基因克隆和序列分析42页PPT
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基因克隆与克隆基因的表达PPT共51页
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
பைடு நூலகம்
基因克隆与克隆基因的表达
16、人民应该为法律而战斗，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
谢谢！
பைடு நூலகம்
基因克隆与克隆基因的表达
16、人民应该为法律而战斗，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
基因的克隆方法ppt课件
1）直接从基因组中扩增过程： （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增及产物鉴定
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
15
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
TTTTTTTTTT
G
3`
AATTTTTTTT ACTTTTTTTT AGTTTTTTTT TATTTTTTTT
TCTTTTTTTT TGTTTTTTTT CATTTTTTTT CCTTTTTTTT CGTTTTTTTT GATTTTTTTT
31
提取基因组DNA
PCR引物设计
PCR扩增
基因序列分析
此法适合扩增原 核生物基因。
真核生物基因组含有内含子32 ！
2）从mRNA中扩增: RT-PCR
（1）提取基因组 total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增及序列分析
工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一
段序列，提供的信息较少。
19
优点：
简便、灵敏、高效、省时，能快速显示 mRNA的组成。
所需的mRNA量少。 各样本mRNA的差异可同时进加标签的基因克隆 方法野生株构建基因组 基因苗构建基因组文 库基因苗
阳性克隆
获得阳性克隆 目的基因
基因序列分析，24 确定为基因
转座子标签法
转座子又称转座因子或者跳跃因子，实 际上也是DNA片段，它可以在生物的染色 体组中移动，从染色体的一个位点跳到另 一个位点，或从一条染色体跳到另一条染 色体上，引起基因功能的改变。
mRNA
5` RP
A T C G
AAAAAAAA
A C
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G
3`
15
mRNA
5` RP
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植物基因克隆的方法课件PPT
素合成酶基因。
技术支持：
差别筛选法（differential screening） 扣除杂交技术（subtractive hybridization） mRNA差异显示技术（ mRNA differential
display reverse transcription-PCR） 代表性差异显示（representational difference
1.2根据基因的表型突变互补功能
植物的许多基因与细菌或酵母的突变 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因cDNA 记(EST)寻找新基上
◆ 此种方法只需检测基因表达库中每一cDNA的很短序列(9bp),建立基因表达图,根据基因表达图就可以发现新基因. 用植物偏爱的密码子，人工合成并克 1、筛选与目标基因连锁的分子标记
6、外显子的分离、鉴定
阳性克隆这些候选基因，再进行分离，时空 表达特点，同源性比较等分析确定目的基因。
定位克隆的优点和局限性
优点：不必知道基因产物的功能，也不需要
知道产生某表型的生化、生理和病理过程。 局限性：1、基因定位依赖分子标记。
未消失，发生转座的只是转座子的拷贝。 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
1、筛选与目标基因连锁的分子标记 增，扩增的片段经纯化后连接到合适的
基因发生转座可引起插入突变，使插入位 3、构建目的基因区域跨叠克隆（contig）
常用载体：柯斯质粒、酵母人工染色体（YAC）、PI、BAC、PAC等。 要求分离一个纯度很高的蛋白质.
的隆插该入 基和因嵌。合来克隆置基因的。 基因失活并诱导产生突变型或在插入
常用载体：柯斯质粒、酵母人工染色体（YAC）、PI、BAC、PAC等。 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
技术支持：
差别筛选法（differential screening） 扣除杂交技术（subtractive hybridization） mRNA差异显示技术（ mRNA differential
display reverse transcription-PCR） 代表性差异显示（representational difference
1.2根据基因的表型突变互补功能
植物的许多基因与细菌或酵母的突变 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因cDNA 记(EST)寻找新基上
◆ 此种方法只需检测基因表达库中每一cDNA的很短序列(9bp),建立基因表达图,根据基因表达图就可以发现新基因. 用植物偏爱的密码子，人工合成并克 1、筛选与目标基因连锁的分子标记
6、外显子的分离、鉴定
阳性克隆这些候选基因，再进行分离，时空 表达特点，同源性比较等分析确定目的基因。
定位克隆的优点和局限性
优点：不必知道基因产物的功能，也不需要
知道产生某表型的生化、生理和病理过程。 局限性：1、基因定位依赖分子标记。
未消失，发生转座的只是转座子的拷贝。 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
1、筛选与目标基因连锁的分子标记 增，扩增的片段经纯化后连接到合适的
基因发生转座可引起插入突变，使插入位 3、构建目的基因区域跨叠克隆（contig）
常用载体：柯斯质粒、酵母人工染色体（YAC）、PI、BAC、PAC等。 要求分离一个纯度很高的蛋白质.
