总菌数测定1(完整版)

细菌总数的测定

（1）培养计数法

一、目的

1.掌握从微生物群体中土壤和饲料等）获得纯种微生物的分离和培养技术。

2.掌握无菌操作技术。

二、材料和器皿

1. 天平、取样工具、涂布棒(接种棒)。

2. 无菌三角瓶、试管、培养皿、移液管、玻璃珠。

3. 无菌水。

4. 培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。

三、实验操作步骤

1、取样

将待测样品充分混匀，取少量，备用。

2、倒平板

熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平

板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。

3、编号

取5支无菌空试管（15×150mm）依次编号为10-3、10-4、

10-5、10-6、10-7。

4、分装无菌水

按无菌操作用5mL移液管分别吸取4.5mL无菌水于编号的

各无菌空试管中。

5. 制备土壤稀释液

称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻

璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢

或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液

管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三

次、摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-

7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。

环境要求：琼脂平板在工作台暴露15分钟，每个平板不得超过15个菌落。

代表性：取固体样品时需多采几个部位，且经过均质或研磨；液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。

减少误差：每递增稀释一次即换用1支1ml灭菌吸管，将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，并且稀释液应充分振摇。

6、培养及计数

计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不得超过24h。

计平皿中菌落数：肉眼观察，必要时用放大镜检查。记下各平板的菌落总数，求出同稀释度的各平板平均菌落数。

规律：不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接

近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数；当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。

计数原则：选平均菌落数在30~300之间者进行计算

1.仅1个稀释度的平均菌落数在此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数报

告之。

2.若有2个稀释度的平均菌落数在30~300之间时，则按两者的菌落总数之比来决

定，若比值小于2应报告两者的平均数；若大于2则报告其中较小的菌落总数。

3.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍

数报告之。

4.若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀

释倍数报告之。

5.若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则以最接近300或30的平均菌

落数乘以稀释倍数报告之。

6.若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。

7在求同稀释度的平均数时，若其中1个平板上有较大片状菌落生长时，则不宜

采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落约

为平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均匀，则可按半平板上的菌落计数，

然后乘以2作为整个平板的菌落数。

7、菌落总数报告方式

菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1~100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。为了缩短数字后面的零位，可用10的指数来表示。

固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（mL）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。

8. 计数

选菌落分散、菌落数适量且各平行皿菌落数接近的稀释度的平皿计数，通常细菌和放线菌选取菌落数在30～300之间的平皿，霉菌选菌落数在10～100之间的平皿，最后换算成每克待测干样品所含菌数。

同一稀释度的平均菌落数×稀释倍数

每克样品含菌数=——————————————————

1－样品含水量％

(2) 直接镜检法

一、目的要求

1、明确血球计数板计数的原理

2、掌握测定细胞总数、活菌数百分率的技术

二、实验原理

镜检计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球计数板；一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽(Petroff Hausser)细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成。

每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为