分子病理学常用研究技术原理及应用精品PPT课件
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分子植物病理学_PPT幻灯片
5.1 病原菌致病相关基因的研究进展
致病性基因(Pathogenicity genes)是病原均与寄主植物 互作过程中决定对植物致病性的基因。它决定着病原菌在 寄主植物过程中与植物建立寄生关系，破坏寄主植物细胞 正常生理代谢功能以及调控对植物的吸附、侵染、定植扩 展和最终显症等过程。致病基因主要包括毒性基因和无毒 基因,前者决定对植物表现亲和性,即调控病害的发生与发 展;后者决定病原菌小种与含相应抗病基因的寄主植物品种 表现专化性不亲和。
1944, 发现农杆菌侵染的植物组织可以在不加激素 的培养基上生长。
1970，G.Morel et al.发现农杆菌致病菌有两种类型， 其区别在于对两种不常见Arg衍生物章鱼碱（octopine）和 胭脂碱（nopaline）的代谢不同。
1973,J.A.Lippincoot证明，无致病力菌株丧失对N.T.Keen首次报道从菊欧氏杆菌(E.Chrysanthemi) 中克隆到果胶裂解酶基因后,发表了有关欧氏杆菌中2个种pel 基 因克隆的报道,其中涉及编码5个主要同工酶的5个pel基因.
假单胞细菌(Pseudomonas.spp.)
茄青枯假单胞(P.solanacearum) 丁香假单胞(P.syringae)
★ 植物病毒病害的分子生物学研究
1935，W. M. Stanley 成功分离出TMV结晶，并证明结 晶的大部分组成是protein.
1937,E. C. Borden ﹠N. w. Pirie 报道了TMV的化学组 成，提出该病毒由95％protein 和5％RNA组成．
农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）
3、主要研究方法（main strategy）
◆ 从“里”到“外”：以研究寄主和病原物的基
分子病理学常用研究方法 ppt课件
分子病理学常用研究方法 ppt课件
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随机引物法
5’ 3’ 5’ 3’
5’
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3’
3’
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5’
3’ 分子病理学常用研究方法 ppt课件
3’
5’
3’ 5’
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1.于Eppendorf离心管中依次加入
15μl ddH2O
1μg DNA(10ng-3μg)
100℃ 10'(变性)
干冰聚冷30秒钟
2.加入10×六核苷酸混合物
3’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
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5’
5’ 22
随机引物法：单/双链线状DNA标记，100-500bp亦可 DNA用量少(可少至10ng) 标记率高(1/20-25)
原理：以任意顺序的六核苷酸片段为引物与单链DNA 模板结合后，在DNA 聚合酶 I 的Klenow片段 (无5'-3'外切酶活性) 作用下合成带标记核苷酸 的互补DNA链(探针)
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标记方法
引入法：运用标记好的核苷酸合成探针 缺口翻译法 随机引物法 末端标记法 PCR扩增标记法 RNA体外合成法
化学修饰法：化学修饰已合成的探针
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缺口翻译/平移法：双链DNA标记，线环状均可 分子较大(>1KB)者效果好 DNA用量较多(>200ng) 标记率低
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2.探针的标记 标记物：同位素, 非同位素, 修饰物
同位素：敏感，定位较差，实验室要求高 探针使用周期短
分子生物学技术在病理学中的应用 ppt课件
ppt课件 19
ppt课件
20
•
ppt课件
21
寡核苷酸探针
• 近年应用较多的寡核苷酸探针，常为2030个碱基，分子量小，有利于探针进入 细胞内，无须采取提高细胞通透性的措施。 • 非克隆性DNA探针，在无cDNA的情况下， 可根据已知文献发表的共同序列由DNA 合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列人工 合成。