的隆插该入 基和因嵌。合来克隆置基因的。 基因失活并诱导产生突变型或在插入
常用载体：柯斯质粒、酵母人工染色体（YAC）、PI、BAC、PAC等。 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文
基因的克隆与表达PPT课件
2．真核表达系统：使外源基因在真核细 胞中表达的体系。
.
32
二．原核生物基因结构和表达特点
.
33
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
.
34
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
.
17
五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PCR5、人工合成
6、差异显示
.
18
1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组
11
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。
2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
.
12
四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
.
13
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
基因的克隆与表达
.
1
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
.
2
基因克 隆 Gene Cloning
.
3
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
.
32
二．原核生物基因结构和表达特点
.
33
1. 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
2. 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
.
34
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
• PCR过程中，普通的Taq酶可在产 物的3’端多加一个A
.
17
五、基因克隆的工作流程
（一）目的基因的获得
1、直接分离3、构建cDNA4、PCR5、人工合成
6、差异显示
.
18
1、直接物的基因组DNA切割成一定大 小的片段，并与合适的载体重组后 导入宿主细胞，进行克隆。这些存 在于所有重组
11
三、受体细胞
1、定义：外源DNA导入的细胞，是 重组体扩增的场所。
2、要求：易于接纳外源DNA
无特异的内源性核酸内切酶
载体复制、扩增不受阻
与载体有互补性
.
12
四、体外重组的策略
1、粘末端连接 1）全同源粘末端连接 • 最方便简单 • 高背景-载体自身环化 • 双向插入
.
13
2）定向克隆：使外源基因定向插入到载体 中的克隆策略
基因的克隆与表达
.
1
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
.
2
基因克 隆 Gene Cloning
.
3
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
第六基因克隆张幻灯片(共65张PPT)
E.coli + 0.1M CaCl2
0-4℃
Low-osmosis makes cell expanding
competent cells (E.coli)
Recombinant DNA + 42 ℃
Heat makes cell more expanding and membrane more permeable
those
转化步骤后，转进重组质粒的细胞是较少的。 因此需要挑选出含有重组子的细胞。
31
第三十一页，共65页。
1. Direct selection
直接筛选
• Antibotic resistance
抗菌素抗性
• Marker rescue selection
• In situ hybridization
重新筛选插入的片断困难
11
第十一页，共65页。
A1 A
2
vector
B
2 A
vector
1 B
平齐末端连接时，插入的方向是
随机的，称为双向插入。会给后续的 工作造成很多麻烦。
12
第十二页，共65页。
单酶切粘末端连接
EcoRI
EcoRI
13
第十三页，共65页。
14
第十四页，共65页。
单酶切粘末端连接的特点
氯化钙法 ：利用氯化钙和热休克使受体菌成为
感受态细胞，促进外源 DNA的进入。
24
第二十四页，共65页。
宿主细胞与重组DNA在00C的低渗氯化钙溶 液中孵育，快速转入420C造成热休克。经此处 理后的细胞“容易”接受外源的DNA，一般叫
做感受态细胞。
25
第二十五页，共65页。
0-4℃
Low-osmosis makes cell expanding
competent cells (E.coli)
Recombinant DNA + 42 ℃
Heat makes cell more expanding and membrane more permeable
those
转化步骤后，转进重组质粒的细胞是较少的。 因此需要挑选出含有重组子的细胞。
31
第三十一页，共65页。
1. Direct selection
直接筛选
• Antibotic resistance
抗菌素抗性
• Marker rescue selection
• In situ hybridization
重新筛选插入的片断困难
11
第十一页，共65页。
A1 A
2
vector
B
2 A
vector
1 B
平齐末端连接时，插入的方向是
随机的，称为双向插入。会给后续的 工作造成很多麻烦。
12
第十二页，共65页。
单酶切粘末端连接
EcoRI
EcoRI
13
第十三页，共65页。
14
第十四页，共65页。
