高效液相色谱法
高效液相色谱法
2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
（l）气相色谱法：分析对象仅占有机物总数的20％。 高效液相色谱法：分离和分析占有机物总数近80％的那些 高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质。
（2）气相色谱：流动相与组分不产生相互作用力，仅起运 载作用。 高效液相色谱法：流动相对组分可产生一定亲和力，并参与 固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数；
高压输液泵应符合下列要求：密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀。
高压输液泵
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱 柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差。 目前主要使用恒流泵，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械 往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（四）检测系统
两种基本类型的检测器： 溶质型检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、安培检测器等。 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应， 属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电化学检测器
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
§1
概 述
Introduction
一、高效液相色谱法概述
高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优 点，并用现代化手段加以改进。
引入了气相色谱的理论;
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器; 具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点;
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱法教学【全】精选全文
例: 流动相极性变化对组分k’的影响
②更换色谱柱（改变N）
措施： a.选择长柱子(N=L/H) b.填料颗粒尽量小 c.低流速(溶质传质阻力小，峰扩展小) d.低的溶剂粘度(提高柱效)
高效液相色谱法
High Performance Liquid
Chromatography （HPLC）
前言:
HPLC是70年代以后发展最 快的一个分析化学分支，现 已成为生化、医学、药物、 化学化工、食品卫生、环保 检测等领域最常用的分离分 析手段。
我国：
开始仅为少数研究实验室拥有， 现很多的生产、研究、质检部门都拥有。 广泛应用于： 质量控制、分析化验、制备分离。 讲课目的：入门 教材：《实用色谱法》（詹益兴 编著） 学习要求：记好笔记，
ⅰ大分子，扩散系数小 ⅱ小分子，扩散系数大
5. 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，在高效液
相色谱中,速率方程中的分子扩散项B/u较小，可忽略 不计，即 H = A + C u
• 降低传质阻力是提高 柱效主要途径。 •气相和液相Ｈ－ｕ区别
§１－４ 分离度 (Rs)
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
混合物最有效的分离、分析方法。 是一种分离技术。 混合物分离过程：试样中各组分在 固液两相间不断进行着的分配。 一相固定不动，称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定 相的液体，称为流动相。
液相色谱仪
高效液相色谱仪流程图
(1) 存在着浓度差，产生纵向扩散;
(2) 扩散导致色谱峰变宽，H↑(Ｎ↓)，分离变差; (3) B/u与流速有关：流速↓→ 滞留时间↑→ 扩散↑
高效液相色谱法
（2）化学键合固定相 ） B. 极性键合相 极性键合相指键合有机分子 中含某些极性基团，与空白硅胶相比， 中含某些极性基团，与空白硅胶相比，其极性 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 常用的极性键合相有氨基、氰基等。 常用的极性键合相有氨基、氰基等。氨基键合 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈-水 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈 水
二、液相色谱的流动相
1. 流动相特性
（mobile phases of LC） ）
（2）化学键合固定相 ）
化学键合固定相是应用最广的色谱法。 化学键合固定相是应用最广的色谱法。将固定液的官能团键
