分子病理学常用研究技术原理及应用
分子病理学的研究方法和应用
分子病理学的研究方法和应用随着生物技术的飞速发展，分子病理学作为一门新兴的学科正在迅速发展。
分子病理学是研究疾病的分子基础和分子机制的学科，其研究范围涉及生物分子及其结构、功能、互作、代谢途径和调节机制等方面。
本篇文章将介绍分子病理学的研究方法和应用，以及将来的发展方向。
一、分子病理学的研究方法1. 基因测序基因测序是分子病理学中应用最广泛的技术之一。
它的主要作用是通过对人类基因组的测序，发掘新的基因、理解基因的调节机制以及研究基因与疾病之间的关系。
目前，高通量测序技术的发展，使得基因测序的速度和效率得到了极大的提高。
2. 蛋白质分析蛋白质分析是研究分子病理学的重要手段。
通过分离、纯化和鉴定蛋白质，可以揭示蛋白质在细胞及生物体内的结构、功能、互作和调节机制，从而深入研究蛋白质和疾病之间的关系。
近年来，质谱技术的发展为蛋白质分析提供了有效的手段，使得许多复杂性蛋白质研究成为可能。
3. 分子诊断技术分子诊断技术是分子病理学的另一重要研究方向。
它主要利用目标DNA或RNA序列的差异性，通过采用PCR、核酸芯片等技术，检测病原体、发现基因突变、筛查遗传病等内容。
这种技术具有灵敏度高、特异性强、检测速度快的优势，因此在临床诊断、治疗和预防中有着广泛的应用前景。
二、分子病理学的应用1. 癌症治疗分子病理学在癌症治疗中扮演着重要的角色。
通过研究癌细胞的分子机制，发掘新型的抗肿瘤药物、筛选特异性蛋白质作为治疗靶点，以及研究肿瘤细胞的耐药机制等方面，为癌症治疗提供了新的思路和方法。
2. 遗传病诊断分子病理学技术可以快速、准确地检测基因突变、基因缺陷等问题，为遗传病的诊断和早期预防提供了重要的手段。
同时，对于一些遗传病的基因治疗也有了更深入和新的研究方向。
3. 新药研发分子病理学在药物研发中也担任着重要角色。
通过对药物分子机制的研究，开发新型药物、提高药物疗效以及降低药物副作用等方面都有着重大的意义。
三、分子病理学的未来展望分子病理学在不断的发展之中，未来还将继续发挥着作为一个崭新、重要的分支学科的作用。
分子生物学技术在病理学研究中的应用
分子生物学技术在病理学研究中的应用随着科技的不断发展和进步，分子生物学技术在病理学研究中的应用也越来越广泛。
分子生物学技术是一种基于生物分子的研究法，采取了一系列分子生物学实验技术，可以更加准确、快速地对生物体的分子结构进行探究，为疾病的研究提供了良好的平台。
分子生物学技术主要包括单核苷酸多态性（SNP）、DNA芯片等，这些技术能够寻找和定位全基因组的变异，从而可以研究疾病的发生和发展机制，为相关疾病的诊断和治疗提供理论依据。
其中，DNA芯片技术又叫“基因芯片技术”，是目前最为先进和常用的分子生物学技术之一。
DNA芯片技术可以高度并行地对数千到数百万个基因进行检测，得到大量有关基因功能和基因调控的信息。
这种技术具有高通量、高灵敏度、高效率、高特异性、高可重复性等特点，能同时间内同时分析大量基因的表达情况和变异信息，对诊断和治疗疾病都有巨大的潜力和作用。
分子生物学技术在病理学研究中的应用：1、基因诊断分子生物学技术能够牢固地揭示疾病基因的异变。
通过对特定基因采用PCR 等技术进行检测，不仅可以追踪疾病的发生机制，也可为相关疾病的诊断、预测和基因治疗提供依据。
如癌症的早期诊断，通过采用PCR技术检测体内特定基因的突变与否来帮助做出更准确的诊断。
2、基因治疗分子生物学技术可以揭示疾病的基本遗传模式和基因结构模式，从而为基因治疗提供理论支持。
利用分子生物学技术，可以进行基因转移、基因缺陷纠正等技术操作，帮助减轻或消除某些疾病的发生和发展。
例如，在治疗基于基因的疾病时，以普利司他（Prilenap）为例。
普利司他是一种抗高血压药，它主要修复ACE2基因的缺陷，从而降低人体内一些激素的分泌，通过分子生物学技术的协助，这种治疗方式可以更为高效地实施。
3、疾病筛查分子生物学技术可为一些常见疾病的筛查和诊断提供依据。
例如，直接通过利用PCR技术检测人体内cancer基因是否存在，从而可以确定个体患上癌症的风险，为提前预防及早治疗提供理论支持。
分子病理学的研究方法和应用
分子病理学的研究方法和应用分子病理学是一门研究疾病发生、发展和诊断的科学，它通过研究生物分子的结构、功能、变异和表达等方面的信息，揭示疾病的分子机制，为疾病的预防、治疗和个体化医学提供重要的依据。
分子病理学的研究方法和应用主要包括分子生物学技术和生物信息学分析方法。
分子病理学的研究方法主要是利用各种分子生物学技术来研究疾病相关的分子特征。
其中，最常用的技术包括PCR（聚合酶链式反应）、蛋白质免疫印记法、Western blot、流式细胞术、细胞培养和基因组学等。
这些技术可以用来检测和测定疾病相关的基因表达水平、蛋白质表达水平、DNA和RNA的变异以及细胞增殖和凋亡等过程。
PCR是一种重要的技术，它可以放大微量的DNA分子片段，从而方便对基因突变、基因扩增、基因重组等研究。
PCR技术在肿瘤学、遗传学和传染病学等领域有广泛的应用。
蛋白质免疫印记法则可以通过特异抗体与目标蛋白质结合，从而实现对蛋白质的检测和定量。
Western blot则是一种常用的蛋白质免疫印记法，可以用于分析特定蛋白质在疾病中的表达变化。
流式细胞术可以对细胞进行表型、功能和生物学特征的分析，被广泛应用于肿瘤和免疫学研究。
