生物大分子分离纯
生物样品中生物大分子的分离纯化
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（二）后期的精分级分离纯化 （精制分离方法）
• 一般样品经粗制分级后，体积较小，杂质大部分已被除去。 再根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小 等差异对粗制品进行进一步分离纯化。
性质
分子大小和形态
具体方法
差速离心、超滤法、分子筛、透析
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（三）生物材料的选择和预处理
1.从工业角度考虑
应选择含量高、来源丰富、易获
得且制备工艺简单、成本低廉的 动植物组织或微生物作为原料。
2.从科研角度考虑
只需考虑材料的选择符合实验预 定的目标要求即可。
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生物材料的选择和预处理
3. 选植物材料时，注意植物的季节性、地理位置和生长 环境等；
4. 选动物材料时要注意其年龄、性别、营养状况、遗传 素质和生理状态等；
生物大分子的 分离纯化和鉴定
生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类分子， 是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命 的基本单位。
包括
小分子（如脂类、激素、维生素等） 生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）
什么是生物大分子？
生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分 的各种分子量达到上万或更多的有机分子，结构具 有一定的规律性，大多是由基本结构单位按一定顺 序和方式连接而形成的多聚体。
生物大分子分离与纯化技术
生物大分子分离与纯化技术
是生物学、生物医学和生物工程领域中非常重要的技术之一。它可以用于提取和分离生物大分子，从而达到纯化的目的。本文将着重探讨的原理、方法和应用。
一、原理
在生物细胞中，不同的生物大分子有着不同的形态、结构和性质。为了分离和纯化这些生物大分子，需要利用它们的理化性质差异。例如，蛋白质可以通过电泳分离，根据电荷、分子量等差异分离出不同的成分；核酸则可以通过浓度梯度离心分离，根据密度差异分离出单独的成分。还有一些生物大分子，如多肽、糖类、脂质等，可以通过其他特殊方法分离。
二、方法
1. 柱层析法
柱层析法是中常用的重要方法之一。它利用固定相（柱子中的树脂）和流动相（洗脱缓冲液）之间的相互作用来分离和纯化生物大分子。根据固定相和洗脱缓冲液的不同性质，可以选择不同的柱层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
2. 电泳法
电泳法是基于生物大分子的电荷差异和分子量差异的原理，将不同的生物大分子分离并捕获的技术。根据电泳介质、运行方式以及电场的不同条件，可以选择不同的电泳方法，如蛋白质电泳、DNA电泳、脂质电泳等。
3. 超滤法
超滤法是利用微孔过滤膜的不同截留分子量，将生物大分子按照大小分离纯化的技术。超滤法分为正压式和负压式，正压式是通过液体压力将生物大分子向膜孔
内压缩，从而分离得到小分子；负压式是通过负压将大分子向膜孔内吸附，难以通过的是大分子。
4. 溶剂萃取法
溶剂萃取法是将生物大分子从混合物中溶解到特定的有机溶剂中，然后通过反萃取、扩散等工艺，使它在不同相中转移、分离和纯化的方法。
生物大分子分离纯化技术(159页)
（5）生物大分子分离方法多采用温和的 “多阶式”方法进行。 一个生物分子的分离制备常常少则 几个，多至十几个步骤，并不断变换各 种分离方法，以达到纯化目的。
（6）对其均一性的评定常常是有条件的Leabharlann Baidu 与化学上纯度的概念并不完全相同。
（7）严格防止污染。 外界污染、 体系中重金属离子、 细胞自身酶系及其他有毒物质的污染。
生物分离纯化案例
生物分离纯化案例
生物分离纯化是一种将目标生物分子从复杂的混合物中分离出来的技术，常用于生物医药、食品工业和环境监测等领域。以下是一个生物分离纯化的案例：
目标：分离纯化某种特定的酶
步骤：
1. 破碎细胞：使用物理或化学方法破碎细胞，释放出细胞内的酶。
2. 离心分离：通过高速离心机将破碎的细胞残渣与酶溶液分开。
3. 过滤：使用过滤器去除未破碎的细胞和杂质。
4. 层析：使用层析技术（如凝胶层析、离子交换层析等）将酶与其他杂质分离。
5. 透析：将层析得到的酶溶液与外界溶液进行物质交换，进一步纯化酶。
6. 浓缩：使用蒸发等方法将酶溶液浓缩，便于后续处理。
7. 结晶：通过结晶方法将纯化的酶结晶化，便于储存和运输。
通过以上步骤，可以将目标酶从复杂的混合物中分离出来，并进行纯化处理。在实际操作中，根据不同的目标和要求，可以选择不同的分离纯化方法和技术。
生物大分子的纯化和分析方法
生物大分子的纯化和分析方法生物大分子是生命体系中最基本的组成部分，其中包括蛋白质、核酸、多糖等。纯化和分析这些生物大分子是生物学研究的重要内容之一。本文将介绍常用的生物大分子纯化和分析方法。
一、蛋白质的纯化方法
1.盐析法
盐析法是最常用的蛋白质分离方法之一。通过加入盐类来改变水的离子强度以影响蛋白质的溶解度，从而将蛋白质与其他分子分离出来。这种方法适用于分子量较大的蛋白质，对于小分子蛋白质效果不佳。
2.层析法