合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 一般认为有分配与吸附两种功能。 一般认为有分配与吸附两种功能。 a. 硅氧碳键型： 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 硅氧硅碳键型： 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂， c. 硅碳键型： 硅碳键型： d. 硅氮键型： 硅氮键型： ≡Si—C ≡Si—N
4.6
高效液相色谱法
高效液相色谱法(high pressure Liquid 高效液相色谱法 chromatography，HPLC)是利用物质在两 ， 是利用物质在两 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 当两相作相对移动时， 当两相作相对移动时，被测物质在两相之间做 反复多次的分配， 反复多次的分配，这样使原来微小的差异产生 了很大的分离效果，达到分离、 了很大的分离效果，达到分离、分析和测定一 些理化常数的目的。 些理化常数的目的。
高效液相色谱HPLC简介.ppt
种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不
同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
2
操作过程图示
3
色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
4
项目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
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液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的 游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
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液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
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色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
9
检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、 灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。
高效液相色谱法
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特点： 特点： 氰基键合相选择性与硅胶类似 键合相选择性与硅胶类似， ① 氰基键合相选择性与硅胶类似， 但极性更小。相同流动相， 但极性更小。相同流动相，组分保留 时间小于硅胶。 时间小于硅胶。 氨基键合相 主要用于糖类分析， ② 氨基键合相 主要用于糖类分析， 糖类分析专用柱 分析专用柱。 是糖类分析敏度： 紫外、荧光、电化学、 紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏 度检测器使用。 度检测器使用。 最小检测量： 最小检测量： 10-9 ~10-11 g 4. 高度自动化： 高度自动化： 采用色谱专家系统为核心的色谱智 能化和仿真优化技术， 能化和仿真优化技术，使 HPLC不仅能 不仅能 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 而且还可以自动控制色谱条件。 而且还可以自动控制色谱条件。
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2. 流动相极性与容量因子的关系 流动相极性大，洗脱能力增加， 流动相极性大，洗脱能力增加， k 减小，tR 减小；反之， k 与 tR 均 减小， 减小；反之， 增加。 增加。 极性小的组分先出柱
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四、正、反相色谱法 正相HPLC（normal phase HPLC） （ 正相 ） 固定相： 固定相：极性 常用：改性硅胶 硅胶、 常用：改性硅胶、氰基柱 流动相: 非极性（或弱极性） 流动相 非极性（或弱极性） 常用： 正己烷 常用： 流动相极性小于固定相极性
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第二节 分离机制 一、液-固吸附色谱法 固吸附色谱法
(Liquid-Solid Chromatography)
（一）吸附机理 根据吸附剂对样品中各组分的吸 根据吸附剂对样品中各组分的吸 附能力差异而分离 而分离。 附能力差异而分离。 吸附过程是被分离组分的分子 与流动相分子争夺吸附剂表面活性 中心(active center)的结果。 的结果。 中心 的结果
高效液相色谱法