细胞培养技术则可以用来研究细胞增殖、细胞信号传导和细胞毒性等方面的问题。
而基因组学则是研究基因组中的DNA序列、基因调控和基因功能等方面的科学，包括全基因组测序和基因芯片技术等。
在生物信息学的分析方法方面，主要包括基因组学数据分析、蛋白质组学数据分析和代谢组学数据分析等。
基因组学数据分析可以从基因组水平揭示基因表达、功能和调控等方面的信息，包括基因定位、基因组结构、基因组变异和基因共表达等。
蛋白质组学数据分析则可以通过大规模测定和分析蛋白质在疾病中的表达、修饰和互作等信息，从而揭示疾病的分子机制和靶点。
代谢组学数据分析则是研究代谢产物在生物体内的变化规律，可以用于研究代谢通路、代谢物标志物和代谢物调控等问题。
这些生物信息学分析方法可以帮助研究人员从大量的数据中挖掘并解读疾病的潜在机制，为疾病的预防、诊断和治疗提供科学依据。
分子病理学常用研究技术原理及应用
分子病理学常用研究技术原理及应用1.PCR（聚合酶链式反应）PCR是一种能够扩增特定DNA片段的技术。
它通过逐渐进行一系列的温度循环，使得DNA的两条链解离，然后由DNA聚合酶在每个DNA模板单链上合成新的DNA链。
PCR可以扩增微弱的DNA片段并获得足够数量的DNA进行研究。
PCR广泛应用于基因突变检测、DNA定量分析、基因克隆等领域。
2.实时定量PCR（qPCR）qPCR是PCR的一种改进技术，它能够在PCR过程中实时监测反应过程中的DNA扩增情况。
qPCR结合了PCR和荧光探针等技术，可以定量地检测目标DNA的起始浓度。
qPCR广泛应用于检测微生物感染、基因表达分析、疾病诊断等领域。
3. 西方印迹（Western blot）Western blot是一种用于检测特定蛋白质的技术。
它通过将样品中的蛋白质分离并转移到膜上，然后用特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过探针或底物检测蛋白质的存在。
Western blot可以定量地检测目标蛋白的表达、翻译后修饰等信息，广泛应用于疾病诊断、蛋白质功能研究等领域。
4. 免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）IHC是一种用于检测组织切片中特定蛋白质表达的技术。
它通过将组织切片上的蛋白质与特异性抗体结合，然后使用可视化方法如染色来显示特定抗原的位置。
IHC可以从组织水平上了解蛋白质在细胞和组织中的表达模式，广泛应用于肿瘤诊断、免疫学研究等领域。
5.DNA测序DNA测序是一种确定DNA序列的技术。
通过测序技术可以了解DNA序列上包含的信息，如基因突变、SNP等。
DNA测序广泛应用于基因组学研究、个体遗传学研究、品种鉴定等领域。
6.RNA测序RNA测序是一种确定转录组的技术。
通过测序技术可以了解细胞中mRNA的表达模式，以及基因的剪接变异、转录水平调控等信息。
RNA测序广泛应用于转录组学研究、基因功能研究等领域。
7.基因表达芯片基因表达芯片是一种通过检测大量基因在特定条件下的表达来了解基因调控网络的技术。
病理学的基本原理及诊断应用
病理学的基本原理及诊断应用病理学是现代医学中一门重要的学科，它主要研究人体各种疾病的发生、发展、变化、死亡等方面的规律和规律。
病理学不仅对人类的健康和生命有着至关重要的作用，同时也为临床医学提供了重要的诊断和治疗依据。
本文将对病理学的基本原理及其在临床诊断中的应用进行介绍。
1. 基本原理病理学研究的基本原理主要包括病变及其基本类型、病变的发生机制、病变的遗传基础等。
1.1 病变及其基本类型病变是指正常组织或器官的结构和功能受到损伤或改变，表现为各种不同的病态现象。
根据病变的性质和形态，可以将病变分为以下几种类型：（1）变性：细胞或组织在代谢和功能异常时发生的可逆性变化。
（2）坏死：细胞或组织在不受细胞外界影响下的死亡。
（3）炎症：由于机体对异物的反应导致的细胞和组织的反应。
（4）增生：由于机体对外界因素的反应导致的组织增生。
（5）肿瘤：细胞通过异常增生和分化而形成的具有恶性生长趋势的结构。
1.2 病变的发生机制病变的发生机制主要包括两个方面，一是病变的前因后果关系，即何种原因导致何种病变；二是病变机理的分子性及细胞行为的改变。
（1）前因后果关系：通常情况下，病变的发生和相关因素是密切相关的，如遗传、生活习惯、外界环境等。
早期病变多半是归因于遗传和环境因素，成年后则与生活习惯和外界环境密切相关。
（2）病变机理：病变机理的分子性及细胞行为的改变是人类疾病发生演变历程中最为重要的阶段。
在这个阶段，病原因素进入机体后与机体细胞发生反应并分化出各种生物分子，引起病变的发生。
1.3 病变的遗传基础病变的遗传基础是病理学的重要研究方向之一。
人类存在大量的基因变异，有些基因变异可能导致疾病的发生和演变。
同时，在遗传基因和环境因素的相互作用下，一些疾病如癌症、糖尿病等也会出现。
2. 诊断应用病理学在临床医学中起到了至关重要的作用。
医生通过病变的形态学特征、病理生理功能的改变和生化学性质等方面的改变进行病理诊断。
其中，包括元化、组织学、细胞学和免疫学等各种检测手段。
病理检验技术的原理及应用
病理检验技术的原理及应用1. 病理检验技术的定义病理检验技术是一种通过对人体病理组织样本进行显微镜下的观察和实验室检测，来诊断疾病和评估疾病进展的技术。
它主要包括组织学、免疫组化、分子病理学等多种技术手段。
