何首乌苯甲酮合成酶基因的克隆及序列分析
药用植物次生代谢相关酶基因克隆方法综述_战晴晴
·综述·药用植物次生代谢相关酶基因克隆方法综述战晴晴1,2，隋春2，张杰1*，魏建和2 (1.东北林业大学生命科学院，哈尔滨 150040；2.中国医学科学院&北京协和医学院药用植物研究所，北京100193)摘要：目的综述药用植物次生代谢酶基因克隆可采用的方法策略，为其基因克隆提供参考。
方法查阅相关文献进行总结和归纳。
结果阐述了用于克隆药用植物次生代谢酶基因的功能克隆方法、表型克隆方法(DD-PCR、cDNA–AFLP、SSH)、转座子标签克隆方法及图位克隆方法。
结论适用于药用植物次生代谢相关酶基因克隆的技术方法有很多种，研究者可根据研究基础、目的和实验条件等进行选择。
关键词：药用植物；次生代谢；基因克隆中图分类号：Q78 文献标志码：A 文章编号：1007-7693(2009)10-0805-05Review on Gene Cloning Methods Involved in Medicinal Plant Secondary MetabolismZHAN Qingqing1,2, SUI Chun2, ZHANG Jie1*, WEI Jianhe2(1. College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Herbin 150040, China; 2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China)ABSTRACT: OBJECTIVE Reviewing gene cloning methods and strategies that can be used in medicinal plant secondary metabolism, to provide selection references. METHODS Searching and summarizing literatures on gene cloning of plants, especially of medicinal plants. RESULTS Gene cloning methods used in medicinal plant secondary metabolism, such as functional cloning method, phenotype cloning methods, transposon tagging and map-based cloning method were elaborated. CONCLUSION There are many methods used to clone genes in medicinal plant secondary metabolism, researchers should choose the suitable one with different basis, purposes and experiment condition.KEY WORDS: medicinal plants; secondary metabolism; gene cloning次生代谢是存在于植物、动物和微生物中有别于初生代谢的一类特殊而又复杂的代谢类型。
何首乌基因组DNA提取及RAPD反应体系正交设计优化
何首乌基因组DNA提取及RAPD反应体系正交设计优化(作者：_________ 单位： ____________ 邮编： __________ )【摘要】目的确定适合何首乌RAPD-PC的基因组DNA 提取方法及最适宜反应体系。
方法通过改良的CTAB法提取何首乌基因组DNA研究其用于RAPD-PCR勺可行性。
利用正交设计方法L16 (45)，针对Tag酶，引物，dNTP镁离子，模板设计了5因素4水平的正交实验，优化RAPD-PC反应体系。
结果正交设计结果表明，可以得到几种不同的有效扩增反应体系组合。
根据实际需求，最适宜的RAPD-PC 反应体系为20 卩I，其中1X PCR buffer, Tag 酶1U，弓I 物 1 卩mol/L，镁离子2 mmol/L，dNTP 300 卩mol/L，模板40 ng。
结论改良的CTAB法和正交优化得到的反应体系适合用于何首乌RAPD 遗传多样性分析。
【关键词】何首乌；DNA提取；RAPD正交设计何首乌是我国传统医药中的名贵药材，何首乌块根及茎叶均可入药。
何首乌具有补肝肾、益精血、乌须黑发、养心安神等功效，主治血虚身痛、心烦失眠、劳伤多汗等症。
同时可用于保健和食品等多方面，何首乌块根富含淀粉，含量高达45.2%,药食两用。
RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)技术是由美国学者Williams : 1］和Welsh :2］两个研究团队在1990年几乎同时发展起来的。
Williams等在发现RAPD多态性的同时还证明了RAPD标记的分离情况符合孟德尔遗传规律，因而明确了RAPD乍为分子标记用于研究生物遗传变异的理论基础。
RAPD分子标记建立在PCR基础之上。
通过使用一系列具有10个碱基的单链随机引物，对基因组的全部DNA进行PCR扩增以检测多态性。
RAPD^术因其操作简便、反应迅速、成本低和DNA用量少等优点而被广泛应用于药用植物种内或种间亲缘关系和遗传多样性方面的研究。
何首乌基因工程的基本流程
何首乌基因工程的基本流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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决明查尔酮合成酶全长基因序列的克隆与分析
决明查尔酮合成酶全长基因序列的克隆与分析钟德馨;方袁梦梦;郭壮浩;安红强;董银松;丁若凡;王万军;廖海;周嘉裕【摘要】从决明(Cassia tora)的新鲜子叶中提取基因组DNA作为模板,利用一对特异引物进行PCR扩增,然后克隆测序得到决明查尔酮合成酶(CHS)的基因全长.测序结果表明,决明CHS基因全长为1 766 bp,含有2个外显子和1个内含子.将其提交GenBank,登录号为(JX676773).决明CHS基因的内含子位于188-765 bp之间,长度为578 bp,内含子的剪切符合GU-AG规律,含有多个酶切位点和顺式调控元件,可能与决明CHS基因的表达调控有关.CHS基因内含子具有多态性,可能是由不同植物存在多样性的生活史与生活环境导致的.决明CHS基因外显子2较为保守,编码几乎所有CHS的功能位点.构建外显子2编码氨基酸序列的NJ系统发育进化树,能够正确反映不同植物的亲缘关系,可用于不同植物的遗传分化和分子进化研究.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2013(000)005【总页数】6页(P99-104)【关键词】决明;查尔酮合成酶;内含子;基因克隆;序列分析【作者】钟德馨;方袁梦梦;郭壮浩;安红强;董银松;丁若凡;王万军;廖海;周嘉裕【作者单位】西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031;西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031;西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031;西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031;西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031;西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031;西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031;西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031;西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031【正文语种】中文真核生物基因的一个基本特征是它们被一个或多个内含子所间隔，这些内含子在转录后被除去以形成具有完整读码框的mRNA。
三种蕨类植物查尔酮合成酶(CHS)基因的克隆与分析的开题报告
三种蕨类植物查尔酮合成酶(CHS)基因的克隆与分析的开题报告摘要：蕨类植物是一类古老的植物，具有良好的药用和食用价值。
查尔酮合成酶(CHS)是蕨类植物合成次生代谢物的重要酶，在蕨类植物的生物合成过程中起着关键作用。
本研究旨在克隆三种不同蕨类植物的CHS基因，并对其进行序列分析和表达模式研究，以期深入探究蕨类植物的生物合成机制。
1. 研究背景蕨类植物是一类古老的植物，分布广泛，包括了蕨、石松、蘑苔等多种，具有重要的药用和食用价值。
蕨类植物是地球上最早的裸子植物之一，其生存时间可追溯到4.6亿年前，对环境的适应能力极强。
查尔酮合成酶（CHS）是蕨类植物合成次生代谢物的重要酶，在化学防御、异色花色和抗氧化等方面起着关键作用。
随着基因工程和生物技术的发展，研究CHS基因及其调控机制已经成为国内外学者的热门研究课题。
2. 研究目的本研究旨在克隆三种不同蕨类植物（蕨、石松、蘑苔）的CHS基因，并对其进行序列分析和表达模式研究，以期深入探究蕨类植物的生物合成机制。
3. 研究方法（1）样本采集：分别采集蕨、石松和蘑苔的新鲜叶子样本。
（2）总RNA提取：采用TRIzol法提取样本总RNA。
（3）cDNA合成：将提取的总RNA进行逆转录反应，制备出cDNA模板。
（4）CHS基因克隆：采用PCR扩增方法，使用通用引物扩增CHS 基因的全长序列。
（5）克隆序列分析：将PCR产物进行酶切、测序和分析，获得CHS基因的全长序列，并进行多序列比对和物种系统发育树构建。
（6）实时荧光定量PCR：采用实时荧光定量PCR技术对三种蕨类植物中CHS基因的表达模式进行研究。
4. 预期结果预计可以从三种不同的蕨类植物中成功克隆到CHS基因，并获得其全长序列。
通过多序列比对和系统发育树构建，可以对三种蕨类植物的CHS基因进行进化分析和比较。
通过实时荧光定量PCR技术，可以研究三种蕨类植物中CHS基因的表达模式，揭示CHS基因在蕨类植物中的生物合成机制。
不同来源白首乌rDNAITS序列分析
度为 234 bp , 5 8S 序列的长度为 162 bp , ITS2 序列 的长度为 245 bp 。 3 种不同来源的白 首乌 ( 4 个样 品 )中共有 10个碱基存在变异, 其中 5 个为碱基颠 换, 4个为碱基转换 , 1 个为碱基缺失。 I T S1 的变异 位点有 4 个, I T S2 的变异位点有 6 个, 5 8S 无变异 位点 , I T S1 的 ( G + C ) % 的 量 在 48 291 % ~ 50 427 % , 5 8S ( G + C ) 为 54 938 % , ITS2 的 ( G + C ) % 的量在 61 224 % ~ 62 449 %。 2 3 白首乌各样品序列间的碱基差异性与遗传距 离分析 利用 DNAMAN 软件对各样品间的碱基差 异进行分析和遗传距离分析 , 所得结果见表 2 。 3号 和 4 号的遗传距离为 0 001 , 碱基相似度为 99 9 %, 其次分别为 2 号和 3 号 ( 0 010 , 99 0 % ), 2 号和 4 号 ( 0 011, 98 9 % ) , 1 号和 3 号 ( 0 022 , 97 8% ), 1 号和 4 号 ( 0 023, 97 7 % ), 遗传距离最大碱基相似 度最小的为 1 号和 2 号 ( 0 029 , 97 1 % ) 。即泰山白 首乌济南野生种和泰安栽培种的遗传距离最近, 碱 基相似度最高 , 隔山消与耳叶牛皮消的遗传距离最 远, 碱基相似度最低。
PCR 扩增的 DNA 片段直接进行测序, 为保证测序的 2 2 白首乌 ITS 序列的长度分析 根据基因库中 准确性, 采用克隆测序的方法 , 将所测得的白首乌的 18S~ 26S r DNA 序列输入到 NCB I 上的 Genbank 中 用 B last进行比对, 并且界定出样品的 18S rRNA ~ 26S rRNA 基因及其间隔序列各部分的序列。发现 供试的 3 种白首乌 ( 4个样品来源 ) 与已登录的隔山 消 ( LYPS2009030854) 18S ~ 26S r DNA 序列具 有较 高的同源性。本实验所用材料戟叶牛皮消即泰山白
白木香查尔酮合成酶基因(AsCHS1)启动子克隆及激素应答元件功能的初步鉴定
白木香查尔酮合成酶基因(AsCHS1)启动子克隆及激素应答元件功能的初步鉴定曹天骏;戴好富;李辉亮;郭冬;梅文莉;彭世清【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2014(035)010【摘要】利用染色体步移法克隆了白木香查尔酮合成酶基因(AsCHS1)ATG上游1 082 bp的启动子序列,该启动子序列中AT含量高达69.03％,符合真核生物启动子的序列特征.通过启动子预测软件分析可知,该序列的转录起始位点位于翻译起始位点-65 bp处,并且其上游-25～30 bp区域存在TATA-box等典型的真核生物启动子核心元件,同时含有一些顺式作用元件如赤霉素应答元件GARE-motif、茉莉酸甲酯应答元件CGTCA-motif、水杨酸应答元件TCA-element等激素调控元件,光应答元件Box Ⅰ、G-Box、ACE,厌氧诱导元件ARE等.通过构建pC-1082proAsCHS1植物表达载体,借助农杆菌将重组载体转化到烟草叶片中.蛋白定量结果表明,该序列可以驱动GUS的表达,具有启动子活性;脱落酸显著增强该启动子的活性,乙烯则显著抑制该启动子的活性.【总页数】7页(P1950-1956)【作者】曹天骏;戴好富;李辉亮;郭冬;梅文莉;彭世清【作者单位】海南大学农学院,海南海口570228;中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室海南海口571101【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.油果实中查尔酮合成酶基因 PsCHS 的克隆表达分析及其启动子的分离 [J], 姜翠翠;王玉珍;叶新福2.嫁接陆地棉查尔酮合成酶与查尔酮异构基因的克隆及r表达分析 [J], 宋成攀;夏松波;王孝刚;张教海;秦鸿德;张友昌;冯常辉;别墅3.白木香愈创木烯合酶基因(AsSGS)启动子的克隆及功能初步鉴定 [J], 何访;梅文莉;李辉亮;郭冬;彭世清;戴好富4.草地早熟禾查尔酮合成酶基因PpCHS1克隆、功能与表达分析 [J], 何春艳;甘露;闫蒙举;张兰;苏浩天;尹淑霞5.藤茶查尔酮合成酶基因AgCHS1的克隆及功能鉴定 [J], 许明;林世强;倪冬昕;伊恒杰;刘江洪;杨志坚;郑金贵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
何首乌苯甲酮合成酶基因的克隆及序列分析
何首乌苯甲酮合成酶基因的克隆及序列分析（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的克隆何首乌苯甲酮合成酶基因并作序列分析。
方法以何首乌Polygonum multiflorum Thunb.为材料，根据其它植物苯甲酮合成酶(Benzalacetone synthase，BAS)基因cDNA序列的保守区域设计引物，利用RT PCR和3`RACE，克隆其基因。
结果从何首乌叶cDNA中克隆出了长度为1 049 bp的基因片段。
序列分析表明该片段具有典型的CHS基因家族的结构域，为何首乌的BAS基因片段，命名为PmBAS。
将得到的序列提交GenBank，序列号为FJ601686。
对获得的PmBAS的氨基酸序列进行比较分析，发现PmBAS不含有Phe215，这种差异可能是CHS与BAS催化不同反应的重要原因之一。
何首乌BAS与其它植物CHS的氨基酸序列的进化分析表明，其与同为蓼科的虎杖和掌叶大黄的同源性较近。
结论对利用基因工程技术促进何首乌蒽醌合成具有重要意义。
【关键词】何首乌；苯甲酮合成酶；基因克隆；序列比较蒽醌（Anthraquinone）是一类重要的中草药活性成分，常见于何首乌、决明、大黄、虎杖、芦荟和茜草等植物中，具有抗菌、泻下、利尿、抗氧化和过氧化作用、抗诱变和保肝等多种功效［1，2］。
Dewick 等［3］与VELI EK等［4］认为，蒽醌的合成大致分为3个阶段：①以乙酰辅酶A为起始单元，连续与8个丙二酸单酰辅酶A发生缩合，引入8个二碳单位，最后生成蒽醌的基本骨架——八酮化合物；②八酮化合物经过还原、脱羧及氧化等步骤，形成大黄酚、芦荟大黄素与大黄酸等蒽醌类化合物；③八酮化合物经过水解、脱羧、脱水与甲基化等步骤，形成大黄素与大黄素甲醚等蒽醌类化合物（见图1）。
在第1阶段中，催化乙酰辅酶A与丙二酸单酰辅酶A缩合的反应是由植物查尔酮合成酶系催化完成的。
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檀香萜烯合成酶基因的克隆与序列的分析
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檀香萜烯合成酶基因的克隆与序列的分析