60年代研制出气动放大泵、注射泵及低流量往复式 柱塞泵，但后者的脉冲信号很大，难以满足高效液 相色谱的要求。1970年代，往复式双柱塞恒流泵， 解决了这一问题1970年代后，科克兰制备出全多孔 球形硅胶，平均粒径只有7μm，具有极好的柱效， 并逐渐取代了无定形微粒硅胶。之后又制造出的键 合固定相使柱的稳定性大为提高，多次使用成为可 能。1970年后，适合分离生物大分子的填料又成为 研究的热点。1980年后，改善分离的选择性成为色 谱工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动 相的组成是提高选择性的关键
• 流程：如左图所示，流 动相贮器⑴中的流动相 被泵⑵吸入，经梯控制 器按一定的梯度进行混 合然后输出，测其压力 和流量，导入(3）进样 阀（器）经（4）色谱柱 后到（5）检测器检测， 由（7）记录仪记录色谱 图，（6）为废液。
特点（高效液相色谱法有“四高一广”的特点）：
①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受 到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必 须对载液加高压。 ②高速：分析速度快、载液流速快， 较经典液体色谱法速度快得多，通常 分析一个样品在15～30分钟，有些样 品甚至在5分钟内即可完成，一般小于 1小时。
HPLC已在环境监测中得到广泛应用,特别 适用于分子量大、挥发性低、热稳定 性差的有机污染物的分离和分析如多 环芳烃、酚类、多环联苯、邻苯二甲 酸酯类、联苯胺类、阴离子表面活性 剂有机农药、除草剂等,其中多数属于 美国环保局(EPA)清洁水法案中颁布的 114项优先有机污染物范围。
5.在药品检验中的应用: 现在,在药品质量标准中,对有关物质检查的要 求越来越高,一个药物从合成原料到制备有 关的制剂,再经过贮备、运输、使用,要经过 一段较为复杂和漫长的过程,在此期间,每一 个过程都有可能产生有关的物质,如生产中 可能带入原料、试剂、中间体、副产物和 异构体等;在贮备和运输过程中,可能产生降 解产物,聚合物等。为了保证药物的安全有 效。同时也要考虑到生产的实际情况。因 此,对药物的研究,可以允许有一定量的无害 或低毒性的有关物质液相仪器各厂家的仪 器展。还有对药品的含量测定
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
高效液相色谱原理
高效液相色谱法（HPLC）一、方法原理1、液相色谱法概述高效液相色谱分析法其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构2、高效液相色谱法的特点（HPLC）与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。
由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。
特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。
高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。
高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。
如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。
3、高效液相色谱法的固定相和流动相（1）固定相表面多孔型和全多孔型两大类。
（2）流动相（淋洗液）流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。
从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求：①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。
②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。
③与所用的检测器相匹配。
④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。
⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱效）和适当低的沸点。
⑥应避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人员的安全。
液相色谱法中常用的流动相有正己烷、正庚烷、甲醇、乙腈等。
4、高效液相色谱法的主要类型（1）液—固吸附色谱法①分离原理：基于各组分吸附能力的差异来进行混合物分离的。
②固定相：极性和非极性两种。
极性固定相：硅胶、氧化镁。
高效液相色谱方法及应用
高速、高效、高灵敏度、高自动化。
1.1.2 与气相色谱法比较
应用范围广、更利于选择最佳分离条件且可在常 温下操作。
1.1.3 高效液相色谱法的特点
（1）分离效能高 （2）选择性高 （3）检测灵敏度高 （4）分析速度快 适合于高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离 分析方法。
1.2 高效液相色谱法的分类
按溶质在两相分离过程中的物理化学原理分类 1.2.1 吸附色谱（Adsorption
Chromatography） 1.2.2 分配色谱（Partition Chromatography） 1.2.3 离子色谱（Ion Chromatography） 1.2.4 体积排阻色谱（Size Exclusion
