植物的区别。动物细胞经过体外培养由原代细胞形成细胞系，最终形成具有特殊性质的细胞株。植物组织是利用细胞全能型去分化形成愈伤组织然后再分化形成新的植

株。细胞融合是指自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞，应用在实际上就是单克隆抗体技术，即将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交的技术。筛选出杂种细胞的培养基是HA T培养基。

分离技术包括细胞组分的分离和生物大分子的分离。速度离心分离细胞的基本原理抓哟是根据被分离物质的体积差异。一定的离心速度下，体积大的沉降的快，反之沉降得慢。速度离心又分为两种，一种是差速离心，主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。另一种是移动区带离心，此方法需要用蔗糖或甘油制备轻微的连续密度，然后将待分离的样品加在离心管的最上层，形成以狭窄的带，再通过较长时间的离心。在速度离心时，被分离的分子越小，需要的离心速度越高。

层析是广泛使用的分离蛋白质的方法，根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的屋里分离方法。分为凝胶过滤层析、亲和层析和离子交换层析。凝胶过滤层析主要根据蛋白质的质量进行分离和纯化，质量大的先被洗脱出来。亲和层析是依据特异而可逆的结合原理设计的蛋白质分离纯化方法。能够被吸附剂吸附的蛋白质会滞留在层析柱中，而没有被吸附的蛋白质直接流出。随后选用适当洗脱液洗脱被吸附的蛋白质。离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的方法，要注意蛋白质中氨基酸的电性取决于介质中的pH。

分子生物学方法包括基因重组技术、基因转移、分子杂交、PCR反应和序列分析等等。基因工程技术是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按照预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制，方法分为4步：引物设计和合成、DNA模板的制备、PCR反应、产物的分离和纯化。

乳腺生物反应器是根据细胞生物学中蛋白质合成与分选的机理，结合基因工程技术、动物转基因技术等，利用动物的乳腺分泌某些具有重要价值的基因产物。