5 微生物工程 第五章 发酵工业种子制备

而且会降低产量。
放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种龄对多糖产量的影响

接种量过多，菌丝生长过快、溶氧不足，
衰老细胞增加等，发酵后劲不足

接种量过少延长发酵周期，形成异常形 态，而且易造成染菌。

以生产菌种在发酵罐中的繁殖速度为依 据

接种量的大小直接影响发酵周期。
接种量：
概念：移入的种子液体积和接种后培
3、二级种子(种子罐)
培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解 糖代替，浓度为2.5% 培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐 的1%）, 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
种子的质量要求： 108-109个/mL 大小均匀，呈单个或八字排列 pH 7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2 活力旺盛
放线菌发酵时的种子扩大培养
斜面培养，制备孢子悬浮液作初级种子 也可用培养摇瓶菌丝体作为初级种子
谷氨酸生产种子制备
制备过程
斜面菌种 → 一级种子培养 → 二级种子培养
→ 发酵
1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2 培养条件：32℃，生长18-24小时
第五章
发酵工业的种子制备
本章内容：
种子制备原理与技术
影响种子质量的因素
种子质量的控制措施 种子制备的放大原理与技术
发酵工程的工艺流程
培养基配制
种子扩大培养
培养基灭菌
空气除菌 发酵设备
发酵生产
产品
下游处理
废弃物资 源化、无 害化
5 L小试
5 L-50 L二级发酵装置 摇瓶-小试-中试
的不同对孢子质量的影响也不同。
例2：制备霉菌用的大(小)米，其产地、颗粒大小、
均匀程度不同，孢子质量也不同。
例3：蛋白胨加工原料不同，对孢子影响也不同。
例4：琼脂的牌号不同，其中含无机离子的差别而引
起孢子质量的变化。
例5：水质的硬度、污染程度对生产均有影响。
培养温度
温度过低，菌种生长发育缓慢
温度过高，会使菌丝过早自溶
重点
扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，
完成实验室种子制备；
一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定
扩大级数，完成生产车间种子制备；
种子转种至发酵罐
工业发酵种子制备过程：
实验室种子制备阶段：
琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄
子瓶斜面培养等）或液体摇瓶培养；
生产车间种子制备阶段：
培养条件：27℃、10-14小时
接种量：10%
种子的质量要求：
菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢， 处于Ⅲ—Ⅳ期
青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，14为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强
1. 在种子扩大培养过程中，一般采用的接种龄是以
下哪个时期的。（
C、衰减期
）
B、稳定期 D、延滞期
A、对数生长期
“滚瓶”技术应用于产黄青霉的孢子生产

在固体培养基上产生孢子 在谷类的颗粒表面形成大量的孢子

在液体深层培养基中产生孢子
菌丝体作为接种物
不能产生无性孢子的用繁殖体菌丝作为
接种物，
如生产赤霉素的菌种——藤仓赤霉
问题：难以获得均一的接种物
接种前将菌丝打成碎片，形成大量的菌丝
段，它具有大量的生长点
种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控
制，并减少由于多次转种而带来的染菌机
会以及减少因种子罐生长异常而造成的发
酵波动 ；
种子罐级数设计需考虑能否在一定时间内
获得优质、足量的种子以满足发酵的需求。
15L种子发酵罐
种龄与接种量
接种龄
概念：种子罐中培养的菌体从开始移入 下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 种子培养期应取菌种的对数生长期为宜， 菌种过嫩或过老，不但延长发酵周期，
培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高 比表面积和氧的传质，营养适当（要
求大米的白点小）有利于孢子的生长。
大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子
3、一级种子
培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 培养条件：27℃，40小时 接种量：200亿孢子/吨 目的：长菌体
4、二级种子
培养基：同一级种子
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细
生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续
传代不超过3次
2、一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%，
K2HPO4 0.1%
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250 mL, 32℃培养12小时。
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料 已经基本接近于发酵培养基
青霉素生产种子制备
制备过程
安瓿管 → 斜面孢子 → 大米孢子 → 一级种子
→ 二级种子
→ 发酵
1、斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白源自文库等
培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
2、大米孢子
培养基：大米及氮源（玉米浆）
培养条件：25℃、7天，控制湿度
的酶易氧化变性，泡沫过多增加染菌机会， 增加能耗；
丝状微生物不宜剧烈搅拌。
斜面冷藏时间
对孢子的生产能力有较大影响 冷藏时间越长，生产能力下降越多
培养基
培养种子的目的：
扩大培养，增加细胞数量； 同时也必须培养出强壮、健康、活性高
的细胞。为了使细胞迅速进行分裂或菌 丝快速生长。
种子培养基特点：
有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充
足氮源和生长因子，无机氮源比例大；
各种营养物质的浓度不必太高； 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收
利用的碳源和氮源；
应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
pH
选择最适种子培养pH的原则是获得最
大比生长速率和适当的菌量。
培养最后一级种子的培养基的pH应接
溶解氧的作用：参与菌体呼吸作用;
搅拌：促进氧的溶解与营养物质及代谢产物的 扩散。 通气量的多少以溶解氧的多少来衡定。
通气过程中，影响溶解氧的因素：
菌种； 培养基性质；
培养阶段； 发酵罐的结构；
足够的通气量，以保证菌种代谢正常，提
高种子的质量。
搅拌可提高通气效果，促进生长繁殖，
过度搅拌导致培养液大量涌泡，液膜表面