2.3.3 柱温箱的温度控制要求比较精确，因 为流体的粘度受温度的影响较大。
2.4 检测器
2.4.1 检测器的性能指标 （1）噪声 （2）基线漂移 （3）灵敏度 （4）线性范围 （5）检测器的池体积
2.4.2 检测器的种类
2.4.2.1 紫外吸收检测器
（ultraviolet－visible detector，UVD ）
• 进样系统：进样器，进样阀。 • 分离系统：色谱柱，恒温箱。 • 检测系统记录系统：检测器、记录装置
2.1 高压输液系统
2.1.1 贮液罐 2.1.2 流动相脱气
（1）吹氦脱气法 （2）加热回流法 （3）抽真空脱气法 （4）超声波脱气法 （5）在线真空脱气法
2.1.3 高压输液泵
（1）恒流泵：输出恒定体积流量的流动相 （2）恒压泵：又称气动放大泵，输出恒定压力的泵。
Chromatography） 1.2.5 亲和色谱（Affinity Chromatography）
高效液相色谱
应用
由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、 适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工 业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用 极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化 合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固 醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。
液相色谱分离原理及分类
和气相色谱一样，液相色谱分离系统由 两相——固定相和流动相组成。液相色谱的 固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或 在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换 树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。
被分离混合物由流动相液体推动进 入色谱柱。根据各组分在固定相及流动 相中的吸附能力、分配系数、离子交换 作用或分子尺寸大小的差异进行分离。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均 匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需 用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法 (High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。 又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称 现代液相色谱。
敏感，且不适于梯度淋洗。
平面镜
样品
透镜
遮光板
光源
参比
光学零
光电转换 调零
放大器
记录仪
荧光检测器
许多有机物具荧光活性， 尤其是芳香族化合物具有很 强的活性。荧光检测器是一 种选择性很强的检测器，其
灵敏度比UV检测器高2～个数
量级。
电导检测器
电导检测器主要用于离子色谱的检测。 原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电 阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。
流程及主要部件
流程
中国药典-高效液相色谱
分离度(R)
用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的 分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通 过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测 定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其 他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适 当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的 分离度，对色谱系统进行评价与控制。
8
二极管阵列检测器 （diode array detector，DAD）
特点：在任一时间内，均可同时得到
物质在不同波长下的吸收情况，即三
维图谱
多组分混合物的三维图谱
流动相
反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统（采用紫外末 端波长检测时，首选乙腈-水系统），如经试用不适合 时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液 的流动相 由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十 八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动 相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的 随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳 定。
