PCR分子诊断技术

实时荧光定量PCR法
概念
指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的 先后顺序以及信号强弱的变化来及时分析目的基因的拷贝 数目，通过与已知量的标准品进行比较，实现实时定量的 方法。 反应过程 在实时荧光定量PCR反应过程中，对整个过程进行了实 时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时 间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。 产生的DNA拷贝数是呈指数方式“S”增加的，随着反应循 环数的增加，最终不再以指数方式生产模板，而进入“平 台期”。
PCR分子诊断技术
2016.12.27
内容
PCR技术的概念及发展简史
Байду номын сангаас
PCR反应的基本成分
PCR基本原理和反应过程 实时荧光定量PCR检测基本原理和方法 PCR技术的应用、临床意义及发展趋向 临床PCR检验的实验室管理
PCR技术的概念及发展简史
PCR概念 PCR的由来是Polymerase chain reaction的首个字母 的组合，是聚合酶链式反应的简称，是一项体外扩增DNA 序列的技术。 PCR发展简史 1985年美国科学家Kary Mullis在Science杂志上发 表了第一篇PCR的学术论文，从此PCR技术得到了生命科 学界的认同，并与1993年获得了诺贝尔化学奖。 1
PCR临床意义：
快速确诊是否有病毒、细菌等致病性微生物感染；
了解体内感染的数量、复制程度，是否具有传染性； 对临床治疗的用药监测，有无好转或耐药情况，如 产生耐药，如何指导用药种类及计量等。 PCR的发展趋势
随着临床分子生物学的不断发展，DNA测序技术 已逐渐成熟，可为临床疾病的分子诊断提供更精确的 判定依据，现由一代测序技术已发展至三代测序技术， 为医疗领域带来更方便、快捷的检测手段。
延伸：在Taq DNA聚合酶的作用下，DNA模板上的引 物以dNTP为原料，按A－T、C－G碱基配对与半保留复制 原则，合成一条新的与模板DNA链互补的链。
3
重复上述变性－退火－延伸的循环过程，每一循 环获得的“半保留半复制”链继续成为下次循环的模 板。通常一个完整的循环时间需要2-4min，2-3h就能 将靶核酸放大几百万倍。 一般临床扩增目的核酸将循环次数设定在40-50 个循环之间，以此达到扩增目的。
脱氧核甘三磷酸（dNTP）
标准PCR反应体系中包含4种等物质的量浓度的脱氧核甘三 磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
二价阳离子 所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子，常 用的是Mg2＋，Mn2+ 缓冲液 维持PCR反应体系中的PH，使用Tris－Cl缓冲液。 一价阳离子 标准的PCR缓冲液中包含50mmol／L的KCl，有益于 DNA片段的扩增。
临床PCR检验的实验室管理
PCR实验室的布局设计 临床PCR检验标本的采集、运送 PCR核酸检测的工作流程 PCR污染的产生及预防措施 实时荧光PCR扩增仪简介 临床PCR检验的质量控制 实验室质量管理体系的建立
1988年saiki 从水生嗜热杆菌中提取到一种耐热 DNA聚合酶，此酶能耐高温，在热变性中不会失活， 从而解决了PCR操作技术中酶钝化为实际操作而带来 的困扰，极好的提高了PCR的扩增效率，从此，此酶 被命名为 Taq DNA聚合酶。 自PCR方法不断改进后，现PCR方法已衍生几十 种之多，目前实时荧光定量PCR方法已被临床广泛应 用，不仅可以用于定性检测而且可以确定原始样品含 量。广泛应用于遗传学、微生物学乃至整个生命科学 研究中，由于PCR方法有着极强的实用性，因此仍会 被不断完善，进一步在生命科学研究中发挥更好的作 用。
PCR的特点
特异性高 包括：引物的特异性及延伸时，碱基配对的正确性； Taq DNA聚合酶的稳定性。 灵敏度高 PCR扩增产物的量以指数方式增长，能在2-3h内，将1 个靶分子DNA扩增至10亿个分子，因此一个反应体系中如 有2-3个靶分子，则可成功检测出目的基因。 简便快速
通过PCR技术可在2-4小时之内获得目的基因，为临床患 者提供快速准确的确诊检测。
特点 操作简便、快速、高效、较高的灵敏性及特异性、 污染性低。
PCR技术的临床应用、意义 及发展趋向
PCR临床应用 感染性疾病的诊断与治疗 包括：病毒：肝炎病毒、HIV、HPV、流感病毒等 细菌：结核杆菌、TP、UU、CT、NG等 寄生虫：弓形虫、疟原虫等 遗传性疾病的诊断及预防 包括：染色体疾病、血红蛋白病、血友病、遗传性耳聋、糖尿病等 肿瘤标志物的监测与诊断 包括：乳腺癌、肠癌、白血病等 个体化用药的临床指导 包括：药物作用靶点相关基因、药物代谢酶基因、药物副作用相关基因等
PCR反应的基本成分
模板 是待扩增序列的核酸，包括基因组DNA、质粒DNA、噬 菌体DNA、cDNA、mRNA和细胞等都可以作为PCR反应的模板。 特异性引物 是与靶DNA 3’和 5’端特异性结合的寡核苷酸片段， 是决定PCR特异性的关键。当每条引物都能特异性地与模板 DNA中的靶序列复性形成稳定的结构，才能保证其特异性。 热稳定DNA聚合酶 是PCR技术实现自动化的关键，是从嗜热古细菌中最 早分离出的，最常用的DNA聚合酶。 2
4
实时荧光定量PCR法
荧光阈值和循环阈值
荧光阈值（threshold） 概念：是在荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准， 即PCR扩增产物量的标准。
循环阈值（cycle threshold value，Ct）
概念：PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设 定的荧光阈值时所经过的扩增循环次数。
PCR的基本反应原理和特点
PCR原理 PCR基本过程类似于DNA的天然复制，特异性依赖于 靶序列两端互补的寡核苷酸引物。整个过程由变性－退火 －延伸三个基本反应步骤构成。 变性：模版DNA经加热至94℃左右，双链之间的氢键 断裂，双股螺旋解链，变成两条单链，为与引物结合做准 备。 退火：DNA加热变性成单链后，当温度降至一定程度 （55℃左右）时，引物即与模板DNA单链的互补序列配对 结合。