学习手册-大肠菌群数测定(精)

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《子情境：大肠菌群数测定》引导文-单元设计-实训指导书

引导文

微生物学检测-大肠菌群数测定

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大肠菌群主要包括肠杆菌科中的埃希氏菌属、柠檬酸细菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。这些属的细菌均来自于人和温血动物的肠道，需氧与兼性厌氧，不形成芽孢，在35～37℃条件下，48h内能发酵乳糖产酸产气，革兰氏阴性。大肠菌群中以埃希氏菌属为主，埃希氏菌属被俗称为典型大肠杆菌。大肠菌群都是直接或间接地来自人和温血动物的粪便。本群中典型大肠杆菌以外的菌属，除直接来自粪便外，也可能来自典型大肠杆菌排出体外7~30d后在环境中的变异。所以食品中检出大肠菌群，表示食品受到人和温血动物的粪便污染，其中典型大肠杆菌为粪便近期污染，其他菌属则可能为粪便的陈旧污染。

材料二：抑菌剂

大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。

国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。

抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行

回答下面问题？

大肠菌群数？_________

材料一 、测定方法

由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。

目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h ，观察是否产气。

分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h ，观察菌落形态。

证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h ，观察产气情况。

报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN 表，报告每100ml （g ）大肠菌群的MPN 值。

具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定》

相关资料

材料二、微生物学检验大肠菌群数的测定

一、原理

大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。

食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number 简称MPN）表示。

二、培养基及试剂

单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯(MA) 其它设备和材料温箱(36土1)℃、水浴锅(44土0.5)℃、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。

三、实验步骤

(一)检验程序

大肠菌群检验程序见图5—2

(二)操作步骤

1．采样及稀释

①以无菌操作将校样25g(或25mL)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以800r／mjn—1000r ／min的速度处理1min，做成1：10的稀释液。

②用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支lmL灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液。

③根据食品卫生要求或对检验样品污染情况的估计按种3管。也可直接用样品接种。

2．乳糖初发酵试验

即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。

将待校样品接种子乳糖服盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管1mL及1mL以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置(36土1)℃培养箱内，培养(24土2)h，的所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，勿有产生者，则按下列程序进行。如有产生者，则按下列程序进行。

3．分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上，置(36土1)℃温箱内，培养18h一24h，：然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。

4．乳糖复发酵试验

即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酪管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产生气体。

在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群1—2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置(36士l)℃的温箱内培养(24土2)h，观察产气情况。

凡乳糖发酵管产气．革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌阳性糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。

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大肠菌群数的测定学习情境设计方案

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