生物大分子提取技术
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
大分子完整度越高越好。 要求大分子保持天然构象状态，有高度的生
物活性。
希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总
4、收率：
5、速度：
有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。
越快速越好。
DNA的提取纯化
本质：将DNA从组织或
细胞中分离沉淀出来。 要求：去除杂蛋白、多糖、 脂类等大分子杂质，同时 要快速简便。 常用的提取方法： 酚-氯仿提取法
蛋白质是生物功能的执行者
担负着生物催化、物质运输、运动、防御、生
长调控以及记忆、识别等多种生理功能。
核酸-DNA与RNA结构
脱氧腺嘌呤核苷A
A-T对
G-C对
5’C G A A TCAGAA3’ 3’G C T T AGTCTT5’
双链DNA
高级结构
核酸的性质
DNA:双螺旋; RNA单链
预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的 结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生
物需要将菌体与发酵液分开。若不立即进行实验 或加工，应冷冻保存。
二、组织细胞的破碎
应选择适当的方法将组织和细胞破碎，生物大 分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放 出来，并保持原来的天然状态和生物活性。
生物大分子分离纯化的一般程序
①材料的选择和预处理
②破碎细胞及提取（有时还需
要进行细胞器的分离）
③分离纯化：包括粗分级分
离和细分级分离
其中前两个阶段为生物大分子
分离纯化的前处理。
一、材料的选择与预处理
选材，科研选材则无需考虑上述问题，只要能 达到实验目的即可。临床选材则要考虑病人的依 从性。
了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染， 还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某 一物质。
采用差速离心法分离细胞器，即将破碎后的细胞在适当
的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬
酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经 过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多 次分步离心后，即可获得所需组分。
四、提取
将组织细胞破碎，使目标分子被释放出来，并
将其与其它细胞成分分离, 这就是提取。
在此过程中，必须立即将细胞匀浆液置于一定
条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可 能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成 制备物的分解破坏，
五、分离纯化
从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净
的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这
生物大分子提取技术
桂花赞
几度风雨一场凉
人间迎来桂花芳
银桂周身亮繁星 丹桂浓妆新嫁娘 枝头鸟雀絮絮赞 树下骚客搜枯肠
清风淡云圆月下
乾坤万里共清香
生物大分子分离纯化的意义
①生命科学研究的需要：
从生物材料中分离制备核酸、蛋白质，研究其结构与功能， 对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大 意义。
一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两步进行。
核酸分离纯化的一般程序
破碎细胞或组织
提取
纯化
核酸提取技术
DNA提取技术
原理、方法、应用
RNA提取技术
原理、方法、应用
核酸提取的要求
1、纯度： 2、完整度： 3、活性：
主要取决于研究的目的和应用上的要求。如
用于基因扩增的模板DNA纯度要求较低，而用 于治疗的DNA则纯度要求很高。
但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外 的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。
组织细胞的破碎方法
一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎
或用超声波处理破碎。
植物组织和细胞由ຫໍສະໝຸດ 具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的 提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能 达到目的。
3.
2、消化：
4.
上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入
1mg/ml蛋白酶K 0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转 动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化
蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。
3. 酚抽提纯化DNA：
冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直 至水相与酚相混匀成乳状液。5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层
②医学检验需要：
是分析标本中包含的分子信息的前提条件，对于精确诊断 疾病具有重要意义。
③医疗实践的需要：
如用胰岛素治疗糖尿病。
④基因工程的需要：
基因工程疫苗和药物。
中心法则
核酸、蛋白质（酶）是重要的生物大分子
存在于一切生物体中
核酸是遗传信息的携带者
在有机体内指导各种蛋白质的合成。
细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的
骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大 分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波、与石英 砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。
三、细胞器的分离
细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细
胞还有叶绿体。
如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为
带电性-----电泳 水溶性------溶液 变性、复性-------分子杂交 光吸收性质-------浓度\纯度测定 DNA增色效应------TM值测定
蛋白质结构
蛋白质性质
双带电性-----电泳\等电点 水溶性\脂溶性------溶液 分子间识别-------抗原抗体反应 光吸收性质-------浓度\纯度测定 变性
盐析法 高温裂解法 固相吸附洗脱法 碘化钠提取法 磁珠分离法
举例:外周血DNA提取的方法步骤
1. 2.