单酶切粘末端连接的特点
氯化钙法 ：利用氯化钙和热休克使受体菌成为
感受态细胞，促进外源 DNA的进入。
24
第二十四页，共65页。
宿主细胞与重组DNA在00C的低渗氯化钙溶 液中孵育，快速转入420C造成热休克。经此处 理后的细胞“容易”接受外源的DNA，一般叫
做感受态细胞。
25
第二十五页，共65页。
克隆基因的表达PPT课件
larger subunit attaches to the initiation complex. After the initiation phase the message gets longer during the elongation phase.
第19页，共56页。
New tRNAs bring their amino acids to the open binding site on the ribosome/mRNA complex, forming a peptide bond between the amino acids. The complex then shifts along the mRNA to the next triplet, opening the A site. The new tRNA enters at the A site. When the codon in the A site is a termination codon, a releasing factor binds to the site, stopping translation and releasing the ribosomal complex and mRNA. Often many ribosomes will read the same message, a structure known as a polysome forms. In this way a cell may rapidly make many proteins.
第18页，共56页。
Translation is the process of converting the mRNA codon sequences into an amino acid sequence. The initiator codon (AUG) codes for the amino acid N-formylmethionine (f-Met). No translation occurs without the AUG codon. f-Met is always the first amino acid in a polypeptide chain, although frequently it is removed after translation. The intitator tRNA/mRNA/small ribosomal unit is called the initiation complex. The
第19页，共56页。
New tRNAs bring their amino acids to the open binding site on the ribosome/mRNA complex, forming a peptide bond between the amino acids. The complex then shifts along the mRNA to the next triplet, opening the A site. The new tRNA enters at the A site. When the codon in the A site is a termination codon, a releasing factor binds to the site, stopping translation and releasing the ribosomal complex and mRNA. Often many ribosomes will read the same message, a structure known as a polysome forms. In this way a cell may rapidly make many proteins.
第18页，共56页。
Translation is the process of converting the mRNA codon sequences into an amino acid sequence. The initiator codon (AUG) codes for the amino acid N-formylmethionine (f-Met). No translation occurs without the AUG codon. f-Met is always the first amino acid in a polypeptide chain, although frequently it is removed after translation. The intitator tRNA/mRNA/small ribosomal unit is called the initiation complex. The
基因克隆简介ppt课件
5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
14
（4）粘性末端的意义 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
pBR322质粒
pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第 一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基 因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 （tetr）；
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA
复制起点（ori）。
27
PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
④ lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）：
b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸），该段基因序列连接到 pUC载体上。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的 缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成 活性酶，不能分解Xgal
37
⑤ 载体lacZ’与a互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个 缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又 能分解Xgal。产生蓝色物质。
15
16
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能 把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 17
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
基因工程7克隆基因的表达概述PPT模版(41页)
强启动子是能维持高频率转录的启动子， 通常控制那些细胞需要其大量转译产物的基因 转录；而弱启动子具有相对较低的转录效率， 指导那些仅需要其少量转译产物的基因转录。
利用基因工程技术，可将由弱启动子所控 制的基因放在强启动子的下游，从而获得高效 表达。
两个保守区之间的DNA对启动子的功能也 有影响，各启动子都需要一些最适的间隙，通 常认为间隙为17 bp的启动子功能较强。
2. 真核细胞启动子中可以找到三个保守区：
(1) 位于12至32 bp之间的TATA框，序列为 TATAATATA，其功能可能为DNA双链开始解 开并决定转录的起点位置。
(2) 位于70至80 bp区域的CAAT框，序列为 GGTCAATCT，其主要作用可能与RNA聚合酶 的结合有关。
(3) 位于更上游约70至100 bp处的GC框，序列 为GGGCGG，也称为增强子（enhancer），其 作用为促进基因的转录，对基因的表达可产生 显著的增强作用。增强子有时位于基因3’端下 游区或在内含子中。
由RNA聚合酶催化的转录过程可分为起始、 延长和终止三个步骤。
7.3.1.1 启动子 标志基因转录起始的位点称启动子。在大
肠杆菌中，启动子被RNA聚合酶的因子所识 别。启动子是一段DNA序列，常位于基因或 操纵子编码顺序的上游，RNA聚合酶结合在上 面。
1. 原核细胞的启动子 原核细胞的启动子在转录起始点的上游有
(2’ω)组成，分子量约46万。完整的RNA聚 合酶，即2’ ω ，称为全酶(holoenzyme)； 没 有 亚 基 的 RNA 聚 合 酶 称 为 核 心 酶
(coreenzyme)。亚基(因子)容易同核心酶解离，
其功能是使核心酶能稳定地结合到DNA的启动
子上，故又称为起始因子。
利用基因工程技术，可将由弱启动子所控 制的基因放在强启动子的下游，从而获得高效 表达。
两个保守区之间的DNA对启动子的功能也 有影响，各启动子都需要一些最适的间隙，通 常认为间隙为17 bp的启动子功能较强。
2. 真核细胞启动子中可以找到三个保守区：
(1) 位于12至32 bp之间的TATA框，序列为 TATAATATA，其功能可能为DNA双链开始解 开并决定转录的起点位置。
(2) 位于70至80 bp区域的CAAT框，序列为 GGTCAATCT，其主要作用可能与RNA聚合酶 的结合有关。
(3) 位于更上游约70至100 bp处的GC框，序列 为GGGCGG，也称为增强子（enhancer），其 作用为促进基因的转录，对基因的表达可产生 显著的增强作用。增强子有时位于基因3’端下 游区或在内含子中。
由RNA聚合酶催化的转录过程可分为起始、 延长和终止三个步骤。
7.3.1.1 启动子 标志基因转录起始的位点称启动子。在大
肠杆菌中，启动子被RNA聚合酶的因子所识 别。启动子是一段DNA序列，常位于基因或 操纵子编码顺序的上游，RNA聚合酶结合在上 面。
1. 原核细胞的启动子 原核细胞的启动子在转录起始点的上游有
(2’ω)组成，分子量约46万。完整的RNA聚 合酶，即2’ ω ，称为全酶(holoenzyme)； 没 有 亚 基 的 RNA 聚 合 酶 称 为 核 心 酶
(coreenzyme)。亚基(因子)容易同核心酶解离，
其功能是使核心酶能稳定地结合到DNA的启动
子上，故又称为起始因子。
基因克隆PPT课件
（1）构建 由 pBR 质 粒 与 M13 噬 菌 体 构 建 成 的 双 链 DNA质粒载体，长2674bp，1983年构建。
.
14
主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、
复制起始点（ori）
.
15
（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
基因工程及体外表达体系 （2）.载体
心血管病研究所 王佐
.
1
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。
外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
.
2
.
35
YAC载体序列包括着丝粒序列（CEN1）、端粒序列（TEL 使
线形DNA的完全复制和保护染色体末端免于核酸酶的降解）、
自主复制序列（ARS1 主导染色体DNA的自主复制）、氨苄青
霉素抗性基因（Amp）、源于E.coli的复制起始区（ori）。
.
36
由于酵母细胞内真正必需的DNA片段主要 限于几百碱基对，因而就可以用酵母染色体 复 制 子 ARS 元 件 构 建 新 型 的 克 隆 载 体 。
.
21
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
.
14
主要特点：氨苄青霉素抗性基因、lac Z基因、
复制起始点（ori）
.
15
（2）筛选原理及方法
含 有 来 自 大 肠 杆 菌 的 lacZ 操 纵 子 的 DNA 片 段 （lacZ基因），编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个片 段。此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖 苷酶实现基因内互补（α互补），形成完整的β-半乳 糖苷酶。该酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。
基因工程及体外表达体系 （2）.载体
心血管病研究所 王佐
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1
一、概述
外源DNA一般没有明显的遗传标志，如果 将其导入宿主细胞，没有有效的方法将导 入了外源DNA的细胞和未导入外源DNA的 细胞区分开来。
外源DNA导入宿主细胞后，不能随宿主细 胞的繁殖而复制，达不到使外源DNA片段 扩增的目的。
.
2
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35
YAC载体序列包括着丝粒序列（CEN1）、端粒序列（TEL 使
线形DNA的完全复制和保护染色体末端免于核酸酶的降解）、
自主复制序列（ARS1 主导染色体DNA的自主复制）、氨苄青
霉素抗性基因（Amp）、源于E.coli的复制起始区（ori）。
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36
由于酵母细胞内真正必需的DNA片段主要 限于几百碱基对，因而就可以用酵母染色体 复 制 子 ARS 元 件 构 建 新 型 的 克 隆 载 体 。
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21
λ噬菌体载体在细菌中以溶菌状态生长。它有两种 形式：插入载体和替代载体。
DNA与λ噬菌体载体组成重组DNA分子后，还不能直接 转染宿主细胞，必须首先包装成有活性的成熟噬菌体颗粒 后才具有转染宿主细胞的能力，重组DNA分子能否被噬菌 体包装蛋白、头部所识别而被包装，除必须含有cos位点 外，就是对重组DNA分子长度有严格的限制，必须不能大 于野生型基因组长度的105％或小于75％，否则均不能被 包装成有活性的噬菌体颗粒，因此噬菌体载体大致允许插 入外源基因的长度范围为15～25kb。
基因克隆常用的方法PPT演示文稿
12
图３真核生物12种mRNA的序列特点
13
根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广 泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
2
目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联 系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。 要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相 关库中拿出来,根据整 个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基 因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物 种和分离株之间的差异,为了保证PCR扩增的准确性,有必 要采用两步扩增法,即nested PCR。
基因克隆的几种常用方法
根据已知序列克隆基因 未知序列的基因打靶 根据已知探针克隆基因 用特异抗体克隆基因 特异基因的功能克隆
1
1、根据已知序列克隆基因
对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因 序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。 目前,世界上主要的基因库有: (1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,
图３真核生物12种mRNA的序列特点
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根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广 泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
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目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联 系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。 要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相 关库中拿出来,根据整 个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基 因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物 种和分离株之间的差异,为了保证PCR扩增的准确性,有必 要采用两步扩增法,即nested PCR。
基因克隆的几种常用方法
根据已知序列克隆基因 未知序列的基因打靶 根据已知探针克隆基因 用特异抗体克隆基因 特异基因的功能克隆