作者：文海涛，赵红英，林励，邱贤秀
【摘要】目的通过克隆技术获得参与檀香挥发油形成的萜烯合成酶基因。
方法利用CTAB?LiCl法提取檀香已结香心材总RNA，采用RT?PCR技术克隆萜烯合成酶基因。
结果克隆获得了一个檀香萜烯合成酶基因，该基因编码区全长1 731 bp，编码576个氨基酸残基。
结论CTAB?LiCl法能提取较高质量的檀香心材总RNA，克隆获得的萜烯合成酶具有编码区。
1。
何首乌Ⅲ型PKS基因的克隆和表达分析
何首乌Ⅲ型PKS基因的克隆和表达分析＋生书晶１，赵树进２＊（1. 华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州510640; 2. 中国人民解放军广州军区广州总医院，广东广州510010）摘要：目的 克隆并表征中药材何首乌(Fallopia multiflora)中的Ⅲ型聚酮合酶（polyketide synthases , PKS)基因。
方法根据已知PKS基因的保守序列设计简并引物，RACE技术克隆何首乌中的PKS基因；利用生物信息学工具分系其生化特征，RT-PCR分析其在各组织中的表达差异。
结果首次从何首乌中克隆到一种Ⅲ型PKS基因FmPKS2(GenBank登录号：GQ984139)。
与迄今报道的绝大部分Ⅲ型PKS含有一个内含子不同，其基因组DNA含有三个内含子。
该基因在不同组织中均有表达，在块根中表达量最高。
结论该基因在何首乌不同组织中的表达模式与二苯乙烯苷、蒽醌类等活性次生代谢产物的积累模式一致，推测该基因可能参与了某种次生代谢物的生物合成。
通过生物信息学工具对其编码蛋白的各种理化性质进行预测，为进一步研究其功能奠定了基础。
关键词：何首乌；聚酮合酶；基因克隆；生物信息学；基因表达Molecular analysis of a type Ⅲ polyketide synthase gene in Fallopia multifloraSHENG Shu-jing1, ZHAO Shu-jin 2(1. School of Biological Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China; 2. Department of Pharmacy, Guangzhou Liuhuaqiao Hospital, Guangzhou 510010, China)ABSTRACT：OBJECTIVE To clone and characterize type Ⅲ polyketide synthases (PKSs) gene from Fallopia multiflora.METHODS Using degenerate primers designed to the conserved type Ⅲ PKS gene from plants and RACE technology, a PKS gene in Fallopia multiflora was cloned. Its characteristics were analyzed by RT-PCR and bioinformatics analysis. RESULTS A PKS gene named FmPKS2 (GenBank accession number: GQ984139) was cloned. The coding sequence of the gene was interrupted by three introns, which is different from nearly all the type III PKS genes studied so far contained only one intron at a conserved site. Through RT-PCR, high expression levels were detected in rhizomes and old stems while the lowest levels were found in mature leaves.CONCLUSION The expression pattern strongly correlates with the accumulation of the mainly active principles including 2, 3, 5, 4’-tetra-hydroxy-stilbene-2-O-ß-D-glucoside (TSG) and anthraquinones, suggesting that FmPKS2 might play an important role in the biosynthesis of these metabolites. The use of bioinformatics methods laid the foundation for further studying its gene function of FmPKS2. Keywords: Fallopia multiflora; polyketide synthase; gene cloning; bioinformatics; gene expression 何首乌(Fallopia multiflora Thunb.)，蓼科多年生缠绕草本植物，其块根（何首乌）和藤茎（夜交藤）都可作药用。
何首乌苯甲酮合成酶基因的克隆及序列分析
时珍 国医国药 ２ １ ０ ０年第 ２ 卷第 １ １ 期
何 首 乌 醌 （ ｎｈａｕｎｎ ） 一 类 重 要 的 中草 药 活 性 成 分 ， 见 于 喃 酮 合 成 酶 （ －ｙ ｎ ｙｔａｅ２Ｐ ） 苯 甲酮 合 成 酶 （ Ａ ） 吖啶 Ａ ｔｒｑ ｉ ｅ 是 ｏ 常 ２ｐ ｒ ｅｓｎｈｓ ，－Ｓ 、 ｏ ＢＳ、
何首乌 、 明 、 黄 、 决 大 虎杖 、 荟 和 茜 草 等 植 物 中 ， 有 抗 菌 、 下 、 酮 合 成 酶 （ ｃｉｏｅ ｓｎｈｓ ， Ｃ ） 芦 荟 松 合 成 酶 （ ｌｅｏｅ 芦 具 泻 Ａ ｒ ｎ ｙｔａｅ Ａ Ｓ 和 ｄ Ａ ｏｓｎ 利 尿 、 氧 化 和 过 氧 化 作 用 、 诱 变 和 保 肝 等 多 种 功 效 ’ 。 ｓｎｈ ｓ， Ｌ ） 成 员 ， 们 的 氨 基 酸 序 列 相 似 性 达 ６ ％ ～ 抗 抗 ｙ ｔａｅ Ａ Ｓ 等 它 ０
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统 中药 ， 有 补 肝 肾 、 精 血 、 须 发 、 发 、 筋 骨 之 功 效 ， 要 具 益 乌 生 强 主 含 蒽 醌 、 苯 乙 烯 苷 类 化 合 物 和 卵磷 脂 等 活 性 成 分 ’ 。我 们 以 二 何 首 乌 为 材 料 ， 用 Ｒ —Ｃ 采 ＴＰ Ｒ技 术 克 隆 其 Ｂ Ｓ基 因 ， 进 行 序 列 Ａ 并
其 基 因 。 结果 从 何 首 乌 叶 ｃ Ｎ 中克 隆 出 了长 度 为 １ ４ ｐ的 基 因 片段 。 序 列 分 析 表 明 该 片段 具 有 典 型 的 Ｃ Ｓ基 因 Ｄ Ａ ９ｂ ０ Ｈ
木姜叶柯查尔酮合酶基因的克隆及在合成生物学的应用
木姜叶柯查尔酮合酶基因的克隆及在合成生物学的应用目录1.内容概要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．21.1 研究背景．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2 1.2 研究意义．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．31.3 文献综述．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．42.材料与方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．62.1 材料来源．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7 2.2 实验设计．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8 2.3 基因克隆．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．9 2.3.1 DNA提取与纯化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．102.3.2 引物设计与合成．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．113.木姜叶柯查尔酮合酶基因序列分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．123.1 序列同源性分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13 3.2 结构域分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．143.3 功能域预测．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．164.木姜叶柯查尔酮合酶基因的表达与活性．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．174.1 表达载体的构建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．18 4.2 重组蛋白的表达与纯化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．194.3 查尔酮合酶活性的检测．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．205.合成生物学应用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．225.1 查尔酮类化合物的生物合成．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．225.2 基因编辑与功能优化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．245.3 基于查尔酮合酶的代谢工程．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．256.结果与讨论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．266.1 基因克隆与序列分析结果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．286.2 表达与活性结果分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．296.3 合成生物学应用结果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．291. 内容概要木姜叶柯查尔酮合酶基因的克隆及在合成生物学的应用这一研究领域，主要探讨了如何通过现代分子生物学技术手段，从木姜叶柯（一种具有重要药用价值的植物）中分离并克隆出负责合成查尔酮的关键酶——查尔酮合酶基因。
何首乌蒽醌生物合成途径功能基因的克隆与遗传转化体系的建立
行 比较分 析 ， 发现 Ｐ ＨＳ含 有 Ｐ ｅ１ ， 测其 能 够 催 化 聚酮 的合 成 反应 。何 首乌 Ｃ ｍＣ ｈ２５ 推 ＨＳ与 其
它植 物 Ｃ Ｓ的氨 基酸 序 列 的进化 分析 表 明 ， 与 同 为蓼 科 的虎 杖 和 掌 叶大 黄 的 同源 性 较 近 。 Ｈ 其
何首乌查尔酮合成酶基因的成功克隆为何首乌植物 中蒽醌类有效成分的基 因工程等研究打下
０ １ ｇ ｍｇ ０ ０ ７ ， ．８￣ ／ （ ．０ ％） ．７￣ ／ （ ． １ ％）０ ０ ｇ ｍｇ ０ ０ ８ 。实验 结果 表 明诱 导 叶愈伤 组 织 的方法 有 助 于
在 短 时间 内获得 含量较 高 的大 黄素 和大 黄 酚。这对 后续 的植 物组织 培 养工作 开辟 了一 条新 的
・ 作者简介 ： 廖海， 。 男 副教授 。
・
３ ・ ２
基 础 研究
２ １ 年 第 １期 ０１
分 析表 明该 片段具 有 典 型 的 Ｃ ＨＳ基 因家 族 的结构 域 ， 为何 首 乌 的 Ｃ Ｓ基 因 片段 ， 名 为 Ｐ Ｈ 命 ｍ．
Ｃ 。将 得到 的序 列 提交 ＧｅＢ ｎ ， 列 号 为 Ｆ ６ １ ８ 。对 获 得 的 Ｐ ＨＳ的 氨基 酸 序 列 进 ＨＳ ｎ ａｋ 序 Ｊ０６ ５ ｍＣ
思路 。
３ 克 隆 了何 首乌 、 明蒽醌 合 成途 径 中的若 干功 能基 因。 、 决 Байду номын сангаас
查 尔酮 合成 酶 系是 聚酮合 成 酶家族 中与蒽醌 生 物合 成 相关 的一 类重 要 酶 ， 活性 的高低 其
往 往 与蒽醌 的 含量呈 正相 关 。
以何 首乌 叶为材 料 ， 利用 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｒ和 ３ 一Ｒ Ｃ Ｃ ‘ Ａ Ｅ技术 ， 从何 首 乌 叶中克 隆 出了蒽 醌生 物 合成 途径 的关 键酶 “ 查尔 酮合 成酶 ” 的基 因 ， 隆到 的查尔 酮合 成 酶基 因长度 为 １５ ｂ 。序 列 克 ２ ８ｐ
延胡索去甲乌药碱合成酶基因CyNCS1克隆及其表达模式分析
第52卷 第3期2024年3月西北农林科技大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y(N a t .S c i .E d .)V o l .52N o .3M a r .2024网络出版时间:2023-09-01 16:45 D O I :10.13207/j .c n k i .jn w a f u .2024.03.015网络出版地址:h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1390.S .20230901.0826.001延胡索去甲乌药碱合成酶基因C yN C S 1克隆及其表达模式分析[收稿日期] 2023-03-14[基金项目] 陕西省重点产业创新链(群)项目(2022Z D L S F 05-03);陕西省中医药管理局专项(2021-Q Y Z L -02);陕西省科技厅一般项目(青年)(2023-J C -Q N -0944,S 2023-J C -Q N -0932) [作者简介] 冯飞雪(1986-),女,陕西咸阳人,副主任技师,博士,主要从事药用植物分子生物学研究㊂E -m a i l :f e i x u e 0422@126.c o m[通信作者] 李依民(1985-),女,陕西咸阳人,副教授,博士,主要从事中药资源评价与利用研究㊂E -m a i l :2051058@s n t c m.e d u .c n 张 岗(1981-),男,陕西咸阳人,教授,博士,主要从事中药资源与分子生药学研究㊂E -m a i l :j a y _g u m l i n g 2003@a l i yu n .c o m 冯飞雪a ,b ,吕瑞华b ,李依民c ,高 静c ,王 凯a ,b,周嘉迪a ,b ,颜永刚c ,张 岗c(陕西中医药大学a 附属医院,b 医学技术学院,c 药学院/陕西省中医药管理局 秦药 研发重点实验室,陕西咸阳712046)[摘 要] ʌ目的ɔ克隆延胡索去甲乌药碱合成酶(n o r c o c l a u r i n e s yn t h a s e ,N C S )基因,分析其在延胡索异喹啉类生物碱合成中的关键作用㊂ʌ方法ɔ基于转录组数据库,利用逆转录P C R 克隆延胡索C yN C S 1基因及其启动子区域序列,采用生物信息学方法分析其编码蛋白的理化性质㊁结构特征及其启动子区域顺式作用元件,同时进行多序列比对和系统进化树分析,确定其进化关系;利用实时荧光定量P C R 对其根㊁茎㊁叶及发育早㊁中㊁晚期块茎的组织表达模式进行分析;对茉莉酸甲酯(M e J A )㊁脱落酸(A B A )处理0,4,8,12h 的叶片进行表达谱分析,以体积分数75%酒精溶剂处理为对照(C K ),确定该基因的表达特征㊂ʌ结果ɔC yN C S 1基因开放读码框长873b p ,编码291个氨基酸,编码蛋白分子量为33.09k u ,等电点为6.90,具有去甲乌药碱合成酶保守的催化结构域(G D G G V G T V /I L ㊁Y K E K F 和M I E G G H L D MG ),且不含信号肽,预测定位于细胞核中㊂多序列比对结果显示,C y N C S 1与石生黄堇㊁罂粟的N C S 蛋白同源性较高,分别为83.6%和82.1%;系统进化树结果显示,C y N C S 1与石生黄堇C s N C S 蛋白聚为一支,说明二者亲缘关系较近㊂该基因启动子区长2238b p,包含多种植物激素及低温㊁热胁迫等环境因子的顺式作用元件㊂实时荧光定量P C R 结果显示,随着发育推进块茎中C y N C S 1的表达量显著增高,且受到M e J A 和A B A 的诱导,M e J A 处理8h 