2. 组织学技术的原理和应用2.1 组织学技术的原理•组织固定：将病理组织样本用甲醛或其他固定剂进行处理，使细胞和组织结构得以保存。
•组织包埋：将固定的组织样本用蜡进行包埋处理，使其易于切片。
•组织切片：用石蜡包埋的组织样本用切片机进行切割，得到薄片。
•组织染色：通过染色剂对组织切片进行染色，以便观察和诊断。
2.2 组织学技术的应用•病理诊断：通过观察组织切片的形态、结构和染色情况，可以对疾病进行诊断。
•疾病进展评估：通过观察组织切片的变化，可以评估疾病的进展和治疗效果。
•疾病研究：通过观察组织切片的细胞和组织结构，可以研究疾病的发生机制和病理变化。
3. 免疫组化技术的原理和应用3.1 免疫组化技术的原理•抗原获取：将组织样本中的抗原通过特定的方法提取出来。
•抗原检测：将提取出来的抗原通过特异性抗体进行检测，形成抗原抗体复合物。
•抗原可视化：通过特定的染色剂或荧光标记将抗原抗体复合物可视化。
3.2 免疫组化技术的应用•分子病理学研究：通过检测特定的抗原，可以研究疾病的分子机制和相关的信号通路。
•癌症诊断：免疫组化技术可以检测肿瘤标志物，帮助早期诊断和治疗肿瘤。
•免疫疫苗研制：通过免疫组化技术可以研究病原微生物和宿主之间的免疫反应，从而研制疫苗。
4. 分子病理学技术的原理和应用4.1 分子病理学技术的原理•DNA提取：通过特定方法，从组织样本中提取出DNA。
•PCR扩增：利用聚合酶链式反应（PCR）技术，将DNA扩增至足够数量。
•DNA测序：通过测序方法，确定DNA的序列。
4.2 分子病理学技术的应用•基因诊断：通过检测特定基因的突变，可以诊断遗传性疾病，如遗传性肿瘤。
•药物治疗选择：通过检测特定基因的突变，可以评估患者对某些药物的敏感性和耐药性。
分子病理学诊断技术在肿瘤学中的应用
分子病理学诊断技术在肿瘤学中的应用肿瘤学是研究肿瘤发生、发展、转移及治疗的学科。
肿瘤的发生是由于基因突变、多种环境因素和生活方式等因素综合作用的结果。
分子病理学诊断技术作为一种快速、灵敏、准确的新技术，不仅可以对基因突变的检测、肿瘤细胞的分子特征和表达谱进行研究，还可以对肿瘤的预后和治疗反应进行评估。
本文将从分子病理学诊断技术的概念、技术方法、应用及发展前景等方面详细介绍其在肿瘤学中的应用。
一、分子病理学诊断技术的概念分子病理学诊断技术是指通过对肿瘤组织或体液中的一些分子标志物进行检测，以辅助肿瘤诊断和治疗的技术。
分子标志物包括基因、蛋白质、酶、免疫学指标和肿瘤相关遗传学变异等。
这些分子标志物的表达谱可以显示肿瘤细胞的状态及其分化水平，同时也可以显示肿瘤细胞的分子特征和病理类型，从而提高对肿瘤的鉴别诊断和早期诊断准确率。
分子病理学诊断技术还可以对肿瘤分子靶点进行评估，提供个性化治疗的方案。
二、分子病理学诊断技术的技术方法分子病理学诊断技术的技术方法主要包括基因检测、蛋白质检测、免疫组化和肿瘤标志物检测等。
基因检测是指通过对肿瘤组织和体液中的基因序列进行检测，对肿瘤分子遗传学变异进行评估，并为后续的个性化治疗提供依据。
目前常用的基因检测技术包括荧光原位杂交（FISH）、多聚酶链式反应（PCR）和基因芯片等。
蛋白质检测是指通过对肿瘤组织中的蛋白质进行检测，以评估其表达及功能状态。
蛋白质检测技术包括质谱法、二维凝胶电泳和蛋白质芯片等。
免疫组化是指通过利用抗体与免疫性分子标志物相互作用的特异性来检测组织或细胞中特定的分子标志物。
免疫组化技术可以对肿瘤细胞的表面标志物和内部标志物进行研究，是肿瘤分子诊断中最常用的方法之一。
肿瘤标志物检测是指通过检测肿瘤组织或体液中的特异性分子标志物，评估肿瘤细胞的状态和肿瘤治疗反应。
如前列腺特异性抗原（PSA）用于前列腺癌的诊断和治疗监测；癌胚抗原（CEA）用于结直肠癌和胃癌的诊断和治疗监测等。
分子病理学
分子病理学分子病理学是一门研究疾病发生发展与分子机制，利用基因组学、蛋白质组学等分子生物学技术以及其他化学和生物学手段来诊断、预测和治疗疾病的现代研究领域。
分子病理学对于疾病的诊断和治疗具有非常重要的意义。
本文将通过介绍分子病理学的发展历程、疾病诊断与预测以及分子病理学在精准医疗中的应用等方面，来进一步探讨分子病理学的研究进展和未来发展趋势。
一、分子病理学发展历程分子病理学最初是在20世纪70年代开始形成的，当时，人们已经开始利用基因工程技术来研究疾病的发病机制。
1980年代，随着PCR技术的发展和引入，分子病理学的研究范围迅速扩大，从单个基因和获得全基因组序列开始。
1990年代以来，随着各种高通量技术的不断发展，人类基因组计划的开展和完成，分子病理学学科的研究内容也越来越广泛和深入。
目前，分子病理学已经形成了一套完整的理论和方法体系，成为临床诊断和治疗的重要手段。
二、分子病理学在疾病诊断与预测中应用1. 基因诊断基因诊断是指通过基因筛查技术来确定患者所患疾病的类型和表现形式。
在分子病理学中，基因诊断是一项非常重要的诊断手段，在许多疾病的诊断和预测中都有广泛的应用。
目前，许多遗传性疾病如血友病、先天性肥胖、囊性纤维化等已经可以通过基因诊断技术来进行检测和诊断。
2. 肿瘤诊断肿瘤诊断是指通过检测肿瘤组织中的某些分子标志物，来确定肿瘤类型和分级。
分子病理学在肿瘤诊断中具有不可替代的作用，它可以通过检测肿瘤相关基因的异常表达、蛋白质的结构和功能等信息，来确定肿瘤的性质和分子机制，为合理治疗提供参考指导。
3. 疾病预测分子病理学技术可以利用生物标志物对疾病的风险进行预测，这对于早期诊断和治疗非常重要。