层析法依据化学性质和大小形状的差异来分离蛋白质。常用的层析法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和逆相层析等。
3.电泳法
电泳法是将蛋白质在电场中移动分离的方法，常用的电泳方式有SDS-PAGE和2D-PAGE。
二、核酸的纯化方法
1.硅胶凝胶柱层析法
硅胶凝胶柱层析法通过核酸与硅胶上化学键接触而吸附在柱胶上，不同大小的核酸在这些化学键上停留的时间不同，从而实现核酸的分离。
2.等电点电泳法
等电点电泳法根据核酸的等电点，将核酸在特定电位下移动，分离出不同等电点的核酸，适用于分离等电点差异较大的核酸。
3.差示电泳法
差示电泳法利用核酸在电场下移动速度的不同，将不同大小、结构和电性的核酸分离。
三、多糖的纯化方法
1.醇沉法
醇沉法是将多糖溶液中的酒精浓度逐渐提高，使得多糖从水溶解态转为沉淀态的方法。
2.凝胶过滤层析法
凝胶过滤层析法利用多糖分子的差异性，在凝胶中筛选分子大小相似的多糖物质。
3.亲和层析法
亲和层析法是一种采用选择性结合的谷蛋白或其他多糖结合剂来分离多糖的方法。
结论
生物大分子的纯化和分析方法多种多样，常用的方法有盐析法、层析法、电泳法、醇沉法、差示电泳法等。选择合适的方法能够有效地纯化和分离目标大分子，为生物学研究提供了重要的帮助。
4生物分子的分离纯化-医学分子生物学讲义
真核基因组DNA的分离纯化
尽管基因组DNA因来源、性质以及制备的目的 不同，其分离纯化的方法不尽相同，但有关分 离纯化的原则、主要步骤、主要技术、主要试 剂及其作用原理是一样的。基因组DNA分离纯 化的一般程序见图7-4。
真核 基因 组DNA 分离 纯化 的一 般技 术路 线
1、酚抽提法
本法最初于1976年由Stafford及其同事提出， 通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂 解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用 pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定 纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获 得所需的DNA样品。
常用破碎方法
破碎方法
机械法
研磨法
匀浆法
捣碎法
化学法
酶解法
去垢剂
有机溶剂
物理法
反复冻融法
超声波法
低渗裂解法
冷热交替法
应用 细菌、酵母 机体软组织 动物韧性组织 细菌、酵母 组织、细胞 细菌、酵母
细胞 细胞悬液 红细胞 细菌、病毒
影响提取效果的因素
（1）pH值 （2）盐浓度（即离子强度） （3）温度 （4）水解酶 （5）搅拌与氧化 （6）有机溶剂
•由于条件温和，该法特别适用于大质粒DNA （>15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎 片缠绕在一起而丢失，故产率不高。
3、煮沸裂解法
生物产品分离纯化技术
生物产品分离纯化技术
生物产品分离纯化技术是指将从生物系统中提取或获得的混合物或复杂混合物中的生物分子分离和纯化的一系列技术和方法。这些技术包括但不限于以下几种：
1.色谱技术：如凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等，可用于分离和纯化蛋白质、核酸、代谢产物等生物大分子。
2.超滤技术：可用于分离和纯化多糖、蛋白质、核酸等小分子。
3.亲和层析技术：利用配对结合剂将特定蛋白质、酶等生物大分子与树脂表面结合，实现富集和纯化。
4.透析技术：如透析膜、透析柱等，可用于分离和富集生物大分子。
5.离心技术：如高速离心机、超高速离心机等，可用于分离和纯化细胞、亚细胞组分等微小生物颗粒。
6.电泳技术：如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、转移蛋白电泳等，可用于分离和纯化蛋白质、核酸等生物大分子。
这些技术的选用取决于具体的分离纯化目的和样品特性，以及实验条件和要求。
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生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化
由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。为了避免盲目，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。
1 沉淀法
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH 值、离子强度和极都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：
⑴中盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。
⑶选择沉淀（热变沉淀和酸碱变沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变的杂蛋白。
⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
生物大分子的分离与制备3
为了防止电器长时间运转产生过多的热量，常采 用间歇处理和降低温度的方法进行。
超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波 的声频、声能有关。
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超声波破碎的机理：