时表达量为0h 的3.10倍,A B A 处理8h 为0h 的3.16倍;而对照C yN C S 1表达量随时间推移无明显变化㊂ʌ结论ɔ克隆并鉴定了延胡索N C S 酶基因C yN C S 1,明确了其在发育进程中的表达模式,并确定该基因表达受M e J A 和A B A 的诱导㊂[关键词] 延胡索;去甲乌药碱合成酶;异喹啉生物碱;启动子;顺式作用元件[中图分类号] S 567.23+9[文献标志码] A[文章编号] 1671-9387(2024)03-0146-09C l o n i n g a n d e x p r e s s i o n a n a l y s i s o f n o r c o c l a u r i n e s yn t h a s e (N C S )g e n e i n C o r yd a l i s y a n h u s u o F E N G Fe i x u e a ,b,L ÜR u i h u a b ,L I Y i m i n c ,G A O J i n g c ,WA N G K a i a ,b,Z H O U J i a d i a ,b ,Y A N Y o n g g a n g c ,Z H A N G G a n gc(a A f f i l i a t e d H o s p i t a l ,b C o l l e g e o f M e d i c a l T e c h n o l o g y ,c K e y L a b o r a t o r y f o r R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t o fQ i n M e d i c i n e o f S h a a n x i A d m i n i s t r a t i o n o f C h i n e s e M e d i c i n e ,C o l l e g e o f P h a r m a c y ,S h a a n x i U n i v e r s i t y o f C h i n e s e M e d i c i n e ,X i a n y a n g ,S h a a n x i 712046,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h e n o r c o c l a u r i n e s y n t h a s e (N C S )g e n e f r o m C o r yd a l i s y a n h u s u o w a s c l o ne dt o i d e n t i f y i t s k e y r o l e i n t h e s y n t h e s i s o f c o r y d a l i s a l k a l o i d s.ʌM e t h o dɔB a s e d o n t h e t r a n s c r i p t o m e d a t a-b a s e,t h e O R F r e g i o n o f C y N C S1g e n e w a s c l o n e d b y q u a n t i t a t i v e r e a l-t i m e P C R t e c h n o l o g y a n d b i o i n f o r-m a t i c s m e t h o d s w e r e u s e d t o a n a l y z e i t s p h y s i c a l a n d c h e m i c a l p r o p e r t i e s a n d s t r u c t u r a l f e a t u r e o f t h e e n c o-d e d p r o t e i n.M u l t i p l e s e q u e n c e a l i g n m e n t a n d p h y l o g e n e t i c t r e e a n a l y s i s w e r e p e r f o r m e d.F i n a l l y,t h e e x-p r e s s i o n p a t t e r n o f C y N C S1i n d i f f e r e n t t i s s u e s i n c l u d i n g r o o t,s t e m,l e a f a n d t u b e r s i n d e v e l o p m e n t s t a-g e s o f e a r l y t u b e r,m i d d l e t u b e r a n d l a t e r t u b e r,a s w e l l a s i t s e x p r e s s i o n i n l e a v e s t r e a t e d b y m e t h y l j a s-m o n a t e(M e J A)a n d a b s c i s i c a c i d(A B A)f o r0,4,8a n d12h o u r s w e r e a n a l y z e d b y q u a n t i t a t i v e r e a l-t i m e P C R.ʌR e s u l tɔT h e O R F o f C y N C S g e n e w a s873b p i n l e n g t h,e n c o d i n g291a m i n o a c i d s,w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t o f33.09k u a n d a n i s o e l e c t r i c p o i n t o f6.90.T h e e n c o d e d p r o t e i n h a d a c o n s e r v e d c a t a l y t i c d o m a i n o f N C S(G D G G V G T V/I L,Y K E K F a n d M I E G G H L D MG)w i t h o u t s i g n a l p e p t i d e a n d i t w a s l o c a t e d i n t h e n u c l e u s.T h e m u l t i p l e s e q u e n c e a l i g n m e n t s h o w e d t h a t C y N C S1h a d h i g h h o m o l o g y o f83.6%a n d82.1% w i t h N C S p r o t e i n s o f C o r y d a l i s s a x i c o l a a n d P a p a v e r s o m n i f e r u m,r e s p e c t i v e l y.T h e p h y l o g e n e t i c t r e e s h o w e d t h a t C y N C S1a n d C s N C S p r o t e i n s w e r e c l u s t e r e d t o g e t h e r.T h e p r o m o t e r r e g i o n c o n t a i n e d c i s-a c t-i n g e l e m e n t s t h a t r e s p o n d e d t o e n v i r o n m e n t a n d p l a n t h o r m o n e s.E x p r e s s i o n p a t t e r n a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n o f C y N C S1i n c r e a s e d w i t h t u b e r d e v e l o p m e n t a n d w a s s i g n i f i c a n t l y i n d u c e d b y M e J A a n d A B A(P<0.05).T h e e x p r e s s i o n l e v e l o f C y N C S1i n t h e M e J A t r e a t m e n t a t8h w a s3.10t i m e s o f t h a t a t 0h,a n d t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f C y N C S1i n t h e A B A t r e a t m e n t a t8h w a s3.16t i m e s o f t h a t a t0h.T h e C y N C S1e x p r e s s i o n l e v e l s i n t h e c o n t r o l s h o w e d n o s i g n i f i c a n t c h a n g e s o v e r t i m e.ʌC o n c l u s i o nɔC y N C S1 g e n e w a s c l o n e d,i t s e x p r e s s i o n p a t t e r n d u r i n g d e v e l o p m e n t w a s v e r i f i e d,a n d t h e i n d u c t i o n b y M e J A a n d A B A w a s c o n f i r m e d.K e y w o r d s:C o r y d a l i s y a n h u s u o W.T.W a n g;n o r c o c l a u r i n e s y n t h a s e;i s o q u i n o l i n e a l k a l o i d;p r o m o t e r;c i s-a c t i n g e l e m e n t异喹啉生物碱是一类具有重要药理作用的次生代谢产物,包括有止痛麻醉作用的吗啡㊁肌肉松弛剂罂粟碱以及有抗菌作用的黄连碱等,主要存在于罂粟科㊁毛茛科㊁木兰科㊁小檗科以及马兜铃科植物中㊂异喹啉生物碱的合成途径(图1)从2种酪氨酸衍生物的缩合开始[1],在去甲乌药碱合成酶(n o r c o c l a u-r i n e s s y n t h a s e,N C S)作用下催化形成去甲乌药碱,随后在6-氧甲基转移酶(6-O-m e t h y l t r a n s f e r a s e,6-OMT)作用下形成乌药碱,然后在乌药碱-N-甲基转移酶(c o c l a u r i n e-N-m e t h y l t r a n s f e r a s e,C NMT)作用下合成N-甲基乌药碱,接着在N-甲基乌药碱-3 -羟化酶(N-m e t h y l c o c l a u r i n e-3 -h y d r o x y l a s e,NM C H)催化下形成3 羟基-N-甲基乌药碱,再在3 -羟基-N-甲基乌药碱-4 -氧甲基转移酶(3 -h y d r o x y-N-m e t h y l c o c l a u r i n e-4 -O-m e t h y l t r a n s f e r a s e,4 -O M T)作用下形成牛心果碱,牛心果碱在小檗碱桥连酶(B e r-b e r i n e b r i d g e e n z y m e,B B E)作用下合成金黄紫堇碱;牛心果碱和金黄紫堇碱是大部分生物碱的中间及普遍的前体物质㊂随后,二者在不同植物中经一系列酶催化,最终形成多种不同的异喹啉生物碱化合物㊂延胡索(C o r y d a l i s y a n h u s u o W.T.W a n g)是罂粟科(P a p a v e r a c e a e)紫堇属(C o r y d a l i s)一种多年生草本植物,其干燥块茎为我国传统中药,历版‘中国药典“[2]均有收载, 其味辛㊁苦,性温㊂有活血㊁行气㊁止痛的功效㊂ 延胡索又称元胡,主产于陕西㊁浙江㊁河南㊁山东等地;陕西是其主要产区,故延胡索也被列为十大秦药之一[3]㊂延胡索具有显著的镇痛㊁镇静㊁催眠㊁抗心肌缺血㊁抗溃疡㊁抗肿瘤㊁抗氧化㊁抗焦虑以及抑制癫痫发作等多种功效,对冠心病㊁心律失常和胃溃疡等多种疾病有较好的临床效果[4-5]㊂目前,研究人员从延胡索中已分离鉴定出110余种化学成分,包括生物碱㊁甾体类㊁有机酸㊁糖类㊁延胡索酸等[6]㊂其中主要化学成分为异喹啉类生物碱,并以延胡索乙素作为标志性成分㊂近年来,随着基因组及功能基因组学研究的快速发展,罂粟科植物罂粟中吗啡类生物碱[7]㊁博落回中苄基异喹啉生物碱[8]以及紫金龙中异喹啉生物碱[9]的合成途径已被初步描绘,其中大部分关键酶基因也被鉴定㊂整合转录组和代谢组以及基因功能研究揭示了延胡索中生物碱类化合物合成途径中的部分关键酶基因,如T y D C㊁NM C H㊁C y O MT s等,并证实它们与苄基741第3期冯飞雪,等:延胡索去甲乌药碱合成酶基因C y N C S1克隆及其表达模式分析异喹啉类生物碱合成相关[10-12]㊂这些研究推动了延胡索乙素以及延胡索中异喹啉生物碱合成途径的解析工作㊂图中*标记基因为本研究克隆,下划线标记基因源于文献报道A s t e r i s k m a r k s t h e g e n e c l o n e d i n t h i s s t u d y a n d u n d e r l i n e d g e n e s w e r e r e po r t e d i n p r e v i o u s r e s e a r c h e s 图1 延胡索中异喹啉生物碱的合成途径示意图F i g .1 S y n t h e t i c p a t h w a y o f i s o q u i n o l i n e a l k a l o i d s i n C o r yd a l i s y a n h u s u o 去甲乌药碱合成酶(N C S )是异喹啉生物碱合成途径中第1个关键酶,可催化合成植物中所有异喹啉类生物碱的重要前体去甲乌药碱,在苄基异喹啉类生物碱合成中极其重要㊂但关于延胡索中的N C S 基因序列及其功能还未见报道㊂因此本研究克隆了延胡索中的去甲乌药碱合成酶基因C yN C S 1,并对其编码蛋白进行生物信息学分析,检测该基因在不同组织及块茎发育时期,以及茉莉酸甲酯(M e J A )和脱落酸(A B A )处理下的表达模式,以期为深入研究C y N C S 1基因功能及阐明延胡索异喹啉生物碱合成途径奠定基础㊂1 材料与方法1.1 材 料延胡索植株种植于陕西中医药大学药用植物园,由陕西中医药大学药学院王继涛高级实验师鉴定为罂粟科㊁紫堇属植物延胡索(C .ya n h u s u o W.T.W a n g)㊂R N A 提取试剂R N A i s o P l u s㊁反转录试剂盒O n e s t e p RT -P C R k i t ㊁T -V e c t o r p M D T M19(S i m -p l e )和E x P r e m i e r T MD N A P o l ym e r a s e ,均购自T a K a R a 公司;G e n o m e W a l k e r T MU n i v e r s a l K i t 试剂盒购自C l o n t e c h 公司;C T A B 试剂购自北京索莱宝科技有限公司㊂1.2 试验设计选择新鲜㊁健康的延胡索植株,收集根㊁叶㊁茎及发育早期(茎节处膨大约1c m ,标记为T u b e r E )㊁中期(块茎迅速增长,膨大约3c m ,标记为T u b e r M )和晚期(块茎成熟,颜色褐化,标记为T u b e r L )的块茎组织,洗净泥土,液氮速冻㊂用体积分数75%乙醇作为溶剂配制50mm o l /L 茉莉酸甲酯(M e J A )和100mm o l /L 脱落酸(A B A )溶液,喷施萌发75d 的延胡索幼苗,于0,4,8和12h 后收集叶片,以喷施体积分数75%乙醇841西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷溶液的幼苗叶片为对照(C K ),液氮速冻,于-80ħ冻存备用,每组5个生物学重复㊂采用R N A 提取试剂R N A i s o P l u s 和反转录试剂盒O n e s t e p RT -P C R k i t ,对上述所有样品进行R N A 提取及反转录,获得的c D N A 保存于-20ħ冰箱备用㊂采用改良C T A B 法[13]提取延胡索叶片基因组D N A ,-20ħ冰箱保存备用㊂1.3 C yN C S 1基因克隆以在N C B I 数据库中搜索的罂粟㊁唐松草N C S序列作为种子序列,在延胡索转录组数据库(数据未公开)中进行B l a s t 比对,筛选出3条N C S 转录本序列,分别标记为N C S 1㊁N C S 2㊁N C S 3,其中N C S 1与N