例如，对于心血管疾病的预测，可以通过检测某些血液生物标志物，进行实时监测和风险评估，从而减少疾病的发生和发展。
三、分子病理学在精准医疗中的应用精准医疗是一种基于分子诊断技术的高度个性化的治疗方法，它可以根据患者的个体差异，采用不同的治疗方案，提高治疗效果。
分子病理学常用研究技巧道理及应用
好
好
缺点
细胞分布不均匀，细胞分布不均 细胞分布不均 适用细胞种类较
易重叠，影响标 匀
匀，易重叠， 少
记效果
影响标记效果
组织固定
定义：将组织浸入适当化学试剂，使细胞内 物质尽量接近其生理状态时的形态结 构和位置的过程
意义： 防止自溶 防止腐败 最大限度保存细胞和组织的抗原性 保留特殊成分：糖原、核酸、色素等
网状纤维染色的应用
常用于区别癌和肉瘤：癌巢周围常有网状纤维包裹； 用于基底膜染色，鉴别原位癌或原位癌早期浸润。
鉴别血管内皮瘤和外皮瘤：血管内皮瘤瘤细胞呈泡巢 状，周围被网状纤维包绕；血管外皮瘤瘤细胞间可见 较多网状纤维。
区别脑肿瘤：脑原发性肉瘤周围有较多网状纤维、脑 血管周围肉瘤组织内有较多网状纤维，其它脑肿瘤少 见网状纤维
分子病理学常用研究方法 原理及选择
实验方法在科研工作中的意义
决定本项研究的意义与水平：
①高水平假说+高精尖手段→高水平的研究 ②高水平假说+一般手段→高水平的研究 ③低水平假说+高精尖手段→一般水平的研究 ④低水平假说+一般手段→低水平的研究
From Prof. XW Bian
立题的先进性 手段的先进性
结缔组织染色
网状纤维染色
是网状结缔组织内的一种纤维，纤细而有分支，直径约0.2~1mm，无弹 性，穿行于细胞体之间，共同构成网状支架。HE染色不易辩识，用银氨 溶液浸染能使纤维变成黑色，故称嗜银纤维
主要分布在淋巴组织、骨髓、扁桃体、胸腺、基底膜、 血管（特别是毛细血管）、脾窦、肝窦、肌纤维周围、 神经纤维、脂肪细胞周围及肺泡等
磷脂染色
由甘油、脂肪酸、磷酸和含氮的碱基组成，是细胞膜和细胞内膜性 结构的主要组成成分，在大脑、神经组织、骨髓和肝脏等含量较多
分子病理技术
直接法免疫荧光原理示意图
间接法免疫荧光原理示意图
4. 免疫酶组织化学
60年代初，HRP-抗体分子上，开创了酶标记抗体 的新技术，现已广泛应用。目前应用最广泛的酶是 HRP， 其次是AP。 （1） PAP法Ag→Ab1→Ab2→PAP→DAB 其灵敏度是免疫荧光法的100-1000倍 （2） ABC法: Ag→ Ab1→ Bio-Ab2→ABC→DAB （3) APAAP法: Ag→Ab1→Ab2→APAAP→FR （4） LSAB或SP法: Ag→Ab1→Bio-Ab2→HRP-SA DAB （AP-SA）→ （FR /NBT）
四、免疫组化染色的一般注意事项 1. 内源酶的灭活及内源生物素的处理 HRP—3％的H2O2水溶液 含丰富血细胞的标本中，与H2O2产生 强烈的反应，出现冒泡而破坏组织结构和 细胞形态。 可以用3％的H2O2甲醇液
一、概论 生物高新技术——病理学中的应用 向二方面发展：
计算机和图像分析技术的应用
简单的形态描述——量化方面发展 直接观察——远程远输“间接”观察 定量病理学和远程病理学 原位杂交、原位PCR和原位末端标记技术
分子病理学水平
近些年来，尤其是纳米技术的诞生
使人们对疾病的认识达原子水平
分子病理学 从分子水平研究患病机体生命现象的科学 从分子水平研究疾病的发生、发展与转归机 制的科学 分子生物学 细胞生物学 经典病理学
2. 染色步骤 （1）石蜡切片脱蜡至蒸馏水； （2）消化暴露抗原： （3）去除内源性酶 （4）滴加适当稀释的一抗； （5）滴加适当稀释的生物素化的二抗； （6）滴加ABC复合物等三抗； （7）滴加底物显色； （8）苏木素复染核，脱水透明封片。 以上(1)-(5)之间均用缓冲液洗。
3. 结果判定 HRP-DAB: 阳性呈棕黄或棕黑色
分子病理学新技术及应用
分子病理学新技术及应用随着科技的不断发展，分子病理学新技术也在不断涌现，为医学诊疗带来了不可估量的好处。
本文将介绍一些目前较为常见的分子病理学新技术，及其在医疗领域的应用。
一、基因测序技术基因测序技术是分子病理学中的一项重要技术，其原理是通过测定DNA序列，分析基因突变和表达，从而了解患者疾病的原因和发展过程。
基因测序技术目前已经广泛运用于癌症诊断和治疗中。
通过测定癌细胞中基因突变的情况，可以选择针对性治疗，并提高治愈率。
此外，基因测序技术也被应用于遗传疾病的筛查，以及对药物反应的预测等方面。
二、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是指将大量蛋白质在芯片上固定，用来检测样本中蛋白质的含量和变化。
利用蛋白质芯片技术可以快速准确地检测出患者血液中的生理参数，如血糖浓度、血脂浓度、肝功能等指标。
蛋白质芯片技术在癌症患者的治疗中也有着广泛的运用。
通过检测肿瘤标志物，可以及早发现肿瘤，并对治疗方案进行优化。
此外，蛋白质芯片技术还可以用于新药的筛选和药效评估。
三、CRISPR/Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas9技术是一种高效、准确的基因编辑技术，可以精确地对基因组进行编辑、插入或删除。
CRISPR/Cas9技术的应用领域很广，特别是在遗传疾病和肿瘤治疗上具有巨大的潜力。