• 包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的 漂洗。 • RNA探针杂交时产生的背景染色特别高， 但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染 色，获得较好的反差效果。在杂交后漂洗 中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基 配对RNA除去。 • 一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到 低而温度由低到高。 • 切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的 溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而 增强了背景染色。 26 ppt课件
ppt课件 30
CISH
• 显色原位杂交法（Chromogenic in situ
hybridization，CISH）
• 2000年Tanner首次报道了采用CISH 法检测HER2基因扩增的可行性,研究显 示CISH与FISH具有极强的一致性。 • 高度特异性的地高辛标记探针进行原 位杂交，传统的过氧化物酶显色反应 染片过程，在普通光学显微镜下定量 检测基因的扩增，操作简单，价格远 较FISH低廉，且信号稳定，组织切片 储藏方便，并可做组织学评价。 31 ppt课件
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22
寡核苷酸探针
• 制造方便，价格低廉，也可进行放 射性与非放射性标记
• 特异性不如克隆性探针强，亦不如 其杂交信号高
ppt课件
23
成套ISH试剂盒
• 病毒系列(EBV、HBV、HCV、HPV 等) • 癌基因系列（bcl-2、cyclinD1、 nm23、P16、P21等） • 细胞因子系列(EGF、bEGF )
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•
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寡核苷酸探针
• 近年应用较多的寡核苷酸探针，常为2030个碱基，分子量小，有利于探针进入 细胞内，无须采取提高细胞通透性的措施。 • 非克隆性DNA探针，在无cDNA的情况下， 可根据已知文献发表的共同序列由DNA 合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列人工 合成。
• 包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的 漂洗。 • RNA探针杂交时产生的背景染色特别高， 但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染 色，获得较好的反差效果。在杂交后漂洗 中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基 配对RNA除去。 • 一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到 低而温度由低到高。 • 切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的 溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而 增强了背景染色。 26 ppt课件
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CISH
• 显色原位杂交法（Chromogenic in situ
hybridization，CISH）
• 2000年Tanner首次报道了采用CISH 法检测HER2基因扩增的可行性,研究显 示CISH与FISH具有极强的一致性。 • 高度特异性的地高辛标记探针进行原 位杂交，传统的过氧化物酶显色反应 染片过程，在普通光学显微镜下定量 检测基因的扩增，操作简单，价格远 较FISH低廉，且信号稳定，组织切片 储藏方便，并可做组织学评价。 31 ppt课件
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寡核苷酸探针
• 制造方便，价格低廉，也可进行放 射性与非放射性标记
• 特异性不如克隆性探针强，亦不如 其杂交信号高
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成套ISH试剂盒
• 病毒系列(EBV、HBV、HCV、HPV 等) • 癌基因系列（bcl-2、cyclinD1、 nm23、P16、P21等） • 细胞因子系列(EGF、bEGF )
分子病理学教学课件ppt
蛋白质纯化
通过色谱、电泳等技术将目的蛋 白质从混合物中分离出来。
蛋白质分析
利用质谱、光谱等技术对蛋白质的 结构、功能和相互作用进行分析。