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ห้องสมุดไป่ตู้
正文规定的定量方法如果不是内标法，建议用固定体积的定量环 进样器； 色谱柱通常为不锈钢柱，其尺寸规定在正文中（长度和内径）； 正文中规定的固定相如以字母表示，即指本节所附的固定相，该 固定相的粒度在字母后的括号内写明，有时标明适用牌号，并不 等于别的牌号不能用。 本节所附的固定相有：固定相A为硅胶颗粒，固定相B为表面化学 键合辛烷基硅烷的硅胶颗粒，固定相C为表面化学键合十八烷基 硅烷的硅胶颗粒。 除另有规定外，色谱分离是在恒定的室温下进行，光度检测器的 流通池体积以10ul为宜。对色谱条件的变更未作详细说明，但说 明了分析工作者改变色谱条件，应能得到与要求一致的结果。溶 剂和试剂的质量应适于液相色谱法的应用。
高效液相色谱法
液相色谱法固定相
(三) 离子交换色谱法固定相
1. 薄膜型离子交换树脂: 即以薄壳玻璃珠为担体， 在它的表面涂约 1% 的离子交换树脂而成。
2. 离子交换键合固定相: 用化学反应将离子交换基 团键合在惰性担体表面。
液相色谱法固定相
（四） 亲和色谱固定相
亲和色谱是一种基于分离物与配体间特异
的生物亲合作用来分离生物大分子的技术，它
五 高效液相色谱分离类型的选择
要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的 了解样品
的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应
用范围。选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质 量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度
以及化学结构等物理、化学性质。
1、相对分子质量 对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比
的作用越来越大，主要应用如下：
多环芳烃、农药、酚类、真菌毒素、异腈酸酯等
等。 特别是有机农药方面的检测。
1. 有机氯农药残留量分析
固定相：薄壳型硅胶(37 ～50m)
流动相：正己烷
流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)
检测器：差示折光检测器
可对水果、蔬菜中的农药残 留量进行分析。
极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱
适于分离极性组分
反相色谱——固定液极性 < 流动相极性（RLLC）
极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱 适于分离非极性组分
载体又称担体
(1) 全多孔型担体：
a.
HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球 体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的 Φ 100μ m全多孔型担体。
高效液相色谱法(HPLC)简介
高效液相色谱法分离过程
主要在于固定相的性质、形状及粒度，其次 差别： 是检测手段和输液设备。
经典液相色谱 固定相： 粒度：60~600μｍ（多孔） 柱长：10~200cm（d=10~50mm） n 约为 2~50/m
流动相：靠重力输送
经典液相色谱无在线检测器
缺点：
①粒度范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻 力大。 ②无检测设备，分析速度慢、效率低。 只能作为分离手段
（3）不能完全替代气相色谱
（4）不适于分析受压分解、变性的具有生物活性的
Hale Waihona Puke 生化样品。高效液相色谱法与其他分析方法一样，
不是尽善尽美的。
第二节 高效液相色谱法的基本理论
一、高效液相色谱参数 1.定性参数 tR 、 t 0 、 t’ R t’R= tR- t0 2.柱效参数 σ、 W1/2 、W W=4 σ 或 w=1.699W1/2 n=（ tR / σ）2 H=L/n
四、高效液相色谱法的应用范围和局限性
1.应用范围 高效液相色谱法适于分析高沸点、受热不稳定易 分解、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性 物质和多种天然产物；合成和天然高分子化合物。 涉及石油化工产品、食品、药品、生物化工产品 及环境污染物。约占全部有机物的80%。 2.方法的局限性
（1）使用多种溶剂为流动相，成本高，污染环境 （2）缺少通用检测器
美国药典委员会（USPC）成立于1820年，至今近200 年。出版发行了25版药典。 75年（19版）将HPLC载入药典 20版-62项；21版-363项；22版-871项；23版-1188项； 24版-含量测定法：1386项 鉴别：519项 杂质检查：206项
如今：在评价世界各国药典水平时，HPLC法成为 反映各国药典先进性的重要指标之一。