CRISPR/Cas9技术可以被用于修复患有遗传缺陷的基因，如囊性纤维化等疾病。
此外，该技术还可以帮助医生发现和攻克一些肿瘤所特有的基因突变。
四、微生物组学技术微生物组学技术是指通过对体液中微生物的基因组进行分析，了解其种类、含量和作用，从而实现对感染病原体的快速检测和定位。
微生物组学技术已经在临床诊断中得到了广泛应用，成为感染病学研究的一项重要技术。
微生物组学技术可以快速地对急性感染疾病做出诊断，如细菌性脑膜炎、败血症等。
此外，微生物组学技术还可以协助医生制定针对性的抗生素治疗方案，提高治愈率。
总之，分子病理学新技术的应用已经深入到了临床医学中的各个领域，为医生提供了更为准确和精确的诊断手段，也为患者的康复带来了更大的希望。
病理学研究中常用的分子生物学基本技术与其应用
• 概念
• 固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳
• 酸颗粒、磁珠和微孔板等
• 基本方法： 在此以膜相为例
• (1) DNA 变性：使DNA由双链解链成为单链。
•
是成功的关键
• (2)变性DNA在硝酸纤维素膜上的固定
• (3)预杂交
• (4)杂交
• (5)洗膜
• (6)结果显示
• A.放射性测定 放射自显影法
• 斑点杂交应用于
• DNA斑点杂交
• RNA斑点杂交
• 对于培养细胞，不必提取和纯化RNA，只需简 单处理(0.5%Nonidet P40 低渗缓冲液)
• 完整细胞斑点杂交 NaOH 处理，使DNA
•
暴露
•
可用于筛选大量标本，但它不适用于
非放射性 标记探针 (DNA纯度不够)
• 斑点杂交的特点
病理学研究中常用的分子生物学基 本技术与其应用
• 分子病理学基本概念 • 现代分子生物学 vs 传统病理学 • 疾病发生过程中 • 分子事件及其与疾病发生的关系 • 揭示 根本机制
• 复习有关的分子生物学概念
• (1)核酸的结构与功能
• 核酸 ---多核苷酸。
• 核酸由核苷酸组成
• 核苷酸由碱基、核糖/ 脱氧核糖和磷酸构成
•
NBT（四氮唑蓝）显色等
• 有两种方法:
• 直接法 直接标记探针
• 间接法 抗原标记探针, 杂交后,再用特异性
•
标记的抗体反应, 在呈色
• 双重原位杂交方法
• 通常有两种方法
• A . 用相邻的连续切片（3 μ），用两 种不同的探针进行原位杂交
• 适用于较大细胞的研究
• 优点 二者杂交过程和结果互不干扰
分子病理学在疾病诊断和治疗中的应用
分子病理学在疾病诊断和治疗中的应用随着科学技术的发展，分子生物学逐渐成为了医学领域中不可或缺的一部分。
分子病理学是将分子生物学应用于病理学中，旨在研究疾病的分子基础和诊断技术。
分子病理学的发展给疾病诊断和治疗带来了新的视野和方法，本文将探讨分子病理学在疾病诊断和治疗中的应用。
一、DNA检测在遗传病中的应用遗传性疾病是一类由基因突变引起的疾病，其传染性并非通过传染病病原体，而是通过受孕时母亲体内胎儿遗传物质的传递。
鉴于其基因突变导致了某些功能的丧失，且不易治愈，因此遗传性疾病成为了绕不开的课题。
分子病理学应用基因检测技术可以准确检测被检测者是否携带致病基因，为此类疾病的筛查、预测和确诊提供了有力的手段。
比如，卡特琳娜病便是由单一基因缺陷引起的一种罕见的遗传性疾病，它会影响人体的免疫系统，其病症表现为反复发生的感染、自身免疫疾病及恶性肿瘤。
基于病因学证据的基因检测技术，可以帮助医生更准确地诊断卡特琳娜病，早期诊断能保证患者及时采取适当的治疗措施从而挽救生命。
二、分子标志物在肿瘤诊断中的应用肿瘤是人类最大的杀手之一，不仅会严重影响生命质量，而且往往导致不可逆的生理缺陷。
分子病理学在肿瘤的诊断和治疗上扮演着非常重要的角色。
分子标志物作为一种生物标记，在癌症的早期发现和精准治疗方面有着巨大的潜力。
例如，在乳腺癌诊断方面，HER2/neu(可理解为人类表皮生长因子受体2)是一种潜在的分子标志物。
HER2是人类乳腺上皮细胞表面的一种受体蛋白，过度表达或突变的HER2可能会导致肿瘤的形成。
因此，HER2准确识别和定位对乳腺癌的早期诊断和精准治疗至关重要。
临床上，医生可以通过采用分子病理学技术，如基因芯片，PCR等，检测HER2/ErbB-2基因的表达水平，从而确定是否应该在乳腺癌治疗中使用HER2注射剂。
三、RNA干扰技术在基因治疗中的应用分子病理学的另一个重要应用领域是基因治疗，而RNA干扰技术就是一个非常具有发展前途的领域。
分子病理学在肿瘤诊断中的应用
分子病理学在肿瘤诊断中的应用近年来，肿瘤的发病率不断增加，而传统的肿瘤诊断方法主要基于影像学和组织学检查，其精度虽然较高，但有时会出现误诊或漏诊的情况。
这时，分子病理学作为一种新兴的诊断手段，逐渐受到人们的关注。
本文将从分子病理学的基本原理、技术手段和临床应用等方面来探讨它在肿瘤诊断中的应用。
一、分子病理学的基本原理分子病理学是以分子生物学为基础的病理学分支，它主要研究疾病产生的分子基础以及疾病的分子机制。
肿瘤是一种由基因突变引起的复杂疾病，因此分子病理学在肿瘤诊断中具有重要的作用。
基本原理包括如下几点：1.基因突变的检测。
分子病理学主要通过检测肿瘤细胞中的基因突变来诊断肿瘤。
肿瘤细胞中的基因突变可以通过PCR技术或序列测定等手段来检测。
2.蛋白质的检测。
在肿瘤细胞中，突变的基因会导致蛋白质的表达异常，因此分子病理学也可以通过检测肿瘤组织中的蛋白质表达变化来诊断肿瘤，如免疫组织化学和蛋白质芯片技术等。