C S 2序列基本相同,而N C S 3序列不具有完整典型的N C S 酶催化位点序列,因此,设计C yN C S 1开放读码框(O R F )上下游引物(表1),以延胡索晚期块茎的c D N A 为模板扩增C yN C S 1的O R F 序列㊂反应体系25μL :12.5μL E x P r e -m i e r T MD N A P o l ym e r a s e (2ˑ),2μL c D N A 模板,1μL C y N C S 1-F (10mm o l /L ),1μL C y N C S 1-R (10mm o l /L ),8.5μL d d H 2O ㊂反应程序为:95ħ预变性5m i n ;95ħ变性30s ,56ħ退火30s ,72ħ延伸55s ,35个循环;72ħ延伸10m i n ㊂P C R 扩增产物经胶回收与T -V e c t o r p M D T M19(S i m pl e )连接转化大肠杆菌(E .c o l i )D H 5α,送至北京擎科生物科技有限公司测序㊂表1 本研究所用引物序列T a b l e 1 P r i m e r s e q u e n c e s f o r P C R a n a l y s i s i n t h i s s t u d y引物名称N a m e o f p r i m e r引物序列(5'ң3')P r i m e r s e qu e n c e (5'ң3') 扩增片段长度/b pA m pl i f i c a t i o n s i z e C y N C S 1-F A T C A A C A C T T T A T G G C A A T873C yN C S 1-R C G T A T T G A T A C G A T C A T GA P 1G T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G C -pN C S 1-G S P 1G C A A G T A A G T A A C G G A C T T A G C A G A C A P 2A C T A T A G G G C A C G A G T G G T1300pN C S 1-G S P 2G T A G A T G T C A T G T C G T T T C A G T A T G G A G C A β-A c t i n -F T G C C C G A T G G T C A A G T T A T C 158β-A c t i n -R G G A T T C C T G C A G C T T C C A T T Cq N C S 1-F G G C A T C A C G T T A C T C G T C G G A T A163qN C S 1-R C G T G A C G T T A G G A C G T A G A C G C1.4 C y N C S 1基因编码蛋白的生物信息学分析利用D N AMA N 分析C y N C S 1编码氨基酸序列的组成和理化性质㊂用S i gn a l P 和T MHMM 分析蛋白的信号肽及跨膜结构域;运用B U S C A 预测蛋白的亚细胞定位㊂利用S O P MA 和S W I S S -MO D E L 分析预测蛋白质的二级㊁三级结构;利用在线工具C l u s t a l W 2(h t t p://w w w.e b i .a c .u k /)进行氨基酸序列的同源性比对;运用M E G A 11.0软件采用邻接法(N e i g h b o u r -j o i n i n g )构建植物N C S 蛋白进化树㊂1.5 C yN C S 1启动子区的克隆及序列分析按照G e n o m e W a l k e r T MU n i v e r s a l K i t 试剂盒说明书,用限制性内切酶E c o R V ㊁P v u Ⅱ㊁S t u Ⅰ和D r a Ⅰ消化延胡索基因组D N A ,将得到的酶切反应物与基因组步移接头相连,构建延胡索g D N A 步移文库㊂根据延胡索C y N C S 1基因序列设计步移引物p N C S 1-G S P 1和p N C S 1-G S P 2,分别和接头引物A P 1㊁A P 2进行两轮巢式P C R 反应㊂第一轮反应体系为:25μL E x P r e m i e r T MD N A P o l ym e r a s e (2ˑ),5μL g D N A ,1μL p N C S 1-G S P 1(10mm o l /L ),1μL A P 1(10mm o l /L ),18μL d d H 2O ;反应程序为95ħ预变性5m i n ;95ħ变性30s ,57ħ退火30s ,72ħ延伸120s ,35个循环;72ħ延伸10m i n㊂第二轮反应体系为:25μL E x P r e m i e r T MD N A P o l y-m e r a s e (2ˑ),5μL 第一轮P C R 反应产物,1μLpN C S 1-G S P 2(10mm o l /L ),1μL A P 2(10mm o l /L ),18μL d d H 2O ;反应程序与第一轮同㊂将两次P C R 扩增产物送至北京擎科生物科技有限公司进行测序㊂利用在线工具P l a n t -C A R E 数据库(h t t p ://b i o i n f o r m a t i c s .p s b .u ge n t .b e /w e b t o o l s /p l a n t c a r e /h t m l )分析延胡索C yN C S 1基因启动子区的顺式作用元件㊂1.6 C yN C S 1基因的表达模式分析以1.2节提取的延胡索各组织及处理c D N A 为模板,β-A c t i n 基因设为内参,通过实时荧光定量P C R 检测不同样品中C y N C S 1基因的表达量㊂反应体系20μL :10μL S Y B R G r e e n ⅡP r e m i x E xT a q ,5μL 稀释50倍的c D N A 模板,3μL d d H 2O ,上下游引物(表1)各1μL (10mm o l /L );反应程序为:95ħ预变性10m i n ;95ħ变性15s ,60ħ反应1941第3期冯飞雪,等:延胡索去甲乌药碱合成酶基因C yN C S 1克隆及其表达模式分析m i n ,循环40次㊂每种样品3个重复,采用2-ΔΔC t法统计相对表达量[14]㊂2 结果与分析2.1 C yN C S 1基因的克隆根据延胡索转录组数据库中的序列信息,采用C y N C S 1-F /C yN C S 1-R 对延胡索晚期块茎c D N A 模板进行P C R 扩增,电泳检测可见一条约900b p 的条带(图2)㊂1,2.C yN C S 1基因O R F 区域扩增条带;M.D N A L a d d e r D L 20001,2.O R F o f C yN C S 1a m p l i f i e d f r o m c D N A ;M.D N A L a d d e r D L 2000图2 C yN C S 1基因扩增结果F i g .2 P C R a m p l i f i c a t i o n o f C yN C S 1g e n e 将条带回收克隆㊁测序,经B l a s t 比对发现,该序列与石生黄堇C s N C S (C o r yd a l i s s a x i c o l a ,A E B 71889.1)的一致性较高(77.9%),故将其命名为延胡索N C S 1基因(C yN C S 1,G e n B a n k 登录号:O N 755158)㊂2.2 C yN C S 1编码蛋白的理化性质分析序列分析表明,C y N C S 1O R F 长873b p,编码291个氨基酸㊂C yN C S 1编码蛋白分子量为33.09k u ,等电点为6.90㊂该蛋白质含有45个碱性氨基酸(15.5%),出现频率较高的氨基酸依次为缬氨酸(11.0%)㊁丝氨酸(9.0%)和异亮氨酸(9.0%)㊂该蛋白的稳定指数为43.73,提示该蛋白在细胞内属于不稳定蛋白㊂S i g n a l P 预测发现C yN C S 1蛋白不存在信号肽结构,属于非分泌蛋白㊂B U S C A 预测亚细胞定位结果显示,C y N C S 1蛋白定位于细胞核内㊂二级结构分析显示,C yN C S 1主要由α-螺旋㊁延伸链和无规则卷曲构成,其占比分别为36.21%,30.34%和28.62%㊂C y N C S 1蛋白质的三级结构同源建模结果表明,其氨基酸序列与模板蛋白序列(拟南芥(S )-去甲乌药碱合成酶(2v q5.1)[15])的相似度为53.01%,其中第20~182位氨基酸模型覆盖率达98.00%(图3)㊂图3 C yN C S 1蛋白三级结构预测F i g .3 P r e d i c t i o n o f t e r t i a r y s t r u c t u r e o f C yN C S 1p r o t e i n 2.3 C yN C S 1基因多序列比对与进化树分析运用C l u s t a l W 2分析C yN C S 1与其他N C S 蛋白之间的同源性㊂比对结果(图4)显示,C y N C S 1蛋白与石生黄堇(C o r yd a l i s s a x i c o l a ,A E B 71889.1)㊁罂粟(P a p a ve r s o m n i fe r u m ,A C I 45396.1)㊁桃儿七(S i n o p o d o p h yl l u m h e x a n d r u m ,A I T 42265.1)㊁大麻(C a n n a b i s s a t i v a ,K A F 4388932.1)和黄唐松草(T h a l i c t r u m f l a v u m ,A C O 90247.1)的N C S 蛋白同源性分别为83.6%,82.1%,80.7%,76.8%和75.2%,表明N C S 基因在植物中较为保守㊂C yN C S 1含有保守结构区(30-154位,188-254位)及底物结合与催化活性区G D G G V G T V /I L (69-77位)㊁Y K E K F (90-94位)和M I E G G H L D -MG (108-117位)[15-16],表明C yN C S 1可能具有去甲乌药碱合成酶的催化功能㊂利用M E G A 11.0软件,用邻接法构建51西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷C yN C S 1蛋白与10条来自其他植物的N C S 蛋白进化树,结果见图5㊂由图5可见,C yN C S 1蛋白与石生黄堇(C o r yd a l i s s a x i c o l a )的N C S 蛋白(C s N C S ,A E B 71889.1)聚为一支,表明二者亲缘关系最近,与上述结果一致㊂A m.蓟罂粟;P s .罂粟;C s .石生黄堇;S h .桃儿七;T f .黄唐松草;T h .唐松草;C s .大麻;C y.延胡索㊂红色框中为保守催化结构域A m.A r g e m o n e m e x i c a n a ;P s .P a p a v e r s o m n i f e r u m ;C s .C o r y d a l i s s a x i c o l a ;S h .S i n o p o d o ph u l l u m h e x a n d r u m ;T f .T h a l i c t r u m f l a v u m ;T h .T h a l i c t r u m t h a l i c t r o i d e s ;C s .C a n n a b i s s a t i v a ;C y .C o r yd a l i s y a n h u s u o .T he c o n s e r v e d c a t a l y t i c d o m a i n s a r e s h o w n i n r e d b o x e s 图4 C yN C S 1蛋白与其他植物N C S 蛋白序列的比对F i g .4 H o m o l o g y a l i g n m e n t w i t h a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f C yN C S 1a n d o t h e r N C S p r o t e i n s图5 延胡索C yN C S 蛋白进化树分析F i g .5 P h y l o g e n e t i c t r e e a n a l y s i s o f C yN C S p r o t e i n s 2.4 C yN C S 1基因启动子区的顺式作用元件为明确C yN C S 1基因上游调控元件,本研究克隆了长2238b p 的C yN C S 1启动子区序列(G e n -B a n k 注册号:O Q 472261)㊂利用P l a n t -C A R E 数据库分析其顺式作用元件,结果见表2㊂由表2可见,C yN C S 1启动子区含有T A T A b o x 等转录相关元件,还含有应答环境胁迫与多种植物激素的顺式作用元件㊂其中,环境胁迫顺式作用元件包括低温响应元件L T R ㊁厌氧诱导作用元件A R E ㊁热胁迫诱导作用元件H S E ㊁防御和应激反应顺式作用元件T C -r i c h r e p e a t s 以及光响应元件等;植物激素顺式作用元件包括A B A 响应元件A B R E 和M e J A 响应元件T G A C G -m o t i f ㊁C G T C A -m o t i f,以及生长素响应元件T G A -e l e m e n t 等㊂2.5 C yN C S 1基因的表达模式运用实时荧光定量P C R 检测C y N C S 1基因在不同组织部位,尤其是不同发育时期块茎中的表达量,结果见图6-A ㊂图6-A 结果显示,C y N C S 1基因在延胡索根㊁茎㊁叶和块茎中均有表达;并且随着块茎的发育和膨大,C y N C S 1基因的表达量显著升高;块茎发育早期C yN C S 1的相对表达量为12.2ʃ0.49,发育中期㊁晚期分别为27.5ʃ1.01和32.77ʃ1.59,与发育早期相比有显著差异㊂用M e J A 和A B A 处理延胡索幼苗后发现,151第3期冯飞雪,等:延胡索去甲乌药碱合成酶基因C y N C S 1克隆及其表达模式分析C yN C S 1能够响应M e J A 和A B A 的诱导㊂M e J A 处理8h C yN C S 1的表达量是0h 的3.10倍(P <0.01);而对照C K C yN C S 1相对表达量在0~12h 无显著变化㊂A B A 处理4h 时C y N C S 1的表达量为0h 的1.66倍(P <0.05),8h 表达量为0h 的3.16倍(P <0.01)(图6-B )㊂表2 C yN C S 1基因启动子区的顺式作用元件分析T a b l e 2 C i s -e l e m e n t s a n a l y s i s i n C yN C S 1p r o m o t e r r e g i o n 元件名称E l e m e n t n a m e位置/b pL o c a t i o n 序列S e qu e n c e 功能F u n c t i o nA B R E-1514A C G T GA B A 应答元件A B A r e s po n s e e l e m e n t T G A C G -m o t i f-827T G A C GM e J A 应答元件M e J A r e s po n s e e l e m e n t C G T C A -m o t i f -1450C G T C A应答M e J A 的顺式调控元件C i s -r e g u l a t o r y e l e m e n t s i n v o l v e d i n M e J A r e s p o n s e L T R -1136C C G A A A低温应答元件L o w t e m p e r a t u r e r e s po n s e e l e m e n t A R E -147T G G T T T厌氧诱导元件A n a e r o b i c i n d u c e d e l e m e n tH S E-1034T A A A A C T G 热胁迫应答元件H o t s t r e s s r e s po n s e e l e m e n t T C -r i c h r e p e a t s 1065G T T T T C T T A C 防御及胁迫应答元件C i s -a c t i n g e l e m e n t s i n d e f e n s e a n d s t r e s s r e s p o n s e s L AM P -e l e m e n t -330C T T T A T C A 光响应元件L i g h t r e s po n s e e l e m e n t B o x Ⅲ-1213A T C A T T T T C A C T蛋白结合位点P r o t e i n b i n d i