细胞培养与转染
细胞培养
将细胞在体外进行培养，以观 察其生长和分化过程。
转染方法
利用物理、化学等方法将外源 DNA导入宿主细胞。
转染效率评估
通过分子生物学技术检测外源 DNA在细胞中的转染效率。
转录后修饰的类型
转录是基因表达的第一步，由RNA聚 合酶催化，生成RNA分子。
转录后修饰包括5'端帽子修饰、3'端 尾巴修饰及RNA剪接修饰等，这些修 饰对于RNA分子的稳定性和翻译效率 具有重要影响。
要点三
转录调控元件与疾病
转录调控元件是调节基因表达的关键 部位，其变异可导致多种疾病，如癌 症等。
THANKS
谢谢您的观看
详细描述
生物信息学方法可以用于处理和分析大规模的生物数据，如基因组学、转录组学和蛋白质组学数据等。这些方 法可以用于寻找基因变异、基因表达谱分析、蛋白质相互作用等，有助于揭示疾病的分子机制和寻找新的治疗 靶点。同时，这些方法还可以用于评估疾病的风险和预后，为临床决策提供依据。
基于干细胞与免疫细胞的分子病理学研究
自身免疫性疾病的分子病理学研究
自身免疫性疾病的病因
系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病与免疫细 胞功能异常、自身抗体产生等分子机制密切相关。
自身免疫性疾病的诊断
通过检测自身抗体、炎症因子等生物标志物，有助于早期诊断自 身免疫性疾病。
自身免疫性疾病的治疗
针对免疫细胞功能异常和自身抗体产生的分子机制，开发出免疫 抑制剂、生物制剂等新型治疗策略。
病理学常用技术的原理及应用_病理学课件
积，包括长度、阔度、高度（厘米），实质性肿瘤量
直径，浅表部的肿瘤应注意其与皮肤的关系，是否凸 出皮面，与皮肤有无粘连，四周有无正常的皮肤组织。 注意肿瘤的质地（硬实、中等、软）各处的坚实 度是否一致，有无与周围组织粘连的情况。
• •
切面应暴露肿瘤的最大面积，以便较全面观察肿瘤内
部，巨型肿瘤应多作平行切面；
关的病理检查，应与旧片做对比。观察完毕后要提出
•
• 染色各步骤所需的时间，常受温度、切片厚度等影响。可根 据镜下观察所见酌予调整，但对组织化学反应（尤其是酶）， 其时间、温度等因素务必恒定，且应做对照片。染液着色力 显著减退时应更新，染色反应不正常，应检查染液及试剂是 否失效或误用；
• 染色过程中，勿使切片干燥，以免影响细胞状态。染色完毕 后用显微镜检查染色结果，是否符合要求，并核对标本种类、 号码、数量是否无误； • 火棉胶切片除可做常规染色外，尚可做常用特殊染色及PAS、 DNA、RNA等主要组织化学染色。卡红（Carmine）使火棉胶着 色，含此染料的染色效果不佳。
石蜡包埋
• 包埋时先将融蜡倾入模型，然后以钝头热镊夹取组
织块，使病灶或指定面向下（包埋分层次的组织在
蜡中安放平正。注意防止混杂组织号码小条埋入
蜡块一侧；
•
•
蜡稍凝后，即移入冷水中加速凝固；
蜡块的大小，以在组织周围包有1~2mm之蜡为宜。
蜡块做成正方形或长0方形，以便切片。
石蜡切片法
• • • • 将切片刀装在持刀座上，刀刃与蜡块表面呈50夹角。调整后勿任意变动； 将蜡块固定于持蜡器上，并调整蜡块与刀至适当位臵； 移动刀座或持蜡器，使蜡块与刀刃接触，旋紧刀座； 以右手匀速旋转机轮，到组织已全部切出，或所需的部分已切出。微小组 织应注意勿修切过多。调节厚薄器到4～6um，继续切片，除特殊要求者， 一般勿切过厚； 以小镊取完整无划痕、厚薄均匀的切片，将其放入温水中，使展平无折， 每一蜡块多切数个切面，选择较好的切片裱于载玻片上。需要多个不同水 平切面时，应多选切片。水浴温度以低于蜡熔点10~12℃上下为宜； 裱片时使切片玻片之间无气泡，切片的位臵应端正，裱成后随即在玻片上 写上号码； 将切片放在烘片板或温箱中烘干； 有特殊要求者应按要求切片。
病理学研究中常用的分子生物学基本技术及其应用 ppt课件
ppt课件 36
• 2. 液相杂交 （solution hybridization ）
• • • • • • • • • 所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中 (1)吸附杂交方法 HAP（羟基磷灰石）吸附杂交方法(DNA:DNA) 亲和吸附杂交方法 (DNA:RNA) 生物素标记DNA探针 酰化亲和素包被固相支持物 用特异性抗DNA-RNA杂交物的酶标单克隆抗 体与固相支持物上的杂交物反应 酶显色
基因扩增或在转录水平上研究基因表达
ppt课件
24
• 原位杂交的探针 单链DNA • 双链DNA • RNA 探针
• 基本方法 (RNA 杂交为例) • A.杂交前准备
• 固定 尽快予以冷冻/固定 • 培养细胞、新鲜组织、石蜡包埋组织均可进行原位杂交 • 通常石蜡包埋信号低于冰冻切片
ppt课件
25
• 玻片处理 • 增强组织通透性和探针穿透性 • 稀释的酸去垢剂（detergent）或清洗剂Triton X 100 • 某些消化酶 • 应掌握其用量及孵育时间
ppt课件 34
ppt课件
35
• 应用
• • • • 临床应用 应用非常广泛 研究应用 肿瘤中染色体异常 基因图谱绘制 确定基因在染色体上的顺序