3.细胞信号通路的检测。
许多肿瘤具有细胞信号通路的异常表达，分子病理学也可以通过检测肿瘤细胞中的信号通路分子的表达变化来诊断肿瘤。
二、分子病理学的技术手段为了实现对肿瘤细胞中基因和蛋白质的检测，分子病理学使用了许多新的技术手段，包括PCR技术、DNA芯片技术、蛋白质芯片技术等。
1. PCR技术。
PCR是一种介于分子生物学和分子病理学之间的技术，可以扩增DNA片段。
在肿瘤检测中，PCR技术通常用于检测基因突变，如EGFR基因、KRAS基因等。
2. DNA芯片技术。
DNA芯片是一种用于检测基因表达的技术，可以同时检测成千上万的基因，在肿瘤诊断中可以用于筛查基因突变以及判断肿瘤的类型、分级和预后等。
3. 蛋白质芯片技术。
蛋白质芯片可以同时检测大量的蛋白质表达，可以用于诊断肿瘤和判断药物反应等。
三、分子病理学在肿瘤诊断中的应用分子病理学在肿瘤诊断中的应用主要表现在以下几个方面：1.肿瘤类型的鉴定。
分子病理学可以根据肿瘤细胞中的基因和蛋白质表达变化来鉴定肿瘤的类型，如乳腺癌、肺癌、结直肠癌等。
17 病理学常用技术的原理及应用
免疫组织化学(免疫组化)和免疫细胞化学是利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一种技术，由免疫学和传统的组织化学相结合而形成。免疫组化染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，同时具有将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片、细胞涂片或培养细胞爬片上原位确定某些蛋白质或多肽类物质的存在的特点，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析技术或激光扫描共聚焦显微技术等，可对被检测物质进行定量分析。
电镜技术在生命科学领域可用于胚胎及组织发生学方面的观察和研究，如通过电镜可以了解肿瘤间质新生血管芽的发生和形态特点(图17—2、图17—3)；在临床上可用于多种疾病亚细胞结构病变的观察和诊断，特别是肾小球疾病及肌病的诊断；疑难肿瘤的组织来源和细胞属性判定。如一些去分化、低分化或多向分化肿瘤的诊断和鉴别诊断。随着电镜技术的，不断发展以及与其他方法的综合使用，还出现了免疫电镜技术、电镜细胞化学技术、电镜图像分析技术及全息显微技术等。但电镜技术也有其局限性，如设备昂贵、样本制作较复杂；样本取材少。观察范围有限，有时还可能会遗漏信息：当用于辅助肿瘤的病理诊断时，只能判定肿瘤的组织或细胞的来源，不能确定肿瘤的良恶性。
(三)细胞病理学观察
通过采集病变处的细胞，涂片染色后进行观察、诊断。细胞的来源可以是运用各种采集器在口腔、食管、鼻咽部、女性生殖道等病变部位直接采集的脱落细胞，也可以是自然分泌物(如痰、乳腺溢液、前列腺液)、体液(胸腹腔积液、心包积液和脑积液)及排泄物(如尿)中的细胞，以及通过内镜采集的细胞或用细针直接穿刺病变部位(如乳腺、甲状腺、前列腺、淋巴结、胰腺、肝、肾等)，即细针穿刺(fine neecUe aspiI-ation，FNlA)所吸取的细胞。细胞学检查除了用于病人外，还用于肿瘤的普查。该方法设备简单，操作简便，病人痛苦少易于接受，但最后确定是否为恶性病变尚需进一步经活检证实。此外，细胞学检查还可用于对激素水平的测定(如阴道脱落细胞涂片)及为细胞培养和DNA提取’等提供标本。
分子病理学在肿瘤诊断和治疗中的应用
分子病理学在肿瘤诊断和治疗中的应用随着科技的发展，医学界的研究也越来越深入。
分子病理学作为一种新兴的技术，在肿瘤诊断和治疗中扮演了越来越重要的角色。
分子病理学是病理学和分子基因学的结合，把病理学技术与分子生物学技术结合在一起，对疾病的病理和生物学特性进行研究。
分子病理学不仅可以帮助医生正确地诊断肿瘤，而且还可以对肿瘤的个性化治疗提供重要的依据。
一、分子病理学的基本概念分子病理学是近年来新兴的病理学分支，它是把病理学的技术和分子生物学的技术结合起来，对疾病的病理和生物学特性进行研究。
它主要是利用分子生物学技术，对疾病标志物及其相关蛋白、基因、代谢产物的变化进行检测、分析和评价，从而使病理学上的分类、诊断和治疗更加准确和有效。
二、分子病理学在肿瘤诊断中的应用肿瘤是一种危害人类健康的疾病，而分子病理学就可以帮助医生更准确地诊断肿瘤。
肿瘤的形成是受多个基因所控制的，因此，利用分子生物学的技术检测和分析基因的变异、蛋白的表达等变化，可以找出肿瘤发生和发展的规律，从而找到有效的治疗方法。
例如，利用分子病理学的技术可以检测出HER2/neu基因表达的情况。
HER2/neu基因是编码ERBB2的蛋白，这个蛋白存在于许多肿瘤中，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌和宫颈癌等。
恰当地检测和分析HER2/neu基因的表达，可以对乳腺癌等肿瘤进行域早期发现和诊断，并制定出相应的治疗方法。
三、分子病理学在个性化治疗中的应用个性化治疗是个体化医疗的一种新模式，它是基于疾病的基因特征，为每个患者制定针对性的治疗方案。
肿瘤可以被看作是基因缺陷性疾病，而分子病理学正是发掘患者个体基因信息的重要工具。
对于每个不同的患者，因为其基因的不同表达，需要定制不同的个性化治疗方案。