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HJ997-2018土壤和沉积物醛、酮类化合物的测定高效液相色谱法Soil and sediment—Determination of carbonyl compounds—High performance liquid chromatography（发布稿）本电子版为发布稿。
请以中国环境出版集团出版的正式标准文本为准。
2018-12-26发布2019-06-01实施生态环境部发布目次前言 (ii)1适用范围 (1)2规范性引用文件 (1)3方法原理 (1)4试剂和材料 (1)5仪器和设备 (2)6样品 (3)7分析步骤 (4)8结果计算与表示 (5)9精密度和准确度 (6)10质量保证和质量控制 (7)11废物处理 (7)12注意事项 (7)附录A（规范性附录）方法的检出限和测定下限 (8)附录B（资料性附录）15种醛、酮类腙衍生物的参考色谱图 (9)附录C（资料性附录）方法的精密度和准确度 (10)附录D（资料性附录）2,4-二硝基苯肼（DNPH）的纯化及空白检验 (16)i前言为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国土壤污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范土壤和沉积物中醛、酮类化合物的测定方法，制定本标准。
本标准规定了测定土壤和沉积物中醛、酮类化合物的高效液相色谱法。
本标准的附录A为规范性附录，附录B～附录D为资料性附录。
本标准为首次发布。
本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。
本标准起草单位：天津市生态环境监测中心。
本标准验证单位：国家环境分析测试中心、上海市环境监测中心、沈阳市环境监测中心站、青岛市环境监测中心站、天津市产品质量监督检测技术研究院和天津市滨海新区环境保护监测站。
本标准生态环境部2018年12月26日批准。
本标准自2019年6月1日起实施。
本标准由生态环境部解释。
ii土壤和沉积物醛、酮类化合物的测定高效液相色谱法警告：实验中使用的有机溶剂和标准物质为有毒有害物质，标准溶液配制及样品前处理过程应在通风橱中进行；操作时应按要求佩戴防护器具，避免直接接触皮肤和衣物。
1适用范围本标准规定了测定土壤和沉积物中醛、酮类化合物的高效液相色谱法。
本标准适用于土壤和沉积物中甲醛、乙醛、丙烯醛、丙酮、丙醛、丁烯醛、丁醛、苯甲醛、异戊醛、正戊醛、邻-甲基苯甲醛、间-甲基苯甲醛、对-甲基苯甲醛、正己醛、2,5-二甲基苯甲醛等15种醛、酮类化合物的测定。
当取样量为10g，定容体积为10ml时，15种醛、酮类化合物的方法检出限为0.02 mg/kg~0.06mg/kg，测定下限为0.08mg/kg~0.24mg/kg。
详见附录A。
2规范性引用文件本标准内容引用了下列文件或其中的条款。
凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
GB17378.3海洋监测规范第3部分样品采集、贮存与运输GB17378.5海洋监测规范第5部分：沉积物分析HJ494水质采样技术指导HJ613土壤干物质和水分的测定重量法HJ/T166土壤环境监测技术规范3方法原理土壤和沉积物样品用醋酸-醋酸钠溶液振荡提取，提取液中醛、酮类化合物在一定温度和pH值下与2,4-二硝基苯肼（DNPH）发生衍生化反应，生成稳定的腙类化合物，经萃取浓缩后，用高效液相色谱分离，紫外检测器检测，根据保留时间定性，外标法定量。
4试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂。
实验用水为二次蒸馏水或纯水设备制备的水，使用前需经过空白检验，确认目标化合物浓度低于方法检出限。
4.1氯化钠（NaCl）。
400℃灼烧4h，稍冷后置于干燥器中冷却至室温，转移至磨口玻璃瓶中，于干燥器中保存。
4.2无水硫酸钠（Na2SO4）。
400℃灼烧4h，稍冷后置于干燥器中冷却至室温，转移至磨口玻璃瓶中，于干燥器中保1存。
4.3醋酸钠（CH3COONa）。
4.4冰醋酸（CH3COOH）：含量≥98%。
4.5柠檬酸（C6H8O7）。
4.6柠檬酸钠（C6H5Na3O7·2H2O）。
4.72,4-二硝基苯肼[NH2NHC6H3(NO2)2，DNPH]：纯度≥99%。
4.8乙腈（CH3CN）：液相色谱纯。
4.9二氯甲烷（CH2Cl2）：液相色谱纯。
4.10氯化钠溶液：ρ（NaCl）=0.365g/ml。
称取36.5g氯化钠(4.1)，用水溶解定容至100ml。
4.11提取剂：醋酸-醋酸钠溶液。
称取5.3g醋酸钠（4.3），用水溶解后加入2.0ml冰醋酸（4.4），用水稀释定容至1L。
4.12缓冲溶液：pH≈3。
称取84.0g柠檬酸（4.5）和29.4g柠檬酸钠（4.6），用水溶解定容至500ml。
4.13衍生剂：ρ（DNPH）=3.00mg/ml。
称取3.00g2,4-二硝基苯肼（4.7）于乙腈（4.8）中，用乙腈溶解定容至1L。
4.14醛、酮类-DNPH标准溶液：ρ=100μg/ml（以醛、酮类化合物计）。
包括甲醛-DNPH、乙醛-DNPH、丙烯醛-DNPH、丙酮-DNPH、丙醛-DNPH、丁烯醛-DNPH、丁醛-DNPH、苯甲醛-DNPH、异戊醛-DNPH、正戊醛-DNPH、邻-甲基苯甲醛-DNPH、间-甲基苯甲醛-DNPH、对-甲基苯甲醛-DNPH、正己醛-DNPH、2,5-二甲基苯甲醛-DNPH。
溶剂为乙腈（4.8）。
可购买市售有证标准溶液。
4.15醛、酮类标准贮备液：ρ=1000μg/ml。