• (6)其它杂交方法 • A. 差异杂交（differential hybridization ）
• B. cDNA 微 点 阵 杂 交 （ cDNA microarray hybridization ） • C. 寡核苷酸微点阵杂交 （oligonucleotide microarray hybridization ） •
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•
• 同一物质在不同时期的形态变化 •
• (4) 蛋白质
• 2. 液相杂交 （solution hybridization ）
• • • • • • • • • 所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中 (1)吸附杂交方法 HAP（羟基磷灰石）吸附杂交方法(DNA:DNA) 亲和吸附杂交方法 (DNA:RNA) 生物素标记DNA探针 酰化亲和素包被固相支持物 用特异性抗DNA-RNA杂交物的酶标单克隆抗 体与固相支持物上的杂交物反应 酶显色
基因扩增或在转录水平上研究基因表达
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• 原位杂交的探针 单链DNA • 双链DNA • RNA 探针
• 基本方法 (RNA 杂交为例) • A.杂交前准备
• 固定 尽快予以冷冻/固定 • 培养细胞、新鲜组织、石蜡包埋组织均可进行原位杂交 • 通常石蜡包埋信号低于冰冻切片
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• 玻片处理 • 增强组织通透性和探针穿透性 • 稀释的酸去垢剂（detergent）或清洗剂Triton X 100 • 某些消化酶 • 应掌握其用量及孵育时间
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• 应用
• • • • 临床应用 应用非常广泛 研究应用 肿瘤中染色体异常 基因图谱绘制 确定基因在染色体上的顺序
• (6)其它杂交方法 • A. 差异杂交（differential hybridization ）
• B. cDNA 微 点 阵 杂 交 （ cDNA microarray hybridization ） • C. 寡核苷酸微点阵杂交 （oligonucleotide microarray hybridization ） •
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•
• 同一物质在不同时期的形态变化 •
• (4) 蛋白质
分子病理学常用研究技术原理及应用108页PPT
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
ห้องสมุดไป่ตู้
分子病理学常用研究技术原理及应用
61、辍学如磨刀之石，不见其损，日 有所亏 。 62、奇文共欣赞，疑义相与析。
63、暧暧远人村，依依墟里烟，狗吠 深巷中 ，鸡鸣 桑树颠 。 64、一生复能几，倏如流电惊。 65、少无适俗韵，性本爱丘山。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
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分子病理学常用研究技术原理及应用
61、辍学如磨刀之石，不见其损，日 有所亏 。 62、奇文共欣赞，疑义相与析。
63、暧暧远人村，依依墟里烟，狗吠 深巷中 ，鸡鸣 桑树颠 。 64、一生复能几，倏如流电惊。 65、少无适俗韵，性本爱丘山。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
《分子病理学》PPT课件
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Molecular regulation mechanism of autophagy
PI3K-Akt-mTOR LKB1-AMPK-mTOR Beclin1-Bcl-2 p53 Other mechanisms
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Identification of Atg genes and their functions.
Percentage
≈1%
≈ 99%
Half-life Discovery Nobel Prize
< 5 hours 1980 2004
>5 hours 1962 ?
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3
E1(泛素活化酶)
E2(泛素结合酶)
E3(泛素-蛋白连接酶)
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4