例如，分子病理学的技术可以对肿瘤细胞基因进行分析，找到基因异常区域，从而为肿瘤治疗提供有针对性的治疗信息，如靶向药物和免疫治疗。
这种个性化治疗不仅有效改善了患者的存活率和生活质量，还避免了无效的化疗带来的严重副作用。
分子病理学的研究内容
分子病理学的研究内容分子病理学是病理学的一个分支学科，它研究的是分子水平上的疾病变化和机制。
分子病理学通过研究生物大分子的结构、功能以及它们在疾病状态下的改变，可以帮助我们更好地理解和诊断疾病，为疾病的预防、治疗和监测提供精准的分子标记和指导。
下面将介绍分子病理学的研究内容。
1. 基因突变和变异：分子病理学通过分析基因组中的突变和变异，研究它们对疾病的发生和发展的影响。
这包括单基因疾病和复杂性疾病的基因突变和关联分析，探究它们与疾病的发病机制和表型之间的关系。
2. 基因表达调控：分子病理学研究基因表达调控的机制和异常。
这包括DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA干扰等调控机制，以及非编码RNA和miRNA对基因表达调控的作用。
通过研究这些调控机制的异常，可以揭示基因表达紊乱与疾病之间的关联。
3. 肿瘤分子病理学：肿瘤分子病理学是分子病理学的一个重要领域。
它通过分析肿瘤细胞中的基因、蛋白质和代谢物的异常表达和变化，揭示肿瘤的分子机制。
这有助于从分子水平上了解肿瘤的发生、发展和转移过程，并为肿瘤的诊断和治疗提供依据。
4. 免疫分子病理学：免疫分子病理学研究免疫系统中的分子变化和免疫相关疾病。
它关注免疫细胞、信号通路和炎症反应相关基因的表达和调控，以及免疫分子标记的检测和应用。
这有助于深入理解免疫系统在疾病中的作用，为免疫相关疾病的诊断和治疗提供新的思路和目标。
5. 分子诊断技术：分子病理学是分子诊断的重要手段之一，它研究和开发各种分子诊断技术和工具。
这包括在疾病诊断中应用的分子生物学技术、基因芯片、PCR、测序、蛋白质组学和代谢组学等。
通过这些技术的应用和研究，可以实现对疾病的早期检测、预测和个体化治疗。
总结起来，分子病理学是通过研究分子水平上疾病变化和机制，来理解疾病的发生和发展的学科。
它的研究内容包括基因突变和变异、基因表达调控、肿瘤分子病理学、免疫分子病理学以及分子诊断技术的研究和应用。
通过这些研究，分子病理学为疾病的诊断、治疗和监测提供了新的思路和方法。
分子病理与分子分型 -回复
分子病理与分子分型-回复分子病理与分子分型的概念和应用范围首先需要进行介绍。
分子病理是一门研究疾病发生和发展机制的学科，通过分析和检测患者体内的遗传物质（例如DNA、RNA和蛋白质等）来揭示疾病的分子机理。
而分子分型则是利用分子病理技术对疾病进行分类，根据不同分子标志物的表达情况或遗传变异来划分疾病的亚型，从而更好地指导临床诊疗和个体化治疗。
一、分子病理的基本原理和技术：1. DNA/RNA提取与纯化：通过特定蛋白酶对组织样本中的细胞膜进行消化，并利用酚/氯仿法或商业化的DNA/RNA提取试剂盒提取和纯化细胞内的DNA/RNA。
2. PCR（聚合酶链反应）技术：通过PCR技术可以扩增和放大DNA/RNA 片段，从而检测微量的遗传物质。
PCR技术广泛应用于基因突变的筛查和基因表达的定量分析。
3. 千基测序技术（Next Generation Sequencing，简称NGS）：NGS 技术能够同时测定大规模的DNA/RNA序列，不仅可以用于基因突变的检测，还可以用于基因表达谱的测定，从而更全面地了解疾病的分子机理。
4. 免疫组织化学（Immunohistochemistry，简称IHC）：IHC技术利用特异性抗体对标靶分子进行染色标记，从而实现对蛋白质的定量和定位分析。
IHC技术可以用于检测癌症标志物以及预测患者的治疗反应和预后。
5. 荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，简称FISH）：FISH技术是一种直接观察基因本座和染色体结构的方法，通过用标记探针对DNA/RNA特定区域的杂交反应，从而实现对特定基因的定位分析。
FISH技术常用于染色体异常的检测和基因扩增的定量。
6. 质谱分析（Mass Spectrometry，简称MS）：MS技术是一种用于分析和鉴定分子式和结构的方法，可以定量测定蛋白质和小分子代谢物等。
质谱分析有助于扩大分子病理学的研究领域，如蛋白质组学和代谢组学。
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Tissue Microarray
组织病理制片技术
显微切割：microdissection
选取同质性研究材料，是在对组织的深入研究中 常常遇到却又不易解决的问题
该技术是在显微状态下或显微直视下通过显微操作系统对选 择的材料（组织、细胞、细胞群、细胞内组分或染色体带等） 进行切割分离并收集用于后续研究的技术
组织固定的方法
蒸汽固定法 某些薄膜组织及血液或细胞涂片中的可溶物质
浸入法
手术取材组织标本和细胞涂片
灌注法
仅适用于动物实验
微波固定法
常用固定剂
醛类固定剂
双功能交联剂，可使组织间相互交联，原位保存抗原 对组织穿透力强，收缩性小 是最常用固定剂
10%中性福尔马林液 4%多聚甲醛缓冲液 2.5%戊二醛（电镜）
在慢性炎症、机化和瘢痕形成等病变中显示胶原纤维，如慢 性肾小球肾炎的肾小球纤维化、大叶性肺炎、血栓机化、风 湿性肉芽肿时Aschoff’s巨细胞消失、胃、十二指肠溃疡愈合、 慢性阑尾炎、肝硬化。