n g si t e T A T A b o x83T A T A核心启动区C o r e p r o m o t e rP y -r i c h s t r e t c h -332T T T C T T C T C T 高转录调控顺式作用元件C i s -e l e m e n t s w i t h h i g h t r a n s c r i p t l e v e l s C A T -b o x-881G C C A C T 分生组织相关的顺式作用元件分析C i s -r e g u l a t o r y e l e m e n t s a s s o c i a t e d w i t h m e r i s t e m e x p r e s s i o n T G A -e l e m e n t -1082A A C G A C生长素应答元件A u x i n r e s po n s e e l e m e n t G C -m o t i f-122C C C C C G氧特异性应答增强子E n h a n c e r s i n v o l v e d i n h y p o x i a -s p e c i f i c i n d u c t i o n A T -r i c h e l e m e n t980A T A G A A A T C A A 富含A T 的D N A 结合蛋白结合位点B i n d i n g s i t e o f A T -r i c h D N A -b i n d i n g pr o t e i n (A T B P -1)G A -m o t i f -532A A A G A T G A光响应元件L i g h t r e s po n s e e l e m e n t B o x Ⅰ-1199T T T C A A A 光响应元件L i g h t r e s po n s e e l e m e n t A C E935G A C A C G T A T G 光响应元件L i g h t r e s po n s e e l e m e n t B o x 41547A T T A A T 光响应元件L i g h t r e s po n s e e l e m e n t G -b o x1231T A C G T G光响应元件L i g h t r e s po n s e e l e m e nt A 中*表示与块茎早期相比的差异显著性;B 中*表示与处理0h 相比的差异显著性;其中*表示差异显著(P <0.05),**表示差异极显著(P <0.01)*i n P a n e l A s h o w s s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n T u b e r M a n d T u b e r L c o m pa r e d w i t h T ub e r E ,a n d *i n P a n e l B s h o w s s i g n i f ic a n td i f fe r e n c e s i n c o m pa r i s o n w i t h 0h .*i n d i c a t e s P <0.05a n d **i n d i c a t e s P <0.01图6 C yN C S 1基因在不同组织(A )及M e J A ㊁A B A 处理(B )下的表达模式分析F i g .6 E x p r e s s i o n p a t t e r n o f C yN C S 1i n d i f f e r e n t t i s s u e s (A )a n d u n d e r M e J A a n d A B A t r e a t m e n t s (B )3 讨 论延胡索中含有大量活性生物碱,如原阿片碱㊁小檗碱㊁延胡索乙素等,这些生物碱是其行使镇痛㊁解痉㊁抗炎主要药效的基础㊂N C S 作为延胡索异喹啉类生物碱合成中的第1个关键酶,其表达量直接影响异喹啉类生物碱的产量㊂目前,通过基因工程调控药用植物次生代谢产物生物合成,已成为药用植251西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷物研究的新热点㊂从分子水平研究生物合成的关键基因及其调控策略,从而提高次生代谢产物生成量,成为解决药用植物药效成分生成含量低的有效途径㊂近年来,N C S基因在唐松草㊁罂粟㊁岩黄连及其他黄连属植物中被陆续报道,并已验证N C S具有催化生成去甲乌药碱的功能[7,17-18]㊂本研究获得的延胡索C y N C S1基因O R F区域长873b p,编码291个氨基酸㊂该编码蛋白具有保守的S-去甲乌药碱合成酶的底物结合与催化活性区[15-16,19],推测C y N C S1具有S-去甲乌药碱合成酶的催化功能㊂且延胡索N C S酶的催化腔有一定程度的变异,在序列比对中发现了E105(替换Y108)㊁I128(替换Y131)㊁Y139和K100(替换E103),这种变异使催化底物具有多样性和灵活性,可能是罂粟科植物适应环境进化的结构基础[14,20-21]㊂C y N C S1基因编码蛋白与罂粟科植物N C S基因的编码蛋白在保守区域和底物催化区域的同源性较高,且C y N C S1蛋白与石生黄堇的N C S蛋白亲缘关系最近,推测延胡索N C S酶与罂粟科植物N C S 酶具有序列及功能的相似性㊂S a m a n a n i等[22]从罂粟中首次分离了N C S酶,并证明它是苄基异喹啉生物碱生物合成中第1个限速酶㊂日本黄连(C o p t i s j a p o n i c a)N C S基因在体外能催化苯乙醛㊁3,4-二羟基苯乙醛及4-羟基苯乙醛与多巴胺缩合,并且沉默C j N C S基因会导致一些喹啉类生物碱含量的降低,表明C j N C S参与日本黄连苄基异喹啉生物碱的生物合成过程[23]㊂由此推测,延胡索N C S参与异喹啉生物碱合成过程,但需进一步体外酶活试验和体内酶基因功能试验验证㊂本研究发现,C y N C S1在根㊁茎㊁叶中均有表达,和博落回N C S基因的表达模式[24]略有不同㊂值得注意的是,块茎中C y N C S1基因表达量随发育时期推进显著提高,这与异喹啉生物碱的积累模式[25]吻合,提示C y N C S1基因可能参与延胡索异喹啉生物碱的合成过程㊂C y N C S1基因启动子区中包含应答环境胁迫和植物激素(M e J A㊁A B A)的作用元件㊂而实时荧光定量P C R显示,C y N C S1基因能够显著响应M e J A和A B A的诱导,与启动子作用元件分析结果一致㊂这可为后续体外合成异喹啉类生物碱过程中,运用植物激素调控N C S基因表达及酶活力提供依据㊂此外,X u等[26]发现,光照强度能影响延胡索中生物碱的积累㊂本研究中C y N C S1的启动子区域中存在大量光响应作用元件,推测光信号也可能通过结合C y N C S1启动子作用元件调控其基因表达,从而影响生物碱的积累㊂这也为光信号参与调控C y N C S1基因表达提供了一些线索㊂综上所述,本研究克隆得到了延胡索去甲乌药碱合成酶基因C y N C S1,并对其进行了序列结构特征与表达模式分析,为后续深入研究C y N C S1基因功能㊁调控策略,以及阐明延胡索异喹啉生物碱生物合成途径提供了理论依据㊂[参考文献][1] F a c c h i n i P J,d e L u c a V.O p i u m p o p p y a n d m a d a g a s c a r p e r i w i n-k l e:m o d e l n o n-m o d e l s y s t e m s t o i n v e s t i g a t e a l k a l o i d b i o s y n-t h e s i s i n p l a n t s[J].P l a n t J o u r n a 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紫草多糖的体外抗氧化活性研究
２］
Ｃｈ ｉＳ Ｇ，Ｋｉ Ｊ ｕ ｇ Ｎ Ｄ，ｅ ｌ Ａｎ ｈ ａ ｕ ｎ ｎ ｓ ｏ ｍ ，Ｓ ｎ ｔ ａ ｔ ｒ ｑ ｉ ｏ ｅ ，Ｃｄ ２ ｈ ｓ ｈ — ｃ ５Ｂ ｐ ｏ ｐ ａ
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（ ６）：２ ． ９１
５］
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何首乌中Ⅲ型PKS基因的克隆和表达
何首乌中Ⅲ型PKS基因的克隆和表达
生书晶;赵树进
【期刊名称】《华南理工大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2010(038)005
【摘要】为利用基因工程技术调控何首乌的次生代谢途径,采用互补DNA末端快速扩增技术以及生物信息学方法,从传统中药材何首乌中克隆到一种Ⅲ型PKS基因FmPKS2(GenBank登录号:GQ984139),其互补DNA全长1498bp,编码392个氨基酸.生物信息学预测其蛋白相对分子质量为43160,等电点为5.85,亲水系数为-0.154,含有几个较强的疏水区域.系统进化树显示,FmPKS2与蓼科植物的查尔酮聚合酶聚类关系最近.该基因在何首乌不同组织中均有表达,其中在块根中表达量最高.【总页数】5页(P144-148)
【作者】生书晶;赵树进
【作者单位】华南理工大学,生物科学与工程学院,广东,广州,510640;广州军区广州总医院,广东,广州,510010
【正文语种】中文
【中图分类】Q94
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花榈木生物碱合成关键酶基因OhpLDC_和OhpCAO1_的克隆与分析
江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２３ꎬ３９(８):１６４６￣１６５７ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ王佳琦ꎬ王㊀欣ꎬ邓小梅ꎬ等.花榈木生物碱合成关键酶基因ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１的克隆与分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２３ꎬ３９(８):１６４６￣１６５７.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２３.０８.００４花榈木生物碱合成关键酶基因ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１的克隆与分析王佳琦ꎬ㊀王㊀欣ꎬ㊀邓小梅ꎬ㊀吴蔼民(华南农业大学林学与风景园林学院ꎬ广东广州５１００００)收稿日期:２０２２￣１０￣２７基金项目:广东省林业科技创新项目(２０１７ＫＪＣＸ０２８)作者简介:王佳琦(１９９８－)ꎬ女ꎬ黑龙江大庆人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事花榈木组学研究ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗａｎｇｊｉａｑｉ１９９０＠１６３.ｃｏｍ通讯作者:吴蔼民ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｗｕａｉｍｉｎ＠ｓｃａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ㊀㊀摘要:㊀花榈木是中国传统中药ꎬ其代谢产物常用于治疗跌打损伤ꎬ具有重要的药用价值ꎬ然而目前人们对花榈木的药用化学成分如生物碱合成并不清楚ꎮ本研究对花榈木不同组织进行了代谢组和转录组学分析ꎬ结果表明花榈木中含有的生物碱大部分属于喹诺里西啶类生物碱(ＱｕｉｎｏｌｉｚｉｄｉｎｅＡｌｋａｌｏｉｄｓꎬＱＡ)ꎮ进一步分析发现ꎬＱＡ生物合成的２个关键酶ꎬ赖氨酸脱羧酶(ＬＤＣ)和铜胺氧化酶(ＣＡＯ)在生物碱合成中起重要作用ꎮ结合花榈木转录组结果对其编码基因克隆ꎬ得到了１２９０ｂｐ㊁２２６８ｂｐＣＤＳ序列ꎬ分别命名为ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１ꎮ生物信息学分析结果表明ꎬＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１编码的蛋白质相对分子质量分别为４.６３ˑ１０４和８.４４ˑ１０４ꎬ均无跨膜区域和信号肽ꎮＯｈｐＬＤＣ编码的氨基酸序列具有保守的底物结合位点Ｐｈｅ３４０ꎬ分析发现ＯｈｐＬＤＣ与豆科植物中的ＬＤＣ基因在进化上具有较近的亲缘关系ꎮＯｈｐＣＡＯ１编码的氨基酸序列中具有保守结构域 ＮＹ￣Ｙ ꎬ以及３个组氨酸保守位点ꎬ与狭叶羽扇豆的ＣＡＯ１亲缘关系最近ꎮ本研究结果为解析花榈木ＱＡ的生物合成途径提供了重要基础ꎮ关键词:㊀花榈木ꎻ喹诺里西啶类生物碱ꎻ赖氨酸脱羧酶ꎻ铜胺氧化酶ꎻ生物信息学中图分类号:㊀Ｓ７９２.９９㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２３)０８￣１６４６￣１２ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｋｅｙｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅｓＯｈｐＬＤＣａｎｄＯｈｐＣＡＯ１ｆｏｒａｌ￣ｋａｌｏｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎＯｒｍｏｓｉａｈｅｎｒｙｉＰｒａｉｎＷＡＮＧＪｉａ￣ｑｉꎬ㊀ＷＡＮＧＸｉｎꎬ㊀ＤＥＮＧＸｉａｏ￣ｍｅｉꎬ㊀ＷＵＡｉ￣ｍｉｎ(ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙａｎｄＬａｎｄｓｃａｐｅＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅꎬＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＧｕａｎｇｚｈｏｕ５１００００ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＯｒｍｏｓｉａｈｅｎｒｙｉＰｒａｉｎｉｓａｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅꎬａｎｄｉｔｓｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓａｒｅｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｔｏｔｒｅａｔｉｎｊｕ￣ｒｉｅｓａｎｄｈａｖｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｍｅｄｉｃｉｎａｌｖａｌｕｅ.ＨｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅｍｅｄｉｃｉｎａｌｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆＯｒｍｏｓｉａｈｅｎｒｙｉＰｒａｉｎꎬｓｕｃｈａｓａｌｋａ￣ｌｏｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎬａｒｅｃｕｒｒｅｎｔｌｙｕｎｃｌｅａｒ.ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｎｄｕｃｔｅｄｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆＯｒ￣ｍｏｓｉａｈｅｎｒｙｉＰｒａｉｎꎬａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｍｏｓｔｏｆｔｈｅａｌｋａｌｏｉｄｓｃｏｎｔａｉｎｅｄｉｎＯｒｍｏｓｉａｈｅｎｒｙｉＰｒａｉｎｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｑｕｉｎｏｌｉｚ￣ｉｄｉｎｅａｌｋａｌｏｉｄｓ(ＱＡ).ＦｕｒｔｈｅｒａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｗｏｋｅｙｅｎｚｙｍｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎＱＡｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎬｌｙｓｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ(ＬＤＣ)ａｎｄｃｏｐｐｅｒａｍｉｎｅｏｘｉｄａｓｅ(ＣＡＯ)ꎬｐｌａｙｅｄｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｓｉｎａｌｋａｌｏｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓ.ＢａｓｅｄｏｎｔｈｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＯｒｍｏｓｉａｈｅｎｒｙｉＰｒａｉｎꎬｔｈｅｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄꎬａｎｄｔｗｏＣＤＳｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ１２９０ｂｐａｎｄ２２６８ｂｐｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄꎬｎａｍｅｄＯｈｐＬＤＣａｎｄＯｈｐＣＡＯ１ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔｓｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｎｃｏｄｅｄｂｙＯｈｐＬＤＣａｎｄＯｈｐＣＡＯ１ｗｅｒｅ４.６３ˑ１０４ａｎｄ８.４４ˑ１０４ꎬａｎｄｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｒｅｇｉｏｎｓａｎｄｓｉｇ￣ｎａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ.ＴｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｅｎｃｏｄｅｄｂｙＯｈｐＬＤＣｈａｄａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｓｕｂｓｔｒａｔｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅＰｈｅ３４０.ＡｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔＯｈｐＬＤＣｈａｄａｃｌｏｓｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈＬＤＣｇｅｎｅｓｉｎｌｅｇｕｍｉｎｏｕｓｐｌａｎｔｓ.Ｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅ￣ｑｕｅｎｃｅｅｎｃｏｄｅｄｂｙＯｈｐＣＡＯ１ｈａｄａｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎ"ＮＹ￣Ｙ"ａｎｄｔｈｒｅｅｈｉｓｔｉｄｉｎｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｓｉｔｅｓ.Ｔｈｅａｍｉｎｏ６４６１ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｅｎｃｏｄｅｄｂｙＯｈｐＣＡＯ１ｈａｄｔｈｅｃｌｏｓｅｓｔｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗｉｔｈｔｈｅＣＡＯ１ｏｆｎａｒｒｏｗ￣ｌｅａｖｅｄｌｕｐｉｎ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｓｔｕｄｙｐｒｏｖｉｄｅａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｂａｓｉｓｆｏｒａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐａｔｈｗａｙｏｆＱＡｉｎＯｒｍｏｓｉａｈｅｎｒｙｉＰｒａｉｎ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ＯｒｍｏｓｉａｈｅｎｒｙｉＰｒａｉｎꎻｑｕｉｎｏｌｉｚｉｄｉｎｅａｌｋａｌｏｉｄｓꎻｌｙｓｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅꎻｃｏｐｐｅｒａｍｉｎｅｏｘｉｄａｓｅꎻｂｉｏｉｎｆｏｒ￣ｍａｔｉｃｓ㊀㊀花榈木(ＯｒｍｏｓｉａｈｅｎｒｙｉＰｒａｉｎ)属于豆科(Ｌｅｇｕ￣ｍｉｎｏｓａｅ)蝶形花亚科(Ｐａｐｉｌｉｏｎｉｄｅａｅ)红豆属(Ｏｒｍｏ￣ｓｉａＪａｃｋｓ.)常绿乔木ꎬ属国家二级重点保护树种[１]ꎮ其种子㊁根㊁茎㊁皮和叶中都含有可入药的化学成分ꎬ具有通经活血的功效ꎮ«全国中草药汇编»记述ꎬ花榈木常以根㊁皮㊁茎及叶入药ꎬ其性味归经为辛㊁温㊁有毒ꎬ具有活血化瘀㊁祛风㊁消肿之功[２]ꎮ多数红豆属树木可入药ꎬ古人常用于治疗跌打损伤㊁风湿关节炎及无名肿痛等ꎬ但具有一定的毒性ꎮ迄今为止ꎬ国内外学者已从红豆属植物中分离㊁鉴定出２００多种化合物ꎬ包括生物碱类㊁黄酮类㊁其他类化合物以及挥发油成分等[３]ꎮ其中很多生物碱类化合物具有影响中枢神经系统的活性ꎬ例如Ｐｏｕｎｙ等[４]发现从红豆树(Ｏｒｍｏｓｉａｈｏｓｉｅｉ)分离得到的生物碱对神经元烟碱型乙酰胆碱α４β２受体具有显著亲和力ꎬ表明红豆属生物碱在治疗中枢神经系统相关疾病方面具有潜在的应用价值[５￣６]ꎮ喹诺里西啶类生物碱(ＱｕｉｎｏｌｉｚｉｄｉｎｅａｌｋａｌｏｉｄｓꎬＱＡ)具有广泛生物活性ꎬ是一类Ｌ￣赖氨酸衍生的生物碱ꎬ具有１７０多种化学结构[７]ꎬ存在于豆科植物槐族(Ｓｏｐｈｏｒｅａｅ)和染料木族(Ｇｅｎｉｓｔｅａｅ)中[８]ꎮＱＡ具有抗肿瘤㊁抗病毒和降糖等多种功能[９￣１０]ꎬ在农业㊁医药和化学中都有潜在的应用价值ꎬ但人们对ＱＡ的生物合成知之甚少[１１]ꎮＱＡ的核心生物合成仍然是一个谜ꎬ迄今为止只已知赖氨酸脱羧酶(ＬＤＣ)和铜胺氧化酶(ＣＡＯ)参与了部分ＱＡ生物合成过程[１２]ꎮＱＡ生物合成途径的第一步ꎬＬＤＣ参与赖氨酸脱羧生成中间产物尸胺(Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ)[１３]ꎮ而ＣＡＯ参与了尸胺的脱氨反应ꎬ产生所有ＱＡ合成的共同途径的中间体哌啶(１￣ｐｉｐｅｒｉｄｅｉｎｅ)[１４]ꎮ接下来四环ＱＡ鹰爪豆碱(Ｓｐａｒ￣ｔｅｉｎｅ)的生物合成一直是植物生物化学中未解决的问题(图１)ꎮＱＡ的研究基本集中在豆科植物羽扇豆属的白羽扇豆(Ｌｕｐｉｎｕｓａｌｂｕｓ)中ꎬ在豆科植物花榈木中还未见有关ＱＡ生物合成的报道ꎮ本研究利用代谢组测序数据ꎬ发现花榈木中含有大量ＱＡꎮ通过对转录组测序数据进行ＷＧＣＮＡ分析ꎬ发现与ＱＡ生物合成高度相关基因ＬＤＣ和ＣＡＯ的转录本ꎮ本研究对这２个基因进行克隆ꎬ并进行了相关生物信息学分析及其在各组织中表达情况分析ꎮＬＤＣ:赖氨酸脱羧酶ꎻＣＡＯ:铜胺氧化酶ꎮ图１㊀喹诺里西啶类生物碱(ＱＡ)生物合成途径Ｆｉｇ.１㊀Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｐａｔｈｗａｙｏｆｑｕｉｎｏｌｉｚｉｄｉｎｅａｌｋａｌｏｉｄｓ(ＱＡ)１㊀材料与方法１.１㊀试验材料试验材料为３年生花榈木ꎬ种植于华南农业大学(中国广州)苗圃中ꎮ分别采摘花榈木的根㊁茎㊁树皮㊁老叶和新叶ꎬ每个部位收集４份样品用于重复试验ꎮ在苗圃采摘时ꎬ采下的样品立即在液氮中冷冻保鲜ꎮ带回实验室后ꎬ将样品一部分在－８０ħ下保存用于ＲＮＡ提取ꎬ另一部分在真空下冷冻干燥用于代谢物提取ꎮ１.２㊀花榈木代谢组分析冻干的样品用研钵和研杵磨成粉末ꎮ每个样品的粉末用８０％的ＨＰＬＣ级甲醇提取过夜ꎬ其中以１μｍｏｌ的白杨素作为内标ꎬ每０ １ｇ样品加入１ｍｌ提取液ꎬ于４ħ下１２０００ｇ离心３０ｍｉｎꎬ将上清液装入样品瓶中ꎬ进行超高效液相色谱质谱分析[１５]ꎮ７４６１王佳琦等:花榈木生物碱合成关键酶基因ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１的克隆与分析１.３㊀花榈木转录组分析将采自同一时期的４份花榈木同一组织样品等质量混合ꎬ委托北京百迈客云科技有限公司提取ＲＮＡ并构建测序文库ꎬ使用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ２０００测序平台进行转录组双末端测序ꎮ经过Ｔｒｉｎｉｔｙ软件组装获得Ｕｎｉｇｅｎｅꎬ并进一步使用ＨＭＭＥＲ软件[１６]与Ｐｆａｍ数据库[１７]比对ꎬ获得Ｕｎｉｇｅｎｅ的注释信息ꎮ１.４㊀花榈木ＱＡ代谢途径关键酶基因筛选根据参考文献中ＱＡ的生物合成代谢通路ꎬ结合数据库注释结果ꎬ筛选出花榈木转录组中与ＱＡ合成相关的Ｕｎｉｇｅｎｅｓꎬ以常用的基因表达水平估算方法中ＦＰ￣ＫＭ(Ｆｒａｇｍｅｎｔｓｐｅｒｋｉｌｏｂａｓｅｍｉｌｌｉｏｎ)值进行表达量统计ꎬ分析相关基因在花榈木不同组织中的表达模式ꎮ１.５㊀总ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ合成将所有收集的样品用液氮磨成粉末ꎬ然后用ＲＮＡｐｒｅｐｐｕｒｅ植物总ＲＮＡ提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司产品]提取总ＲＮＡꎮ使用１％琼脂糖凝胶进行电泳检查ＲＮＡ质量ꎬ并使用Ｎａｎｏ￣Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ 分光光度计(美国ＩＭＰＬＥＮ公司产品)检测ＲＮＡ的纯度和完整性ꎮ用ＴａＫａＲａ反转录试剂盒[ＴａＫａＲａＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ１ｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅ￣ｓｉｓＫｉｔꎬ宝日医生物技术(北京)有限公司产品]将检测合格的总ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡꎮ１.６㊀基因克隆与测序根据前期花榈木转录组数据获得的ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１基因序列ꎬ使用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５.０设计特异引物(表１)ꎬ以花榈木总ｃＤＮＡ为模板ꎬ扩增ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１基因全长ꎮＰＣＲ反应程序为９８ħ预变性３ｍｉｎꎻ９８ħ变性３０ｓꎻ５５ħ退火３０ｓꎻ７２ħ延伸１ ５ｍｉｎꎬ３５个循环ꎻ７２ħ复性５ｍｉｎꎻ１２ħ保存ꎮＰＣＲ扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后ꎬ使用ＤＮＡ回收纯化试剂盒将目的条带切胶回收ꎬ将其连接到ＴＯＰＯ￣ＴＡ克隆载体后转化至大肠杆菌ＤＨ５α菌株ꎬ挑取阳性单菌落进行ＰＣＲ验证ꎬ无误后送北京擎科生物科技有限公司测序ꎮ表１㊀ＰＣＲ引物序列Ｔａｂｌｅ１㊀ＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ引物㊀㊀㊀㊀㊀序列(５ᶄң３ᶄ)ＯｈｐＬＤＣ￣ＦＡＴＧＣＣＴＡＣＡＣＴＡＧＴＴＡＣＴＧＡＧＧＣＡＴＴＣＯｈｐＬＤＣ￣ＲＴＴＡＧＴＴＣＣＧＣＧＣＧＡＴＡＧＧＡＣＴＧＯｈｐＣＡＯ１￣ＦＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＴＴＣＡＧＧＡＡＡＡＡＧＣＯｈｐＣＡＯ１￣ＲＴＣＡＧＡＧＣＴＴＡＧＣＡＡＴＴＡＧＣＣＣＡＴＴＣＴ１.７㊀生物信息学分析将ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１２个基因测序获得的序列结果ꎬ利用ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/ｏｒｆｆｉｎｄｅｒ/)查找开放阅读框(ＯＲＦ)ꎬ及其编码的氨基酸序列ꎮ利用在线工具Ｐｒｏｔｐａｒａｍ(ｈｔｔｐｓ://ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｐｒｏｔｐａｒａｍ/)预测基因编码蛋白质的相对分子质量㊁氨基酸数目㊁等电点㊁不稳定系数等理化性质ꎻ利用在线工具ＤｅｅｐＴＭＨＭＭ(ｈｔｔｐｓ://ｄｔｕ.ｂｉｏｌｉｂ.ｃｏｍ/ＤｅｅｐＴＭＨＭＭ)和ＳｉｇｎａｌＰ６.０(ｈｔｔｐｓ://ｓｅｒｖｉｃｅｓ.ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ.ｄｔｕ.ｄｋ/ｓｅｒｖｉｃｅ.ｐｈｐ?ＳｉｇｎａｌＰ￣６.０)对ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ编码的蛋白质进行跨膜结构和信号肽预测ꎮ利用Ｅｕｋ￣ｍＰＬｏｃ２.０(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｃｓｂｉｏ.ｓｊ￣ｔｕ.ｅｄｕ.ｃｎ/ｂｉｏｉｎｆ/ｅｕｋ￣ｍｕｌｔｉ￣２/)预测蛋白质亚细胞定位ꎮ利用在线工具ＳＯＰＭＡ(ｈｔｔｐｓ://ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ.ｉｂｃｐ.ｆｒ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ/ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ?ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ)分析蛋白质二级结构ꎻ利用ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ网站(ｈｔ￣ｔｐｓ://ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/)预测蛋白质三级结构ꎮ由ＣＬＵＳＴＡＬＷ网站(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｇｅｎｏｍｅ.ｊｐ/ｔｏｏｌｓ￣ｂｉｎ/ｃｌｕｓｔａｌｗ)软件和ＥＳＰｒｉｐｔ３(ｈｔｔｐｓ://ｅｓｐｒｉｐｔ.ｉｂｃｐ.ｆｒ/ＥＳＰｒｉｐｔ/ｃｇｉ￣ｂｉｎ/ＥＳＰｒｉｐｔ.ｃｇｉ)进行氨基酸多序列比对ꎬ并利用ＭＥＧＡ１１.０软件中的邻接法(ＮｅｉｇｈｂｏｒｊｏｉｎｉｎｇꎬＮＪ)进行系统进化树分析[１８]ꎮ１.８㊀表达模式分析使用荧光定量ＰＣＲ仪分析ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ基因在花榈木不同组织中的表达模式ꎮ利用ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０设备进行ｑＲＴ￣ＰＣＲꎬ反应程序设置为９５ħ３ｓꎬ９５ħ５ｓꎬ６０ħ３０ｓꎬ４０个循环ꎮ引物用Ｐｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓ(ｈｔｔｐｓ://ｄｅｖ.ｐｒｉｍｅｒ３ｐｌｕｓ.ｃｏｍ)设计(表２)ꎬ内参基因是ｃ７１５００.ｇｒａｐｈ＿ｃ０ꎮ每个样品分别进行３次重复ꎬ采用２－әＣｔ方法计算相对基因表达量[１９]ꎮ表２㊀实时荧光定量ＰＣＲ引物序列Ｔａｂｌｅ２㊀Ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ引物㊀㊀㊀㊀㊀㊀序列(５ᶄң３ᶄ)㊀㊀㊀㊀ＯｈｐＬＤＣ￣ＦＡＡＣＧＧＡＴＴＣＧＡＴＣＴＣＧＧＣＴＣＯｈｐＬＤＣ￣ＲＡＴＴＴＧＧＧＧＧＴＣＧＴＣＡＴＧＧＡＣＯｈｐＣＡＯ１￣ＦＴＴＣＡＴＧＣＡＧＣＡＡＣＴＣＧＡＧＧＴＯｈｐＣＡＯ１￣ＲＣＡＣＣＡＧＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＯｈｐＣＡＯ２￣ＦＣＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＧＣＡＯｈｐＣＡＯ２￣ＲＡＧＧＡＧＡＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＡＣＴＣｃ７１５００.ｇｒａｐｈ＿ｃ０￣ＦＡＡＴＣＴＴＣＴＡＧＣＣＧＴＧＧＴＧＣＣｃ７１５００.ｇｒａｐｈ＿ｃ０￣ＲＧＣＴＡＧＴＣＧＣＧＣＴＡＧＴＴＧＣＴＡ８４６１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第８期２㊀结果与分析２.１㊀花榈木的代谢组学分析花榈木是一种豆科木本植物ꎬ原产于东南亚和南美洲ꎬ具有巨大的药用价值ꎮ为了更深入研究花榈木ꎬ我们在华南农业大学的田间栽培了一些花榈木ꎬ并收取了３年生植物的５个组织部位ꎬ即根(ＨＲ)㊁茎(ＨＳ)㊁老叶(ＨＯＬ)㊁新叶(ＨＮＬ)和树皮(ＨＢ)ꎮ我们对其进行了基于超高效液相色谱￣串联质谱的广泛的目标代谢组学分析ꎮ在所有样本中有１５３５个显著代谢物被记录下来ꎬ并通过与ＫＥＧＧ㊁ＨＭＤＢ和脂质图数据库的映射ꎬ对代谢物进行了功能注释ꎮ在花榈木中共检测到６种生物碱(表３)ꎬ其中白羽扇豆碱(Ｌｕｐａｎｉｎｅ)㊁１３￣羟基羽扇豆碱(１３ａ￣Ｈｙｄｒｏｘｙｌｕｐａｎｉｎ)㊁鹰爪豆碱(Ｓｐａｒｔｅｉｎｅ)㊁金雀花碱(Ｃｙｔｉｓｉｎｅ)和乙酰金雀花碱(Ａｃｅｔｙｌｃｙｔｉｓｉｎｅ)属于ＱＡꎬ所以本研究主要关注ＱＡ的生物合成ꎬ详细的二级质谱图如图２所示ꎮ表３㊀花榈木不同组织中的生物碱Ｔａｂｌｅ３㊀ＡｌｋａｌｏｉｄｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓｏｆＯｒｍｏｓｉａｈｅｎｒｙｉＰｒａｉｎ名称㊀㊀㊀分子式㊀㊀相对分子质量保留时间(ｍｉｎ)峰面积根茎老叶皮新叶白羽扇豆碱Ｃ１５Ｈ２４Ｎ２Ｏ２４８.１９２.６７４５９０２６６０７４６４１０２６７４４２５５３３８８４４１１８１８７３５６９２８５８７３９００３５６.