比利时科学家德·迪夫
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5
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16
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17
细胞自噬的类型
巨型自噬
(macroautophagy) 微型自噬
(microautophagy) 分子伴侣介导的自噬
(chaperon-mediated autophagy)
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18
细胞自噬的类型
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细胞自噬的机制 The machinery of autophagy
6
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7
衰老的线粒体
衰老的过氧化物酶体
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8
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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Function of autophagy
A. Housekeeping mechanism involved in cytoplasmic homeostasis
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分子病理学常用研究方法 原理及选择
实验方法在科研工作中的意义
决定本项研究的意义与水平：
①高水平假说+高精尖手段→高水平的研究 ②高水平假说+一般手段→高水平的研究 ③低水平假说+高精尖手段→一般水平的研究 ④低水平假说+一般手段→低水平的研究
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立题的先进性 手段的先进性
在慢性炎症、机化和瘢痕形成等病变中显示胶原纤维，如慢 性肾小球ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ炎的肾小球纤维化、大叶性肺炎、血栓机化、风 湿性肉芽肿时Aschoff’s巨细胞消失、胃、十二指肠溃疡愈合、 慢性阑尾炎、肝硬化。
好
好
缺点
细胞分布不均匀，细胞分布不均 细胞分布不均 适用细胞种类较
易重叠，影响标 匀
匀，易重叠， 少
记效果
影响标记效果
组织固定
定义：将组织浸入适当化学试剂，使细胞内 物质尽量接近其生理状态时的形态结 构和位置的过程
意义： 防止自溶 防止腐败 最大限度保存细胞和组织的抗原性 保留特殊成分：糖原、核酸、色素等
科研人员可同时研究几百甚至上千种不同阶段病理生理状态下的 组织样本的某一个或多个特定基因或相关表达产物
Tissue Microarray
组织病理制片技术
显微切割：microdissection
选取同质性研究材料，是在对组织的深入研究中 常常遇到却又不易解决的问题
该技术是在显微状态下或显微直视下通过显微操作系统对选 择的材料（组织、细胞、细胞群、细胞内组分或染色体带等） 进行切割分离并收集用于后续研究的技术
显微切割技术的特点
细微：微米、纳米级切割 原位：所取材料定位清楚 同质：所取材料在一定层次上相同 结合：与其他实验技术结合
显微切割本身不能对样品 进行研究，必须同其他实 验技术结合，其切割目标 完全取决于研究目的
显微切割的方式
手动直接显微切割 机械辅助显微切割 液压控制显微切割 激光捕获显微切割（laser capture microdessection, LCM）
医学实验技术原理及选择
常用医学实验动物模型的种类及选择 组织学实验技术 细胞生物学实验技术 分子生物学实验技术 蛋白质化学技术 免疫学实验技术 医学微生物学实验技术
分子病理学常用实验方法
• 组织标本取材与固定 • 病理制片 • 切片 • 染色：常规/特殊 • 原位蛋白质检测 • 原位核酸检测
组织标本一般处理流程
科研水平先进性
工欲善其事必先利其器
选择实验方法的基本原则
必要性
为什么要选择这个方法 替代方法
可行性
实验室条件 经费 时间
基于硬件条件，选择最具有说服力的方法
1．为没有工作经验的医学研究生编写 一本适合自学的手册式教材，为他们 做课题时更快、更好地选择合适的实 验技术提供决策参考。 2．重点介绍同类实验技术的发展沿革、 优劣比较；不同实验技术的特点、用 途、相互关系、发展趋势；各类实验 技术的关键、操作要点和选择示范。 3．重点强调医学实验技术的原理与选 择，而非具体操作，亦非理论知识。
适用于多肽类激素的组织固定