1、标本预处理： 1ml EDTA抗凝贮冻血于室温解冻后移入5ml离心管中，加 入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500g离心15min, 倾去上清。重复一次。用0.7ml DNA提取液混悬白细胞沉 淀，37℃水浴温育1h。
粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿﹕异戊
醇（24﹕1），上下转动混匀，5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层 粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。
4. 沉淀DNA：
加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的冷无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管， 即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一 1.5 ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，5000g离心5min洗涤DNA，弃上清。 重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液适量溶 解DNA ，DNA完全溶解通常需12-24小时。
物活性。
希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总
4、收率：
5、速度：
有不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。
越快速越好。
DNA的提取纯化
本质：将DNA从组织或
细胞中分离沉淀出来。 要求：去除杂蛋白、多糖、 脂类等大分子杂质，同时 要快速简便。 常用的提取方法： 酚-氯仿提取法
蛋白质是生物功能的执行者
担负着生物催化、物质运输、运动、防御、生
长调控以及记忆、识别等多种生理功能。
核酸-DNA与RNA结构
脱氧腺嘌呤核苷A
A-T对
G-C对
5’C G A A TCAGAA3’ 3’G C T T AGTCTT5’
双链DNA
高级结构
核酸的性质
DNA:双螺旋; RNA单链
预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的 结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生
物需要将菌体与发酵液分开。若不立即进行实验 或加工，应冷冻保存。
二、组织细胞的破碎
应选择适当的方法将组织和细胞破碎，生物大 分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放 出来，并保持原来的天然状态和生物活性。
生物大分子分离纯化的一般程序
①材料的选择和预处理
②破碎细胞及提取（有时还需
要进行细胞器的分离）
③分离纯化：包括粗分级分
离和细分级分离
其中前两个阶段为生物大分子
分离纯化的前处理。
一、材料的选择与预处理
选材，科研选材则无需考虑上述问题，只要能 达到实验目的即可。临床选材则要考虑病人的依 从性。
了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染， 还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某 一物质。
采用差速离心法分离细胞器，即将破碎后的细胞在适当
的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬
酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经 过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多 次分步离心后，即可获得所需组分。
四、提取
将组织细胞破碎，使目标分子被释放出来，并
将其与其它细胞成分分离, 这就是提取。
在此过程中，必须立即将细胞匀浆液置于一定
条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可 能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成 制备物的分解破坏，
五、分离纯化
从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯净
的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化，这
生物大分子提取技术
桂花赞
几度风雨一场凉
人间迎来桂花芳
银桂周身亮繁星 丹桂浓妆新嫁娘 枝头鸟雀絮絮赞 树下骚客搜枯肠
清风淡云圆月下
乾坤万里共清香
生物大分子分离纯化的意义
①生命科学研究的需要：
从生物材料中分离制备核酸、蛋白质，研究其结构与功能， 对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大 意义。
一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两步进行。
核酸分离纯化的一般程序
破碎细胞或组织
提取
纯化
核酸提取技术
DNA提取技术
原理、方法、应用
RNA提取技术
原理、方法、应用
核酸提取的要求
1、纯度： 2、完整度： 3、活性：
主要取决于研究的目的和应用上的要求。如
用于基因扩增的模板DNA纯度要求较低，而用 于治疗的DNA则纯度要求很高。
但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外 的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。
组织细胞的破碎方法
一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎
或用超声波处理破碎。
植物组织和细胞由ຫໍສະໝຸດ 具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的 提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能 达到目的。
3.
2、消化：
4.
上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入
1mg/ml蛋白酶K 0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转 动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化
蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。
3. 酚抽提纯化DNA：
冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直 至水相与酚相混匀成乳状液。5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层
②医学检验需要：
是分析标本中包含的分子信息的前提条件，对于精确诊断 疾病具有重要意义。
③医疗实践的需要：
如用胰岛素治疗糖尿病。
④基因工程的需要：
基因工程疫苗和药物。
中心法则
核酸、蛋白质（酶）是重要的生物大分子
存在于一切生物体中
核酸是遗传信息的携带者
在有机体内指导各种蛋白质的合成。
细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的
骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大 分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波、与石英 砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。
三、细胞器的分离
细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细
胞还有叶绿体。
如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为
带电性-----电泳 水溶性------溶液 变性、复性-------分子杂交 光吸收性质-------浓度\纯度测定 DNA增色效应------TM值测定
蛋白质结构
蛋白质性质
双带电性-----电泳\等电点 水溶性\脂溶性------溶液 分子间识别-------抗原抗体反应 光吸收性质-------浓度\纯度测定 变性
盐析法 高温裂解法 固相吸附洗脱法 碘化钠提取法 磁珠分离法
举例:外周血DNA提取的方法步骤
1. 2.
1、标本预处理： 1ml EDTA抗凝贮冻血于室温解冻后移入5ml离心管中，加 入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500g离心15min, 倾去上清。重复一次。用0.7ml DNA提取液混悬白细胞沉 淀，37℃水浴温育1h。
粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿﹕异戊
醇（24﹕1），上下转动混匀，5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层 粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。
4. 沉淀DNA：
加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的冷无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管， 即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一 1.5 ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，5000g离心5min洗涤DNA，弃上清。 重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液适量溶 解DNA ，DNA完全溶解通常需12-24小时。