1
1、根据已知序列克隆基因
对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因 序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。 目前,世界上主要的基因库有: (1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,
基因克隆的基本理论及实验技术ppt课件
基因克隆的基本理论及实验技术
基因克隆的基本概念及理论知识 第二课时: 基因克隆的操作过程及注意事项
第三课时: 实验操作过程演示(录像)
第一课
基因克隆的基本概念及理论知识
基因克隆的定义：
1. 工具书上： 插入有同一个基因或DNA片段的重组质粒的一个群体，这个群体 是由一个重组质粒增殖而来，通过基因克隆技术可获得某个基因或
PCR扩增 5’ 3’ 3’ 5’ 启动子区序列
基因的编码区及启动子区序列必须通过 连接到质粒上构建成重组表达载体，然 后进行目的片段扩增及功能研究。
什么是质粒（Plasmid）？
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细 胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用 来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很 小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
4969 bp
AMP+
真核表达载体
PCMV
EGFP
pCMV-EGFP
4749 bp
Neo/Kan-R SV40 polyA
目的蛋白表达载体中的表达盒
启动子（Promoter） 基因编码蛋白序列（CDS） 转录终止信号区（CDS）
基因克隆是将DNA或基因组的DNA片段嵌入 克隆载体，再将载体植入培养的宿主细胞，
质粒的重要特征
（1） 是染色质外的环形双链DNA分子； （2）能自主复制，是能独立复制的复制子；
（3）质粒对宿主生存并不是必需的；
（4）质粒上常带有耐抗生素基因； （5）质粒DNA上有多个酶切位点。
限制性核酸内切酶
基因克隆的基本概念及理论知识 第二课时: 基因克隆的操作过程及注意事项
第三课时: 实验操作过程演示(录像)
第一课
基因克隆的基本概念及理论知识
基因克隆的定义：
1. 工具书上： 插入有同一个基因或DNA片段的重组质粒的一个群体，这个群体 是由一个重组质粒增殖而来，通过基因克隆技术可获得某个基因或
PCR扩增 5’ 3’ 3’ 5’ 启动子区序列
基因的编码区及启动子区序列必须通过 连接到质粒上构建成重组表达载体，然 后进行目的片段扩增及功能研究。
什么是质粒（Plasmid）？
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细 胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用 来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很 小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
4969 bp
AMP+
真核表达载体
PCMV
EGFP
pCMV-EGFP
4749 bp
Neo/Kan-R SV40 polyA
目的蛋白表达载体中的表达盒
启动子（Promoter） 基因编码蛋白序列（CDS） 转录终止信号区（CDS）
基因克隆是将DNA或基因组的DNA片段嵌入 克隆载体，再将载体植入培养的宿主细胞，
质粒的重要特征
（1） 是染色质外的环形双链DNA分子； （2）能自主复制，是能独立复制的复制子；
（3）质粒对宿主生存并不是必需的；
（4）质粒上常带有耐抗生素基因； （5）质粒DNA上有多个酶切位点。
限制性核酸内切酶
基因的克隆PPT课件
载体的种类
质粒
1.大肠杆菌质粒 2.革兰氏阳性菌的质粒
噬菌体 真核细胞为宿主的克隆载体
1.酵母为宿主的载体 2.植物细胞为宿主的载体 3.DNA病毒载体
反转录病毒载体
大肠杆菌的质粒
pBR322质粒：它是由4361个核苷酸组成，属于松弛型质粒， 可以用抗氨苄西林和抗四环素基因作为标记，具有多种常用 内切酶的切点。
基因表达产物的鉴定
基因表达：指某基因在细胞中转录为mRNA继而翻译 成蛋白质的过程。
DNA
RNA
Protein
转录
翻译
研究基因表达的手段
1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质） 4、免疫组化 （蛋白质）
1、RT-PCR
基因的克隆 -----ＤＮＡ重组技术。
克隆：是用无性繁殖的方法产生一组遗传上相同的细 胞或生物群体的过程，而这些细胞或个体均来自无性 繁殖的单一原型细胞。
基因的克隆:用ＤＮＡ重组技术使一个基因或ＤＮＡ片 段产生出很多相同拷贝的过程。
基因克隆的技术路线的大体步骤
得出结论
步骤三： 步骤二： 步骤一：
多 克 隆 位 点
X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷
表示 外源 基因 插入 编码 半乳 糖苷 酶的 基因 区段
带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落
不对 能照 是目 培的 养基 基因 变本 色身
使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。 1 . 载体自身环化，产生蓝色菌落； 2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未转化的细胞，不能生长。
目的基因插入 到抗四环素基 因的位置，则 导入菌体后的 菌株则不能在 有四环素的培 养基上生长