０１３￣羟基羽扇豆碱Ｃ１５Ｈ２４Ｎ２Ｏ２２６４.１８２.４９９３６９４０８３３５１７５６８９９２８３８１０８７９８２６４５８８７７３３８４５５９６３０４１７.７鹰爪豆碱Ｃ１５Ｈ２６Ｎ２２３４.２１２.６６６５６５３６０１９８３２９０４８６１３７８３６６５２７６８０４１７７９９２５７.３金雀花碱Ｃ１１Ｈ１４Ｎ２Ｏ１９０.１１１３.２３０１２０７２３６８５６４９１０２８８０２３９９５０２５４５９４６８８７６２３９１５１２.９乙酰金雀花碱Ｃ１３Ｈ１６Ｎ２Ｏ２２３２.１２３.４３６９９０７２０３２９１４２７５９２８３５２６５４８１１７６４３６９６１７２８７６６５３.２胡芦巴碱Ｃ７Ｈ７ＮＯ２１３７.０５２.４２８１０１１６８２３１１１８９４４８６１６２５０３６３６６９５１９１５４４７４０８５７１５０７０４３８.２图中０轴以上为数据库中质谱图ꎻ０轴以下为花榈木中检测质谱图ꎮ图２㊀ＱＡ的二级质谱图Ｆｉｇ.２㊀ＴｈｅｓｅｃｏｎｄａｒｙｍａｓｓｓｐｅｃｔｒａｏｆＱＡ２.２㊀花榈木的转录组学分析利用ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉｓｅｑ２０００平台进行测序ꎬ在去除低质量和短的读数后ꎬ总共获得了１.９~２ ４Ｍｂ的干净读数ꎬ共获得９６３０２个Ｕｎｉｇｅｎｅｓꎮ与ＮＲ㊁ｅｇｇ￣ＮＯＧ㊁ＴｒＥＭＢＬ㊁Ｐｆａｍ㊁ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ㊁ＫＥＧＧ㊁ＣＯＧ㊁ＫＯＧ及ＧＯ等９个数据库比对ꎬ确定ＣＤＳ有４７８０９条ꎬ并对９４６１王佳琦等:花榈木生物碱合成关键酶基因ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１的克隆与分析其进行功能注释ꎮ利用Ｒ包ＤＥＳｅｑ２对花榈木５个部位的转录组进行差异基因分析ꎬ共建立了１０个比较组ꎬ分别为ＨＲ与ＨＳ比较组㊁ＨＲ与ＨＢ比较组㊁ＨＲ与ＨＮＬ比较组㊁ＨＲ与ＨＯＬ比较组㊁ＨＢ与ＨＯＬ比较组㊁ＨＮＬ与ＨＯＬ比较组㊁ＨＳ与ＨＯＬ比较组㊁ＨＳ与ＨＮＬ比较组㊁ＨＳ与ＨＢ比较组和ＨＢ与ＨＮＬ比较组ꎮ以ＦＤＲɤ０ ０１且ＦＣȡ２为筛选条件ꎬ１０个比较组差异基因数量分别为５３７４㊁５６３１㊁８７２７㊁９２４３㊁７６３１㊁８８９５㊁９１６４㊁８３３３㊁５２３４和６３１４(图３)ꎬ一共得到１３８４０个差异显著基因(ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎬＤＥＧ)ꎮＨＲ:根ꎻＨＳ:茎ꎻＨＢ:树皮ꎻＨＯＬ:老叶ꎻＨＮＬ:新叶ꎮ图３㊀花榈木根㊁茎㊁树皮㊁老叶和新叶中差异基因的表达火山图Ｆｉｇ.３㊀ＶｏｌｃａｎｏｍａｐｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｇｅｎｅｓｉｎｒｏｏｔｓꎬｓｔｅｍｓꎬｂａｒｋｓꎬｏｌｄｌｅａｖｅｓａｎｄｎｅｗｌｅａｖｅｓｏｆＯｒｍｏｓｉａｈｅｎｒｙｉＰｒａｉｎ㊀㊀为了研究花榈木中与生物碱合成相关转录本ꎬ将所有ＤＥＧ和生物碱进行了ＷＧＣＮＡ分析ꎬＤＥＧ共０５６１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第８期被分为１０个模块ꎬ发现其中棕色模块基因与喹诺里西啶类生物碱基因(ＱＡ)相关性最高ꎬ与５种ＱＡ的相关性都高于０.９(图４Ａ)ꎮ通过ＫＥＧＧ分析ꎬ发现棕色模块基因主要富集在代谢过程中ꎬ包含一些基础代谢途径淀粉和蔗糖代谢(Ｓｔａｒｃｈａｎｄｓｕｃｒｏｓｅｍｅ￣ｔａｂｏｌｉｓｍꎬ编码ＩＤ:ｋｏ００５００)㊁碳代谢(Ｃａｒｂｏｎｍｅｔａｂｏ￣ｌｉｓｍꎬ编码ＩＤ:ｋｏ０１２００)ꎬ还富集到赖氨酸降解(Ｌｙ￣ｓｉｎｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎꎬ编码ＩＤ:ｋｏ００３１０)㊁赖氨酸合成(Ｌｙｓｉｎｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎬ编码ＩＤ:ｋｏ００３００)和吲哚生物碱的生物合成(Ｉｎｄｏｌｅａｌｋａｌｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎬ编码ＩＤ:ｋｏ００９０１)等代谢通路(图４Ｂ)ꎮ分析结果表明花榈木中不同次级代谢物的生物合成可能具有关联性ꎮＡ:每一行表示一个模块ꎬ每一列表示一个生物碱ꎮ行￣列交汇处的每个区块的颜色表示相关程度:深灰色表示高正相关ꎬ浅灰色表示高负相关ꎮＢ:棕色模块差异基因的ＫＥＧＧ富集分析ꎮ图４㊀花榈木喹诺里西啶类生物碱基因(ＱＡ)与差异基因的共表达分析Ｆｉｇ.４㊀Ｃｏ￣ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｑｕｉｎｏｌｉｚｉｄｉｎｅａｌｋａｌｏｉｄｇｅｎｅ(ＱＡ)ａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｇｅｎｅｓｉｎＯｒｍｏｓｉａｈｅｎｒｙｉＰｒａｉｎ１５６１王佳琦等:花榈木生物碱合成关键酶基因ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１的克隆与分析㊀㊀一直以来ＱＡ生物合成的前两步是由ＬＤＣ和ＣＡＯ催化(图１)ꎮ在转录组中发现１个ＬＤＣ和２个ＣＡＯ的转录产物ꎬ其基因分别命名为ＯｈｐＬＤＣ㊁ＯｈｐＣＡＯ１和ＯｈｐＣＡＯ２ꎮ根据ＷＧＣＮＡ分析发现只有ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１这２个基因在与ＱＡ高度相关的棕色模块中ꎬ所以本研究鉴定了ＱＡ生物合成途径中的２个酶基因ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１ꎮＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１在花榈木中不同组织的表达情况有明显差异ꎬ都在根中表达量较高(图５Ａ㊁图５Ｂ)ꎮＨＲ:根ꎻＨＳ:茎ꎻＨＢ:树皮ꎻＨＯＬ:老叶ꎻＨＮＬ:新叶ꎮ图５㊀ＯｈｐＬＤＣ(Ａ)和ＯｈｐＣＡＯ(Ｂ)基因组织特异性表达Ｆｉｇ.５㊀Ｏｒｇａｎ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＯｈｐＬＤＣ(Ａ)ａｎｄＯｈｐＣＡＯ(Ｂ)ｇｅｎｅｓ２.３㊀ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１基因克隆与序列分析依据花榈木转录组数据获得ＯｈｐＬＤＣ和Ｏｈｐ￣ＣＡＯ１ｃＤＮＡ序列ꎬ并利用ＯＲＦＦｉｎｄｅｒ在线软件对ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１ｃＤＮＡ序列分析ꎬ预测ＯｈｐＬＤＣ含１２９０ｂｐ完整的开放阅读框ꎬＯｈｐＣＡＯ１含２２６８ｂｐ完整的开放阅读框ꎬ分别编码４２９㊁７５５个氨基酸ꎮ通过设计特异性引物ꎬ进行ＰＣＲ扩增反应ꎬ获得目的基因片段(图６)ꎮ将ＰＣＲ产物回收纯化并重组到ＴＯＰＯ载体中ꎬ挑选阳性菌落ＰＣＲ检测并测序ꎬ测序结果与预测结果一致ꎮ将２个基因提交到ＮＣＢＩ上利用ＢＬＡＳＴＰ进行序列比对ꎬ比对结果显示ＯｈｐＬＤＣ基因序列与豆科植物Ｅｃｈｉｎｏｓｏｐｈｏｒａｋｏｒｅｅｎ￣ｓｉｓ中ＥｋＤＣ(ＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＡＢ５６１１３９.１)序列高度相似ꎬ相似度为８７.２％ꎬＯｈｐＣＡＯ１基因序列与相思子中ＡｐＣＡＯ(ＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＸＭ＿０２７４９１１２９.１)序列高度相似ꎬ相似度为９２％ꎮ２.４㊀蛋白质理化性质分析利用Ｐｒｏｔｐａｒａｍ在线软件对ＯｈｐＬＤＣ和Ｏｈｐ￣ＣＡＯ１基因编码的氨基酸序列进行分析ꎬ发现ＯｈｐＬＤＣ蛋白相对分子质量为４.６３ˑ１０４ꎬ分子式为Ｃ２０６９Ｈ３２５６Ｎ５４４Ｏ６１８Ｓ２１ꎬ理论等电点(ＰＩ)为６ ９８ꎻＯｈｐ￣ＣＡＯ１蛋白相对分子质量为８.４４ˑ１０４ꎬ分子式为Ｃ３７８１Ｈ５８３５Ｎ１０５３Ｏ１０８３Ｓ３４ꎬ理论等电点(ＰＩ)为６ ５１ꎮＯｈｐＬＤＣ蛋白带负电残基(Ａｓｐ＋Ｇｌｕ)数为４２ꎬ带正电残基(Ａｒｇ＋Ｌｙｓ)数为４２ꎬ不稳定系数为４１０６ꎮＭ:Ｍａｒｋｅｒꎻ１:ＯｈｐＬＤＣꎻ２:ＯｈｐＣＡＯꎮ图６㊀花榈木ＯｈｐＬＤＣ㊁ＯｈｐＣＡＯ基因扩增结果Ｆｉｇ.６㊀ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＯｈｐＬＤＣａｎｄＯｈｐＣＡＯｇｅｎｅｓｉｎＯｒｍｏｓｉａｈｅｎｒｙｉＰｒａｉｎＯｈｐＣＡＯ１蛋白带负电残基(Ａｓｐ＋Ｇｌｕ)数为９１ꎬ带正电残基(Ａｒｇ＋Ｌｙｓ)数为８５ꎬ不稳定系数为４３ ６３ꎮＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１均属于不稳定蛋白质ꎮ利用ＤｅｅｐＴＭＨＭＭ和ＳｉｇｎａｌＰ６.０在线软件对ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１蛋白进行跨膜结构和信号肽预测ꎬ结果表明其氨基酸序列中均无跨膜区域和信号肽序列ꎮ利用Ｅｕｋ￣ｍＰＬｏｃ２.０在线软件分析ꎬ初步判断ＯｈｐＬＤＣ蛋白定位于线粒体ꎬＯｈｐＣＡＯ１蛋白定位于细胞外间质中ꎮ２.５㊀蛋白质二级结构和三级结构预测使用ＳＯＰＭＡ和ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ在线工具预测ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１蛋白二级结构ꎬ结果显示ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１蛋白二级结构都由α￣螺旋２５６１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第８期(Ａｌｐｈａｈｅｌｉｘ)㊁β￣转角(Ｂｅｔａｔｕｒｎ)㊁延伸链(Ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｔｒａｎｄ)和无规则卷曲(Ｒａｎｄｏｍｃｏｉｌ)组成ꎬ均无二硫键ꎮ其中ＯｈｐＬＤＣ的α￣螺旋为３４ ５０％㊁β￣转角为６ ９９％㊁延伸链为１８ １８％㊁无规则卷曲为４０ ３３％ꎻＯｈｐＣＡＯ１的α￣螺旋为１７ ７５％㊁β￣转角为７ １５％㊁延伸链２３ ７１％㊁无规则卷曲为５１ ３５％ꎮ利用ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ同源建模系统对ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１进行同源建模ꎬ得到了２个蛋白质的三级结构模型ꎬ如图７所示ꎮＡ:预测的ＯｈｐＬＤＣ蛋白三级结构ꎻＢ:预测的ＯｈｐＣＡＯ１蛋白三级结构ꎮ图７㊀ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１蛋白三级结构模型Ｆｉｇ.７㊀ＴｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｍｏｄｅｌｓｏｆＯｈｐＬＤＣａｎｄＯｈｐＣＡＯ１ｐｒｏｔｅｉｎｓ２.６㊀氨基酸序列的同源性及系统进化树分析利用ＮＣＢＩ中Ｂｌａｓｔ分析ꎬ结果表明花榈木中ＯｈｐＬＤＣ基因与多个物种的ＬＤＣ基因高度相似ꎬ相似度较高的基因有苦参(ＳｏｐｈｏｒａｆｌａｖｅｓｃｅｎｓꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＭＷ９６１００９.１)㊁野决明(ＴｈｅｒｍｏｐｓｉｓｆａｂａｃｅａꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＡＢ９１５６９８.１)㊁霍州油菜(Ｔｈｅｒｍｏｐ￣ｓｉｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＡＢ６４７１７８.１)㊁蓝花赝靛(ＢａｐｔｉｓｉａａｕｓｔｒａｌｉｓꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＡＢ６４７１７７.１)㊁落花生(ＡｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＸＭ＿０２５７５６５７４.２)等的赖氨酸/鸟氨酸脱羧酶基因ꎬ序列一致性分别为８６ ５１％㊁８４ ９６％㊁８４ ８４％㊁８４ ２４％㊁７７ ８０％ꎮ此外ＯｈｐＣＡＯ１基因与大豆(ＧｌｙｃｉｎｅｓｏｊａꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＸＭ＿０２８３８９７３６.１)ＣＡＯ１基因的相似度最高ꎬ达９３.４６％ꎻ与相思子(ＡｂｒｕｓｐｒｅｃａｔｏｒｉｕｓꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＸＭ＿０２７４９１１２９.１)㊁赤豆(ＶｉｇｎａａｎｇｕｌａｒｉｓꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＸＭ＿０１７５８１２２６)㊁熊猫豆(ＶｉｇｎａｕｍｂｅｌｌａｔｅꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＸＭ＿０４７２９６１９３.１)㊁狭叶羽扇豆(ＬｕｐｉｎｕｓａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉｕｓꎬＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＸＭ＿０１９５８３６７１)等的ＣＡＯ１基因也具有较高同源性ꎬ序列一致性分别为９２ ０９％㊁９２ ２４％㊁９３ ０７％㊁９２ ９０％ꎮ该结果表明ＯｈｐＬＤＣ和Ｏｈｐ￣ＣＡＯ１是花榈木中赖氨酸脱羧酶和铜胺氧化酶的编码基因ꎮ将ＯｈｐＬＤＣ氨基酸序列与ｂｌａｓｔ结果高度相似的其他植物的赖氨酸脱羧酶氨基酸序列进行比对ꎬ结果表明ＯｈｐＬＤＣ蛋白氨基酸序列中第８６到第３７２位氨基酸与其他植物的赖氨酸脱羧酶具有高度相似性ꎬ属于ＰＬＰ依赖性超家族酶的Ｎ端高度保守的ＰＬＰ结合域和ＱＡ植物中保守的Ｃ端底物结合位点Ｐｈｅ３４０(图８)ꎮＯｈｐＣＡＯ１氨基酸序列与ｂｌａｓｔ结果同源性较高的几个物种的ＣＡＯ氨基酸序列进行同源性比对ꎬ结果发现与豆科植物的ＣＡＯ１氨基酸序列第６２到第７６３位氨基酸的相似性非常高ꎬ与其他物种的ＣＡＯ氨基酸序列也相似ꎬ发现１个ＣＡＯ的保守结构 ＮＹ￣Ｙ ꎬ以及３个组氨酸保守位点(图９)ꎮ为了分析花榈木中ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１与其他物种相关基因的进化关系ꎬ采用ＭＥＧＡ１１.０将ＯｈｐＬＤＣ与多个物种的ＬＤＣ基因一起构建进化树ꎬ并将ＯｈｐＣＡＯ１与多个物种的ＣＡＯ１基因一起构建进化树ꎮ结果发现ＯｈｐＬＤＣ与豆科类植物中的ＬＤＣ基因亲缘关系较近ꎬ表明编码这些赖氨酸脱羧酶的基因在进化上具有较近的亲缘关系ꎮ并发现Ｏｈｐ￣ＣＡＯ１与狭叶羽扇豆的ＣＡＯ１基因亲缘关系最近(图１０)ꎮ３㊀讨论ＱＡ通常出现在豆科中[２０]ꎬ但也在藜科(Ｃｈｅ￣ｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ)㊁小檗科(Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ)㊁毛茛科(Ｒａ￣ｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ)和茄科(Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ)中被发现[７]ꎮ花榈木属于豆科蝶形花亚科植物ꎬ对花榈木代谢组进行分析ꎬ结果表明花榈木也生成ＱＡꎬ并检测到了白羽扇豆碱㊁１３￣羟基羽扇豆碱㊁鹰爪豆碱㊁金雀花碱和乙酰金雀花碱５个ＱＡꎮＱＡ是植物生物碱的一个重要家族ꎬ但核心生物合成途径一直未被阐明ꎬ目前人们只发现了２个ＱＡ生物合成的关键催化酶ꎬ赖氨酸脱羧酶(ＬＤＣ)和铜胺氧化酶(ＣＡＯ)[２１]ꎬ通过对花榈木转录组数据分析ꎬ发现了这２个关键酶的存在ꎬ并成功克隆了花榈木的编码赖氨酸脱羧酶和铜胺氧化酶基因ꎬ分别命名为ＯｈｐＬＤＣ㊁ＯｈｐＣＡＯ１ꎮ对ＯｈｐＬＤＣ㊁ＯｈｐＣＡＯ１编码的蛋白质氨基酸序列分析ꎬ发现ＯｈｐＬＤＣ属于ＰＬＰ依赖性超家族酶ꎬ含有高度保守的ＰＬＰ结合域和植物中ＱＡ保守的底物结合位３５６１王佳琦等:花榈木生物碱合成关键酶基因ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１的克隆与分析图８㊀ＯｈｐＬＤＣ与其他物种中的ＬＤＣ氨基酸序列的同源性比对Ｆｉｇ.８㊀ＨｏｍｏｌｏｇｙｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＯｈｐＬＤＣｗｉｔｈｔｈｏｓｅｏｆＬＤＣｉｎｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ点Ｐｈｅ３４０ꎮＢｕｎｓｕｐａ等[２２]研究结果表明ꎬ不同物种ＬＤＣ蛋白氨基酸序列中的Ｈｉｓ３４０到Ｐｈｅ３４４是ＬＤＣ与底物结合催化的关键位点ꎮ系统进化树分析结果表明ꎬＯｈｐＬＤＣ与大豆㊁苦参和狭叶羽扇豆等豆科植物的ＬＤＣ基因聚为一类ꎬ表明花榈木中ＯｈｐＬＤＣ基因与这些植物中ＬＤＣ基因具有共同的起源ꎬ也表明ＬＤＣ具有催化赖氨酸脱羧生成尸胺的酶活性[２３]ꎬ为后续ＱＡ的合成提供尸胺ꎮ此外本研究发现ꎬＯｈｐＣＡＯ１在产生ＱＡ的植物中进化是比较保守的ꎬ含有一个保守结构 ＮＹ￣Ｙ ꎬ以及３个组氨酸保守位点ꎬ是一种活性酶[２４]ꎮ在系统进化树中发现ꎬ花榈木与狭叶羽扇豆亲缘关系最近ꎬ表明花榈木的铜胺氧化酶与狭叶羽扇豆的铜胺氧化酶有相似的特性[２５]ꎮＹａｎｇ等[２１]发现ＬａＣＡＯ对尸胺具有较高的亲和力ꎬ可以将尸胺氧化为１￣哌啶ꎬ推测ＯｈｐＣＡＯ１也可能催化花榈木中ＱＡ生物合成的第二步ꎬ为后续ＱＡ的合成提供１￣哌啶ꎮ本试验克隆了花榈木中ＱＡ代谢中相关的２个酶基因ＯｈｐＬＤＣ㊁ＯｈｐＣＡＯ１ꎬ它们具有组织特异性ꎬ在根中表达量较高ꎮ与之相对应ꎬ通过代谢组学分析发现部分ＱＡ是在根中含量较高ꎬ表明ＯｈｐＬＤＣ㊁ＯｈｐＣＡＯ１可能是花榈木根中参与ＱＡ生物合成的２个重要基因ꎬＱＡ在根中可能发挥重要的生物学功能ꎮ因此ꎬ花榈木的编码赖氨酸脱羧酶和铜胺氧化４５６１江苏农业学报㊀２０２３年第３９卷第８期图９㊀ＯｈｐＣＡＯ１与其他物种中的ＣＡＯ氨基酸序列的同源性比对Ｆｉｇ.９㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙｏｆＯｈｐＣＡＯ１ｗｉｔｈｔｈａｔｏｆＣＡＯｉｎｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ５５６１王佳琦等:花榈木生物碱合成关键酶基因ＯｈｐＬＤＣ和ＯｈｐＣＡＯ１的克隆与分析图１０㊀ＬＤＣ(Ａ)和ＣＡＯ(Ｂ)基因家族系统进化树Ｆｉｇ.１０㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＬＤＣ(Ａ)ａｎｄＣＡＯ(Ｂ)ｇｅｎｅｆａｍｉｌｉｅｓ酶基因的克隆和分析对ＱＡ生物合成的分子调控具有重要意义ꎬ为进一步研究花榈木ＱＡ合成与代谢提供了基础ꎬ对豆科植物中的木本物种的研究具有重要意义ꎮ参考文献:[１]㊀桂㊀平ꎬ龙㊀鹏.珍稀树种花榈木研究进展[Ｊ].贵州农业科学ꎬ２０２１ꎬ４９(７):９８￣１０６.[２]㊀陈坚波ꎬ潘春燕ꎬ张慧芳ꎬ等.花榈木中毒急救１例[Ｊ].浙江中医杂志ꎬ２０１４ꎬ４９(６):４５６.[３]㊀张琳婧ꎬ周文娟ꎬ倪㊀林ꎬ等.红豆属植物化学成分及其药理活性研究进展[Ｊ].中草药ꎬ２０２１ꎬ５２(１４):４４３３￣４４４２. 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罗布麻查尔酮合成酶基因克隆及序列分析