非醛类固定剂 常需与戊二醛或多聚甲醛混合适用降低边缘效应
丙酮及醇类固定剂
穿透性很强，保存抗原活性较好 常用于冰冻切片及细胞涂片固定
组织病理制片技术 常规组织病理制片
脱水，透明，浸蜡，包埋，切片
组织病理制片技术
组织芯片
近年来基因芯片（DNA芯片）技术的发展和延伸，与细胞芯片、蛋 白芯片、抗体芯片一样，属于特殊生物芯片技术 组织芯片技术可将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预 先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样 本的分析工具
组织取材
固定
不固定
包埋 冻存（不提倡）
冻存
冰冻切片
HE染色 特殊染色
IHC ISH 电镜
蛋白质、核酸提取 固定
不固定
分子生物学实验 -20℃保存 IF/IHC/ISH
细胞标本一般处理流程
活细胞
细胞爬片
细胞离心涂片 细胞培养
固定
形态学 IHC ISH
离心后包埋制片
冻存 Protein/DNA/RNA 分子生物学
结缔组织染色 胶原纤维染色
分布最广、含量最多的一种纤维
Van Gieson氏苦味酸—酸性 品红染色法（简称V.G法） Masson氏三色染色法 Mallory氏三色染色法 Pollak氏三色染色法 Sirius Red苦味酸法等
胶原纤维染色的应用
在病理诊断上主要用于和肌纤维相鉴别
来源于间胚叶的肿瘤如纤维瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、神经 纤维瘤及其肉瘤等的诊断和鉴别诊断。
组织固定的方法
蒸汽固定法 某些薄膜组织及血液或细胞涂片中的可溶物质
浸入法
手术取材组织标本和细胞涂片
灌注法
仅适用于动物实验
微波固定法
常用固定剂
醛类固定剂
双功能交联剂，可使组织间相互交联，原位保存抗原 对组织穿透力强，收缩性小 是最常用固定剂
10%中性福尔马林液 4%多聚甲醛缓冲液 2.5%戊二醛（电镜）
全自动组织处理机
石蜡包埋机
石蜡切片机 硬组织切片机
震荡切片机 冰冻切片机
冰冻切片机
常用组织切片染色方法
未经染色的组织切片各部分折射率差别很小，即使有足够的分 辨率和合适的放大倍数，也无法直接在光镜下观察。 通过适当的染色，增大各部分结构折射率差别，提高分辨率
苏木精－伊红染色（HE）
DNA带负电荷，呈酸性，与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键形式结合，呈蓝色 伊红Y为一种合成酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与嗜酸性物质结合呈红色
HE染色能非常鲜明地对组织和细胞 染色，是最基本、使用最广泛的技 术方法，又被称为常规染色。
特殊染色
显示HE染色不明显的目的物，如Gridley染色能 突出显示感染的霉菌
区别常规HE染色不能鉴别的病变，如V.G染色可 区分胶原纤维和平滑肌
显示某些常规HE染色中不能看到的目的物，如 网状纤维、星形细胞的突起和结核杆菌等
细胞悬液
IF、FCM
细胞取材方法适用范围及优缺点比较
印片法
穿刺法
沉淀法 细胞爬片法
适用范围 活检组织标本、 实质器官的病
手术切除标本的 变区细胞取材 细胞取材
体液多细胞少 的标本
有贴壁生长特性 的细胞，如纤维 母细胞、粘液癌 细胞
优 点 简便省时，细胞 操作简便，细 操作简便，细 操作简便，保持
抗原保存较好 胞形态保持较 胞形态保持较 细胞形态及活性
实验方法在科研工作中的意义
决定本项研究的意义与水平：
①高水平假说+高精尖手段→高水平的研究 ②高水平假说+一般手段→高水平的研究 ③低水平假说+高精尖手段→一般水平的研究 ④低水平假说+一般手段→低水平的研究
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立题的先进性 手段的先进性
在慢性炎症、机化和瘢痕形成等病变中显示胶原纤维，如慢 性肾小球ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ炎的肾小球纤维化、大叶性肺炎、血栓机化、风 湿性肉芽肿时Aschoff’s巨细胞消失、胃、十二指肠溃疡愈合、 慢性阑尾炎、肝硬化。
好
好
缺点
细胞分布不均匀，细胞分布不均 细胞分布不均 适用细胞种类较
易重叠，影响标 匀
匀，易重叠， 少
记效果
影响标记效果
组织固定
定义：将组织浸入适当化学试剂，使细胞内 物质尽量接近其生理状态时的形态结 构和位置的过程
意义： 防止自溶 防止腐败 最大限度保存细胞和组织的抗原性 保留特殊成分：糖原、核酸、色素等
科研人员可同时研究几百甚至上千种不同阶段病理生理状态下的 组织样本的某一个或多个特定基因或相关表达产物
Tissue Microarray
组织病理制片技术
显微切割：microdissection
选取同质性研究材料，是在对组织的深入研究中 常常遇到却又不易解决的问题
该技术是在显微状态下或显微直视下通过显微操作系统对选 择的材料（组织、细胞、细胞群、细胞内组分或染色体带等） 进行切割分离并收集用于后续研究的技术