包括甲醛、乙醛、丙烯醛、丙酮、丙醛、丁烯醛、丁醛、苯甲醛、异戊醛、正戊醛、邻-甲基苯甲醛、间-甲基苯甲醛、对-甲基苯甲醛、正己醛、2,5-二甲基苯甲醛。
溶剂为乙腈（4.8）。
可购买市售有证标准溶液。
4.16醛、酮类标准使用液：ρ=100μg/ml。
移取1.00ml醛、酮类标准贮备液（4.15）于10ml容量瓶中，用乙腈（4.8）稀释定容。
4℃以下可冷藏保存2个月。
4.17石英砂：粒径为0.297mm~0.84mm（50目~20目）。
400℃灼烧4h，稍冷后置于干燥器中冷却至室温，转移至磨口玻璃瓶中，于干燥器中保存。
4.18玻璃纤维滤膜：孔径0.45μm。
4.19氮气：纯度≥99.9%。
5仪器和设备5.1高效液相色谱仪：具紫外检测器或二极管阵列检测器。
5.2色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱（C18），填料粒径5.0μm，柱长250mm，内径4.6mm，或其他等效色谱柱。
25.3样品瓶：不小于60ml具聚四氟乙烯-硅胶衬垫螺旋盖的棕色广口玻璃瓶。
5.4振荡器：水平振荡器或翻转振荡器。
5.5恒温振荡器：温度精度为±2℃。
5.6萃取设备：固相萃取装置或液液萃取装置。
5.7浓缩设备：旋转蒸发装置、K-D浓缩仪或氮吹浓缩仪等性能相当的设备。
5.8天平：感量为0.01g。
5.9固相萃取柱：C18柱或其他等效固相萃取柱，规格为1000mg/6ml或更大容量规格。
5.10分液漏斗：250ml，聚四氟乙烯活塞或不涂润滑油的玻璃活塞。
5.11提取瓶：200ml，具聚四氟乙烯-硅胶衬垫螺旋盖的玻璃瓶。
5.12平底烧瓶：200ml，具塞平底玻璃烧瓶。
5.13一般实验室常用仪器和设备。
6样品6.1样品采集和保存按照HJ/T166的相关规定进行土壤样品的采集和保存。
按照HJ494的相关规定进行水体沉积物样品的采集。
按GB17378.3的相关规定进行海洋沉积物样品的采集。
用铁铲或不锈钢勺将样品尽快采集至样品瓶（5.3）中，并填满。
快速清除掉样品瓶螺纹及外表面上黏附的样品，密封样品瓶，避光保存。
如不能及时分析，于4℃以下冷藏，5d 内完成衍生及萃取，衍生化提取物在7d内分析完毕。
6.2样品的制备去除样品中的异物（石子、叶片等），称取10g（精确到0.01g）样品于提取瓶（5.11）中。
同时称取另一份样品用于测定干物质含量或含水率。
6.3水分的测定按照HJ613测定土壤样品干物质含量，按照GB17378.5测定沉积物样品含水率。
6.4试样的制备6.4.1提取在装有样品（6.2）的提取瓶中，加入200ml提取剂（4.11），密封，在振荡器（5.4）中振荡不少于18h，用玻璃纤维滤膜（4.18）过滤，收集提取液，待衍生。
6.4.2衍生取100ml提取液（6.4.1）于平底烧瓶（5.12）中，加入4ml缓冲溶液（4.12）、6ml衍生剂（4.13），置于恒温振荡器（5.5）中，40℃振荡1h。
注：可使用可控温超声清洗器或超声萃取仪代替恒温振荡器，超声时间不少于30min，超声温度不超过40℃±2℃。
36.4.3萃取和浓缩6.4.3.1固相萃取法将固相萃取柱（5.9）固定在固相萃取设备（5.6）上，分别用10ml乙腈（4.8）和10ml 水活化萃取柱。
向衍生后的溶液（6.4.2）中加入10ml氯化钠溶液（4.10），并转移至萃取柱，上样速度为3ml/min~5ml/min。
再用10ml水冲洗容器和管路，完成后继续抽吸1min。
用9ml乙腈（4.8）以3ml/min~5ml/min的流速洗脱萃取柱，收集洗脱液至10ml容量瓶中，用乙腈（4.8）稀释至标线，混匀，待测。
6.4.3.2液液萃取法将衍生后的溶液（6.4.2）转移至分液漏斗（5.10）中，加入1.5g NaCl（4.1），分别用15ml和10ml二氯甲烷（4.9）分两次萃取，合并萃取液，萃取液经无水硫酸钠（4.2）脱水，用浓缩设备（5.7）浓缩至近干，更换溶剂为乙腈（4.8），用乙腈准确定容至10ml，混匀，待测。
注：高浓度样品可适当增加一次萃取。
6.5空白试样的制备以石英砂（4.17）代替样品，按照与试样的制备（6.4）相同的步骤进行空白试样的制备。
7分析步骤7.1参考色谱条件流动相：60%乙腈+40%水，等度洗脱，保持30min；检测波长：360nm；流动相流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl。
7.2标准曲线的建立分别移取适量的醛、酮类-DNPH标准溶液（4.14），用乙腈（4.8）配制成质量浓度为0.03 mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L和1.50mg/L的标准系列。
按照参考色谱条件（7.1）进行测定，以标准系列目标化合物浓度为横坐标，以其对应的峰面积或峰高为纵坐标，建立标准曲线。
7.3参考色谱图15种醛、酮类腙衍生物在C18柱（5.2）上的色谱图见图1。
注：其他不同类型色谱柱分离情况参见附录B。
451.甲醛-DNPH ；2.乙醛-DNPH ；3.丙烯醛-DNPH ；4.丙酮-DNPH ；5.丙醛-DNPH ；6.丁烯醛-DNPH ；7.丁醛-DNPH ；8.苯甲醛-DNPH ；9.异戊醛-DNPH ；10.正戊醛-DNPH ；11.邻-甲基苯甲醛-DNPH ；12.间-甲基苯甲醛-DNPH ；13.对-甲基苯甲醛-DNPH ；14.正己醛-DNPH ；15.2,5-二甲基苯甲醛-DNPH 。