罗布麻查尔酮合成酶基因克隆及序列分析李苗;李国旗【摘要】为了解罗布麻查尔酮合成酶基因具体结构,采用RT-PCR、RACE方法从夹竹桃科植物罗布麻中扩增出CHS基因的开放阅读框,其核苷酸序列长1 170 bp,推测的氨基酸序列全长为389个氨基酸残基.核苷酸序列同源性分析结果显示,该cDNA片段与其他植物CHS基因的同源性为78％～81％,表明该基因在进化过程中变异程度较小,整个超基因家族序列高度保守.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2015(024)012【总页数】7页(P85-91)【关键词】罗布麻;CHS基因;基因克隆【作者】李苗;李国旗【作者单位】宁夏大学西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室,银川750021;宁夏农业生物技术重点实验室,银川 750002;宁夏大学西北退化生态系统恢复与重建教育部重点实验室,银川 750021【正文语种】中文【中图分类】Q781査尔酮合成酶基因(chalcone synthase gene,CHS)通过合成査尔酮参与苯丙氨酸代谢，最终形成具备诸多生理活性功能的黄烷酮物质[1]，因而CHS基因能够通过自身参与植株代谢调节活动程度,其有效性在一定程度上反映植物与环境间相互作用关系。
CHS基因在高等植物中通常以小的多家族形式存在，CHS超基因家族中不同家族成员的表达类型及其所编码的蛋白定位有一定差异。
目前，从事基因资源挖掘的专业学者已经从包括苔藓、蕨类、裸子植物及被子植物的各类植物中克隆600余个CHS基因及其相关基因的序列，并发现在多数植物基因组中存在CHS重复基因[2]。
CHS基因的表达具有器官特异性, 不同的家族成员在不同的植物构件部位表达[3], 但其均与构件器官的形态建成[4]、生理生化功能分化存在相当程度的关联[5-9];与此同时，CHS基因的表达在很大程度上受外界环境因素影响, UV、白光、机械损伤、激发因子、抑制因子、病菌等[10]的诱导均有可能启动相关CHS基因的表达[11-13]。
何首乌中芪合酶基因的克隆、鉴定及其功能分析
因及蛋 白序 列 高度 同源且 功能相似 ，只是 由
于其在催化底 物的选择 、催化 乙酰基 的数 目
４
进二苯 乙烯苷类的合成提供理论和技术上 的支持 。
苯丙酰 一 ｏ Ｃ Ａ类似底物。所 以，为了进一步研 究 Ｆ Ｔ ｍＳ Ｓ
基 因在何首乌 中芪类合成途径 中的作用 ，下一步拟通过
过量表达和 Ｒ ＮＡ干扰技 术转化何 首乌愈 伤组织细胞 或 者毛状根 ，研 积 累。这将为阐明二 苯 乙烯苷类生物 合成的机 制奠 定理论基础 。也为运用代谢调控 的手段促
Ｐ ａ ｍａ ｙ Ｔｏ ａ ・ ００１ Ｖ ｌ ０Ｎ ．１・ ｈ ｒ ｃ ｄ ｙ ２１ １ ｏ ２ ｏ１ ，
视 。 目前 已经从松树 、花 生、葡萄、大黄 以
及 高粱等植 物 中分 离 了Ｓ Ｓ 因 ，并进 行 了 Ｔ 基 相 关的遗传 、生化和酶 学研 究。Ｓ Ｓ Ｔ 是植 物 聚 酮化合 物合 酶 （ ＫＳ Ｐ ）家族 中的一 员，通 过功能和序列鉴定发现 ，植物 Ｐ Ｓ 员的基 Ｋ 成
何首乌FmSTS2基因的克隆、鉴定和其与二苯乙烯苷合成关系分析的开题报告
何首乌FmSTS2基因的克隆、鉴定和其与二苯乙烯苷合成关系分析的开题报告一、选题背景何首乌是一种常见的中药材，具有多种药理活性成分，对于调节免疫、抗肿瘤和减少氧自由基等方面有着良好的疗效。
二苯乙烯苷是何首乌中最主要的活性成分之一，具有明显的抗氧化和抗炎作用，对于改善身体健康状态具有重要的意义。
本次开题报告的选题即为研究何首乌中二苯乙烯苷生物合成的机制，探究其中STS2基因的功能和调控机制，从而为生物合成新型二苯乙烯苷的研究提供理论支持。
二、研究目的1. 克隆何首乌中STS2基因并进行鉴定。
2. 探究STS2基因在何首乌二苯乙烯苷合成途径中的作用和调控机制。
3. 基于基因调控机制深入研究如何实现二苯乙烯苷的高效生产。
三、研究内容1. 到NCBI GenBank数据库中下载何首乌STS2基因的序列，进行生物信息学分析。
2. 通过RT-PCR方法从何首乌中克隆出所需要的STS2基因，并进行测序鉴定。
3. 利用生物信息学工具进行STS2基因结构、基因家族和进化分析，确定STS2基因的亲缘关系。
4. 探究STS2基因在何首乌二苯乙烯苷生物合成途径中的作用和调控机制，分析其在何首乌不同组织或不同生长期的表达模式。
5. 进一步探究如何通过基因调控实现何首乌中二苯乙烯苷的高效生产，探索生物合成新型二苯乙烯苷的可能性。
四、研究方法本次研究将采用基因克隆、生物信息学分析、RT-PCR、基因表达分析和基因调控等多种方法进行。
首先通过NCBI GenBank下载何首乌STS2基因的序列，并进行生物信息学分析，确定克隆基因的引物。
随后利用RT-PCR方法将STS2基因从何首乌中克隆出，并进行测序鉴定。
基于生物信息学工具进行STS2基因的进化和结构分析，确定其亲缘关系。
最后通过基因表达分析和基因调控研究，探究STS2基因在何首乌二苯乙烯苷合成途径中的调控机制，并探索如何通过基因调控实现二苯乙烯苷的高效生产。
五、研究意义本次研究将揭示何首乌二苯乙烯苷的生物合成途径，探究其中关键的基因及其调控机制。
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何首乌苯甲酮合成酶基因的克隆及序列分析(作者：__________ 单位：___________ 邮编：___________ )【摘要】目的克隆何首乌苯甲酮合成酶基因并作序列分析。
方法以何首乌Polygo num multiflorum Thu nb.为材料，根据其它植物苯甲酮合成酶(Benzalacetone synthase ，BAS)基因cDNA序列的保守区域设计引物，利用RT PCR和3〔RACE，克隆其基因。
结果从何首乌叶cDNA中克隆出了长度为1 049 bp的基因片段。
序列分析表明该片段具有典型的CHS基因家族的结构域，为何首乌的BAS基因片段，命名为PmBAS。
将得到的序列提交Gen Ba nk，序列号为FJ601686。
对获得的PmBAS的氨基酸序列进行比较分析，发现PmBAS不含有Phe215，这种差异可能是CHS与BAS催化不同反应的重要原因之一。
何首乌BAS与其它植物CHS的氨基酸序列的进化分析表明，其与同为蓼科的虎杖和掌叶大黄的同源性较近。
结论对利用基因工程技术促进何首乌蒽醌合成具有重要意义。
【关键词】何首乌；苯甲酮合成酶；基因克隆；序列比较蒽醌(Anthraquinone)是一类重要的中草药活性成分，常见于何首乌、决明、大黄、虎杖、芦荟和茜草等植物中，具有抗菌、泻下、利尿、抗氧化和过氧化作用、抗诱变和保肝等多种功效［1, 2］。
Dewick 等］3］与VELl［EK等［4］认为，蒽醌的合成大致分为3个阶段：①以乙酰辅酶A为起始单元，连续与8个丙二酸单酰辅酶A发生缩合，引入8个二碳单位，最后生成蒽醌的基本骨架——八酮化合物；②八酮化合物经过还原、脱羧及氧化等步骤，形成大黄酚、芦荟大黄素与大黄酸等蒽醌类化合物；③八酮化合物经过水解、脱羧、脱水与甲基化等步骤，形成大黄素与大黄素甲醚等蒽醌类化合物(见图 1 )。
在第1阶段中，催化乙酰辅酶A与丙二酸单酰辅酶A缩合的反应是由植物查尔酮合成酶系催化完成的。
查尔酮合成酶系属于植物皿型聚酮合成酶的一个家族，包括了查尔酮合成酶(Chalcone synthase，CHS )、芪合成酶(Stilbene synthase ，STS )、吡喃酮合成酶(2［pyrone synthase，2PS)、苯甲酮合成酶(BAS)、吖啶酮合成酶(Acrido ne syn thase ，ACS )和芦荟松合成酶(Aloes one synthase，ALS)等成员，它们的氨基酸序列相似性达60%〜70%:5，6］。
近几年来，一系列功能不同的查尔酮合成酶系不断从蓼科植物中被克隆和鉴定。
如Abe等］5］从蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum Linn.中克隆得到CHS与BAS °CHS能催化3分子的丙二酸单酰辅酶A和1分子对香豆酰［辅酶A结合形成查尔酮。
BAS能催化1分子pcoumaroyl _辅酶A与1分子的丙二酸单酰辅酶A，缩合生成具有抗炎作用的苯乙烯基丙酮。
Junghanns等］7］也从掌叶大黄中克隆得到ALS，能够催化6分子的乙酰辅酶A，形成芦荟松。
Samappito ［8 ］等也从园叶大黄Rheum tataricum 中克隆得到STS。
何首乌Polygonum multiflorum Thunb.，蓼科(Polygonaceae )传统中药，具有补肝肾、益精血、乌须发、生发、强筋骨之功效，主要含蒽醌、二苯乙烯苷类化合物和卵磷脂等活性成分］1，2］。
我们以何首乌为材料，采用RTPCR技术克隆其BAS基因，并进行序列分析。
这对从分子水平上探讨蒽醌的生物合成机制中具有重要的指导意义，并为下一步利用转基因技术来提咼何首乌蒽醌产量的研究奠定基础。
1材料与试剂植物材料何首乌Polygo num multiflorum Thu nb. 采自西南交通大学峨眉校区。
Taq酶、限制性内切酶、分子量Marker为Takara产品；DNA电泳凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；其余试剂均为上海生工生物工程公司产品。
2方法2.1总RNA的提取剪取何首乌幼嫩的叶片，加液氮研磨成粉末，RNA的提取使用Tiangen公司的RNAplant植物总RNA提取试剂，具体步骤按说明书进行。
2.2 cDNA 的获得以纯化的RNA 为模板，以oligo(dT)18: 5'_GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)18 _3'为反转录引物，米用AMV反转录酶进行反转录获得cDNA。
2.3引物设计与合成根据Gen ba nk所报道的已知植物的BAS基因的cDNA序列，使用Primer Premier 5.0引物设计软件，由上海英俊生物技术服务有限公司合成所有引物，序列如下：中间片段引物，正向引物(P1): 5 G AATGGGGCCAACCC(T)AAGTC3 ‘；反向引物(P2) : 5 CCATAG(C)TCGTTCAACACTTG3 '3RACE 引物，3P1 :5 TGT CCA AGA CTC TTC CCG TAC3 ‘；3P2 : 5 TATCCTGGA CCATGTTGAAGC3 ‘。
2.4 PCRPCR 扩增采用BioRAD公司的MG96G 梯度PCR仪，反应条件按引物的碱基组成进行设置。
2.5克隆与测序PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳后，利用OMEGA公司的胶回收试剂盒回收产物，连接到pMD18 T载体，构建重组质粒。
转化大肠杆菌感受态细胞，筛选重组子并用菌落PCR 检测，送由上海英俊生物技术服务有限公司测序。
2.6核苷酸序列分析采用Inter_ProScan进行结构域和功能位点预测。
利用NCBI (www. ncbi. nih. gov)的BLAST 在线分析工具分别对GenBank数据库进行序列比对分析。
采用DNAman软件进行序列的多重比较及与进化树绘制。
3结果3.1电泳结果何首乌的BAS的中间片段PCR和3'RACE的扩增结果如图2所示，中间片段引物进行PCR扩增后得到约660 bp 的片段(图2”A), 3'RACE扩增出约600 bp的片段(图2 B)。
3.2 PCR产物的测序分别将PCR产物进行测序。
BAS基因克隆的中间片段和3'片段分别测得为659 bp和595 bp。
根据两个片段的测序结果，利用Vector NTI Suite 7软件拼接得到何首乌的BAS 基因的部分序列，命名为PmBAS。
而PmBAS基因长度为1049 bp，其最长的ORF编码一个由276个氨基酸残基组成的蛋白(图3)。
InterProScan在线分析结构域和功能位点表明，PmBAS具有查尔酮合成酶基因家族的N末端和C末端序列特征(图4)，说明所获得的基因序列属于查尔酮合成酶基因家族，GenBank登录号为FJ601686。
3.3不同植物CHS与BAS基因的序列比较与进化分析以PmBAS序列进行Blast在线序列比对，结果表明该基因的核苷酸序列与其它植物CHS家族的相似性较高，均超过74%以上。
PmBAS 基因的核苷酸序列与虎杖(Polygonum cuspidatum)、大黄(Rheum palmatum)、杨树(Populus trichocarpa)、白杨(Populus alba)等植物CHS家族的核苷酸一致性分别为94 %，86 %，76 %和76 %。
利用DNAMAN软件将获得的PmBAS基因推导的氨基酸序列与其它几种植物CHS基因家族的氨基酸序列进行多重比对，并构建进化树。
可以看出，查尔酮合成酶系被分为查尔酮合成酶与非查尔酮合成酶两个亚家族［5］，其中BAS、ALS、2PS与ACS构成非查尔酮合成酶亚家族，而绝大部分CHS ［除圆叶牵牛CHS (Ipomoea purpurea CHS )］与STS构成了查尔酮合成酶亚家族。
何首乌与蓼科的虎杖(Polygonum cuspidatum)的同缘关系最近，与蓼科的掌叶大黄（Rheum palmatum）的同缘关系也较近，而与其它植物的同缘关系较远（图5）。
3.4 PmCHS与PmBAS基因的氨基酸序列比较查尔酮合成酶系具有高度保守的催化活性中心（Cyt164]His303〕As n336），通过调控活性中心腔内的空间大小决定了起始底物的选择性和聚酮链的长度。
Phe215位于活性位点口袋的入口处，调控一系列缩合反应中适合的底物和中间产物的进入，同时有利于丙二酸单酰CoA的脱羧。
PmBAS保留了催化聚酮合成的三个必需氨基酸残基（Cyt164、His303、Asn336，虎杖查尔酮合成酶的氨基酸位置数），推测PmBAS 也能够催化聚酮的合成。
然而在PmBAS分子中，Phe215被Leu215 （含有较长的氨基酸侧链）替代，阻碍了丙二酸单酰辅酶A进入活性中心腔，导致PmBAS不能够连续缩合丙二酸单酰辅酶A，而只能催化1分子的丙二酸单酰辅酶A参与反应（图6）。
3讨论通过克隆与活性成分形成关系最密切的生物合成相关基因入手，阐明中药活性成分的生物合成及其调控机制，是植物基因工程的一个重要领域。
本研究采用RACE技术克隆PmBAS的基因，这对进一步研究其功能、表达特征以及利用基因工程技术促进何首乌蒽醌合成具有重要意义。
由于何首乌叶片中含较多的次生代谢物，造成RNA的提取困难，目前我们正在进一步改进RNA提取方法，同时PmBAS 的5'_RACE实验也正在进行中。
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