显微切割技术的特点
细微：微米、纳米级切割 原位：所取材料定位清楚 同质：所取材料在一定层次上相同 结合：与其他实验技术结合
显微切割本身不能对样品 进行研究，必须同其他实 验技术结合，其切割目标 完全取决于研究目的
显微切割的方式
手动直接显微切割 机械辅助显微切割 液压控制显微切割 激光捕获显微切割（laser capture microdessection, LCM）
医学实验技术原理及选择
常用医学实验动物模型的种类及选择 组织学实验技术 细胞生物学实验技术 分子生物学实验技术 蛋白质化学技术 免疫学实验技术 医学微生物学实验技术
分子病理学常用实验方法
• 组织标本取材与固定 • 病理制片 • 切片 • 染色：常规/特殊 • 原位蛋白质检测 • 原位核酸检测
组织标本一般处理流程
科研水平先进性
工欲善其事必先利其器
选择实验方法的基本原则
必要性
为什么要选择这个方法 替代方法
可行性
实验室条件 经费 时间
基于硬件条件，选择最具有说服力的方法
1．为没有工作经验的医学研究生编写 一本适合自学的手册式教材，为他们 做课题时更快、更好地选择合适的实 验技术提供决策参考。 2．重点介绍同类实验技术的发展沿革、 优劣比较；不同实验技术的特点、用 途、相互关系、发展趋势；各类实验 技术的关键、操作要点和选择示范。 3．重点强调医学实验技术的原理与选 择，而非具体操作，亦非理论知识。
适用于多肽类激素的组织固定
非醛类固定剂 常需与戊二醛或多聚甲醛混合适用降低边缘效应
丙酮及醇类固定剂
穿透性很强，保存抗原活性较好 常用于冰冻切片及细胞涂片固定
组织病理制片技术 常规组织病理制片
脱水，透明，浸蜡，包埋，切片
组织病理制片技术
组织芯片
近年来基因芯片（DNA芯片）技术的发展和延伸，与细胞芯片、蛋 白芯片、抗体芯片一样，属于特殊生物芯片技术 组织芯片技术可将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预 先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样 本的分析工具
组织取材
固定
不固定
包埋 冻存（不提倡）
冻存
冰冻切片
HE染色 特殊染色
IHC ISH 电镜
蛋白质、核酸提取 固定
不固定
分子生物学实验 -20℃保存 IF/IHC/ISH
细胞标本一般处理流程
活细胞
细胞爬片
细胞离心涂片 细胞培养
固定
形态学 IHC ISH
离心后包埋制片
冻存 Protein/DNA/RNA 分子生物学
结缔组织染色 胶原纤维染色
分布最广、含量最多的一种纤维
Van Gieson氏苦味酸—酸性 品红染色法（简称V.G法） Masson氏三色染色法 Mallory氏三色染色法 Pollak氏三色染色法 Sirius Red苦味酸法等
胶原纤维染色的应用
在病理诊断上主要用于和肌纤维相鉴别
来源于间胚叶的肿瘤如纤维瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、神经 纤维瘤及其肉瘤等的诊断和鉴别诊断。
组织固定的方法
蒸汽固定法 某些薄膜组织及血液或细胞涂片中的可溶物质
浸入法
手术取材组织标本和细胞涂片
灌注法
仅适用于动物实验
微波固定法
常用固定剂
醛类固定剂
双功能交联剂，可使组织间相互交联，原位保存抗原 对组织穿透力强，收缩性小 是最常用固定剂
10%中性福尔马林液 4%多聚甲醛缓冲液 2.5%戊二醛（电镜）
全自动组织处理机
石蜡包埋机
石蜡切片机 硬组织切片机
震荡切片机 冰冻切片机
冰冻切片机
常用组织切片染色方法
未经染色的组织切片各部分折射率差别很小，即使有足够的分 辨率和合适的放大倍数，也无法直接在光镜下观察。 通过适当的染色，增大各部分结构折射率差别，提高分辨率
苏木精－伊红染色（HE）
DNA带负电荷，呈酸性，与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键形式结合，呈蓝色 伊红Y为一种合成酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与嗜酸性物质结合呈红色
HE染色能非常鲜明地对组织和细胞 染色，是最基本、使用最广泛的技 术方法，又被称为常规染色。
特殊染色
显示HE染色不明显的目的物，如Gridley染色能 突出显示感染的霉菌
区别常规HE染色不能鉴别的病变，如V.G染色可 区分胶原纤维和平滑肌
显示某些常规HE染色中不能看到的目的物，如 网状纤维、星形细胞的突起和结核杆菌等
细胞悬液
IF、FCM
细胞取材方法适用范围及优缺点比较
印片法
穿刺法
沉淀法 细胞爬片法
适用范围 活检组织标本、 实质器官的病
手术切除标本的 变区细胞取材 细胞取材
体液多细胞少 的标本
有贴壁生长特性 的细胞，如纤维 母细胞、粘液癌 细胞
优 点 简便省时，细胞 操作简便，细 操作简便，细 操作简便，保持
抗原保存较好 胞形态保持较 胞形态保持较 细胞形态及活性