斜面冷藏时间 培养基 pH
原材料质量
原材料质量波动引起种子质量不稳定。 原材料质量波动的主要原因：无机离子
含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+ 能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少 也会影响孢子的质量）。
例1：四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养
基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量
2．产芽孢细菌在分批发酵过程中的哪个时期大
量产生芽孢（ C．稳定期 ）
A．延滞期
B．对数期
D．衰亡期
名词解释：接种龄
简答题： • 优良种子应具备的条件？
• 为什么细菌发酵时种子最好是在对数生长期接种？
长迟滞期
为什么细菌发酵最好是在对数生长期接种？
种子浓度够 代谢活力强
重点
举 例：
梭状芽孢杆菌发酵丁醇－丙酮 时种子扩大培养的程序
酵母发酵时的种子扩大培养
酿酒酵母的扩大培养
最初采用纯种进行酵母发酵并设计出酵
母繁殖流程，他将每一步的接种量规定 为10％，并控制繁殖条件与酿造时一致
现代的流程中，接种量为1%或更低，控
液体培养法：液体试管、三角瓶摇床
振荡或回旋式培养。
表面培养法：茄子瓶、克氏瓶或瓷盘
培养。
固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏
瓶、培养皿等麸皮培养。
生产车间种子制备
实验室制备的孢子斜面或摇瓶种子移接
到种子罐进行扩大培养。
种子罐培养目的:
1、获得足够的菌种数量， 2、种子罐的培养基接近发酵罐培养的 醪液成分和培养条件，使菌体适应发酵 环境 。
制的条件也与酿造时不同。
面包酵母的扩大培养
初始种子培养也要求采用纯种培养 大容积发酵培养时，没有无菌要求
面包酵母时的种子扩大培养的程序
丝状真菌发酵的种子扩大培养
丝状真菌既可以利用孢子，也可 以利用菌丝体作为接种物接种到发酵
罐进行发酵
利用孢子作为接种物

在固化的培养基上产生孢子
湿度
湿度低，孢子生长快； 湿度大，孢子生长慢
。
不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响
相对湿度（%） 16.5~19 斜面外观 上部稀薄、下部稠略黄 活孢子计数（亿/支） 1.2
25~36
40~45 70~80
上部薄、中部均匀发白
一片白，孢子丰富，稍皱 一片白，粘稠状
2.3
5.7 3.6
通气与搅拌
近于发酵培养基的pH，以便种子能尽 快适应新的环境。
种子质量的控制措施
菌种稳定性检查
适宜的生长环境
种子无杂菌检查
种子制备的放大原理与技术
细菌发酵时的种子扩大培养：
细菌发酵过程中种子扩大培养的主要目
的是为了获得大量的活力强的种子 ；
种龄对于生芽孢的种子尤其重要。若接
种物含大量芽孢，将给后续发酵带来较
种子质量的判断方法：
通常检测的培养液中参数
pH是否在种子要求的范围之内
糖、氨基氮、磷酸盐的含量
菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观
有无杂菌污染
其他参数
如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾气等
实验室准备阶段
放罐，后处理
生 产 车 间 阶 段
产品
种子制备步骤：
斜面培养基中活化；
一、种子制备原理与技术
优良种子应具备的条件：
生长活力强，延迟期短； 生理状态稳定； 浓度及总量能满足发酵罐接种量的要求； 无杂菌污染，保证纯种发酵； 适应性强，生产能力稳定
重点
种子罐级数的确定
种子扩大的级数： 制备种子需逐级扩大
培养的次数
级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并
可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消 毒及值班工作量，减少因种子罐生长异 常而造成的发酵波动。
种子罐级数确定方法：
菌种的性质(如菌种传代后的稳定性); 瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度; 发酵罐中种子培养液的最低接种量; 种子罐与发酵罐的容积比; 生产规模; 随工艺条件的改变作适当的调整。
养液体的体积的比例 。
大量地接入培养成熟的菌种的优点：
缩短生长过程的延缓期，因而缩短了
发酵周期，提高了设备利用率；
节约发酵培养的动力消耗； 有利于减少染菌机会。
在放射形土壤杆菌多糖（ARPS） 发酵过程中不同的接种量对多糖产量的影响
影响种子质量的因素
原材料质量 培养温度 湿度 通气与搅拌
种子罐扩大培养
实验室种子制备
无菌方式接保藏的菌种至斜面培养基上，成
熟后挑选正常菌落至试管斜面和摇瓶；
菌种产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖迅
速，可用固体培养基培养孢子；
菌种产孢子能力不强或孢子发芽慢，可用摇
瓶液体培养法；
不产孢子的菌种，保藏基础上，在一定温度
下活化即可。
种子扩大培养阶段