适用于多肽类激素的组织固定
非醛类固定剂 常需与戊二醛或多聚甲醛混合适用降低边缘效应
丙酮及醇类固定剂
穿透性很强，保存抗原活性较好 常用于冰冻切片及细胞涂片固定
组织病理制片技术 常规组织病理制片
脱水，透明，浸蜡，包埋，切片
组织病理制片技术
组织芯片
近年来基因芯片（DNA芯片）技术的发展和延伸，与细胞芯片、蛋 白芯片、抗体芯片一样，属于特殊生物芯片技术 组织芯片技术可将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标本按预 先设计的顺序排列在一张玻片进行分析研究，是一种高通量、多样 本的分析工具
显微切割技术的特点
细微：微米、纳米级切割 原位：所取材料定位清楚 同质：所取材料在一定层次上相同 结合：与其他实验技术结合
显微切割本身不能对样品 进行研究，必须同其他实 验技术结合，其切割目标 完全取决于研究目的
显微切割的方式
手动直接显微切割 机械辅助显微切割 液压控制显微切割 激光捕获显微切割（laser capture microdessection, LCM）
HE染色能非常鲜明地对组织和细胞 染色，是最基本、使用最广泛的技 术方法，又被称为常规染色。
特殊染色
显示HE染色不明显的目的物，如Gridley染色能 突出显示感染的霉菌
区别常规HE染色不能鉴别的病变，如V.G染色可 区分胶原纤维和平滑肌
显示某些常规HE染色中不能看到的目的物，如 网状纤维、星形细胞的突起和结核杆菌等
医学实验技术原理及选择
常用医学实验动物模型的种类及选择 组织学实验技术 细胞生物学实验技术 分子生物学实验技术 蛋白质化学技术 免疫学实验技术 医学微生物学实验技术
分子病理学常用实验方法
• 组织标本取材与固定 • 病理制片 • 切片 • 染色：常规/特殊 • 原位蛋白质检测 • 原位核酸检测
组织标本一般处理流程
结缔组织染色 胶原纤维染色
分布最广、含量最多的一种纤维
Van Gieson氏苦味酸—酸性 品红染色法（简称V.G法） Masson氏三色染色法 Mallory氏三色染色法 Pollak氏三色染色法 Sirius Red苦味酸法等
胶原纤维染色的应用
在病理诊断上主要用于和肌纤维相鉴别
来源于间胚叶的肿瘤如纤维瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤、神经 纤维瘤及其肉瘤等的诊断和鉴别诊断。
细胞悬液
IF、FCM
细胞取材方法适用范围及优缺点比较
印片法
穿刺法
沉淀法 细胞爬片法
适用范围 活检组织标本、 实质器官的病
手术切除标本的 变区细胞取材 细胞取材
体液多细胞少 的标本
有贴壁生长特性 的细胞，如纤维 母细胞、粘液癌 细胞
优 点 简便省时，细胞 操作简便，细 操作简便，细 操作简便，保持
抗原保存较好 胞形态保持较 胞形态保持较 细胞形态及活性
全自动组织处理机
石蜡包埋机
石蜡切片机 硬组织切片机
震荡切片机 冰冻切片机
冰冻切片机
常用组织切片染色方法
未经染色的组织切片各部分折射率差别很小，即使有足够的分 辨率和合适的放大倍数，也无法直接在光镜下观察。 通过适当的染色，增大各部分结构折射率差别，提高分辨率
苏木精－伊红染色（HE）
DNA带负电荷，呈酸性，与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键形式结合，呈蓝色 伊红Y为一种合成酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与嗜酸性物质结合呈红色
好
好
缺点
细胞分布不均匀，细胞分布不均 细胞分布不均 适用细胞种类较
易重叠，影响标 匀
匀，易重叠， 少
记效果
影响标记效果
组织固定
定义：将组织浸入适当化学试剂，使细胞内 物质尽量接近其生理状态时的形态结 构和位置的过程
意义： 防止自溶 防止腐败 最大限度保存细胞和组织的抗原性 保留特殊成分：糖原、核酸、色素等
科研水平先进性
工欲善其事必先利其器
选择实验方法的基本原则
必要性
为什么要选择这个方法 替代方法
可行性
实验室条件 经费 时间
基于硬件条件，选择最具有说服力的方法
1．为没有工作经验的医学研究生编写 一本适合自学的手册式教材，为他们 做课题时更快、更好地选择合适的实 验技术提供决策参考。 2．重点介绍同类实验技术的发展沿革、 优劣比较；不同实验技术的特点、用 途、相互关系、发展趋势；各类实验 技术的关键、操作要点和选择示范。 3．重点强调医学实验技术的原理与选 择，而非具体操作，亦非理论知识。
组织取材
固定
不固定
包埋 冻存（不提倡）
冻存
冰冻切片
HE染色 特殊染色
IHC ISH 电镜
蛋白质、核酸提取 固定
不固定
分子生物学实验 -20℃保存 IF/IHC/ISH
细胞标本一般处理流程
活细胞
细胞爬片
细胞离心涂片 细胞培养
固定
形态学 IHC ISH
离心后包埋制片
冻存 Protein/DNA/RNA 分子生物学
分子病理学常用研究方法 原理及选择
实验方法在科研工作中的意义
决定本项研究的意义与水平：
①高水平假说+高精尖手段→高水平的研究 ②高水平假说+一般手段→高水平的研究 ③低水平假说+高精尖手段→一般水平的研究 ④低水平假说+一般手段→低水平的研究
From Prof. XW Bian
立题的先进性 手段的先进性