一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（
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生物分子的结构与功能分析：
1. 蛋白质结构分析
2. 酶活力检测
3. 蛋白质组学分析
4. DNA序列分析
5. 聚合酶链反应（PCR）6. 分子杂交
7. 基因克隆
8. 基因组文库构建
9. cDNA文库构建
10. 文库筛选
11. 报告基因检测
12. 基因芯片
13. 基因敲除
14. RNAi
15. 转基因动物
➢ 超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物 的破碎。
➢ 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，
对酵母菌的效果较差。 ➢ 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质
失活。 ➢ 超声波破碎的有效能量利用率极低
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制备生物大分子的分离纯化方法多种多样， 主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的 大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、 电荷和与其他分子的亲和性等。
小分子纯化和大分子纯化
小分子纯化和大分子纯化
小分子和大分子纯化是在化学和生物化学领域中常见的两种不同的分离和提纯过程，分别适用于不同类型的物质。
小分子纯化：
定义：小分子通常指相对较小的有机或无机分子，如药物、有机溶剂等。
方法：小分子纯化的方法主要包括溶剂萃取、结晶、色谱技术（如薄层色谱、气相色谱、液相色谱）、蒸馏等。这些方法通过利用小分子之间的物理化学性质的差异，将混合物中的目标分子分离出来，并达到纯化的目的。
大分子纯化：
定义：大分子通常指生物大分子，如蛋白质、核酸、多糖等。
方法：大分子纯化的方法较为复杂，主要包括凝胶电泳、离心、超滤、层析（如凝胶层析、离子交换层析、亲和层析）等。这些方法通过利用大分子的大小、电荷、亲和性等特征，实现对大分子的高效分离和纯化。
总体而言，小分子纯化和大分子纯化都是为了从混合物中提取出纯净的目标物质，但由于它们所涉及的物质类型和特性不同，所采用的具
体方法和技术也有很大的区别。
生物分子的分离和纯化技术
生物分子的分离和纯化技术生物分子的分离和纯化是生命科学研究中不可或缺的一环，也是许多生物医学应用和生产工艺的核心。分子的分离和纯化技术包括多种方法，其基本原理是利用不同的物理和化学性质，将混合系统中的各个分子分离开来。
生物分子的分离和纯化技术通常是从含有目标分子的组织或细胞裂解液中开始的。通常，该液体首先要通过离心等手段除去细胞碎片、核酸、脂质和其他杂质。接下来，可以利用不同的分离和纯化技术分离和纯化目标分子。下面将介绍几种通用的分子分离和纯化技术。
1.凝胶过滤chromatography
凝胶过滤chromatography是一种分子分离技术，通常用于分离分子量不同时的生物大分子。凝胶过滤chromatography基于分子体积的大小，通过孔径大小选择分子的峰值通过孔径大小选择分子的峰值。较大分子通常沿着填充体的较周折的路径流过，而较小分子则会进入较细的分子而停留在其中。由于这种技术可以清除大小不同的杂质，使样品更纯净并且不受影响。它也可以用于分离游离的生物大分子，例如酶和蛋白质。
2.离子交换chromatography
离子交换chromatography是一种电静力分离技术，通常用于分
离带有相反电荷的生物大分子。离子交换chromatography基于非
共享原子、阴离子和阳离子之间的吸引力或排斥引力原理。通过
这种方式，样品中的阴离子分子可以被吸附到阳离子交换树脂中，而阳离子分子可以被吸附到阴离子交换树脂中。这种技术通常用
于纯化蛋白质和其他biomolecules
3.氢氧化铝亲和chromatography
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化是指对生物大分子，如蛋白质、核酸、多肽以及其他生物高分
子的理化分离，以获得所需的高级别的纯度和净化标准的过程。此外，功能地也可以应用
于提取细胞和细胞组织特定的成分。
一般来说，分离纯化同表征大分子是以不同的方式实现的。对于蛋白质，离心分离是
一种常用的技术，这是一种使用立体速度分离不同物质的有效方法。因为蛋白质它们有不
同的表面电荷和大小，因此它们在加速度下受到不同的力，从而能够受到力，从而使不同
的类型的蛋白质分离开来，产生分离纯化的产物。
此外，层析技术也可以用于对蛋白质进行分离纯化。这个过程使用一种特定的介质，
该介质被用于环境或两种环境之间的运动原理，通过独特的该介质通道，根据不同的冶金
电荷，使得蛋白质分离到不同的有效产品中。
另外，还有其他许多特定技术可以用于生物大分子的分离纯化，比如电泳和柱层析技术。这两种技术都是基于维持生物大分子的不同状态（流变或电泳）的原理，这种状态可
以使不同的成分分离开来，从而获取高纯度的成分。这两种技术的精确度取决于集成柱的
大小和类型，以及实现特定的湿度和电荷的原理。
当讨论以上技术以外的技术时，分离和精制并不是只有蛋白质才有，尽管在蛋白质的
技术中可能是最常见的，但核酸、多肽和其他有机分子也可以用这些技术进行分离和精制。有几种不同的方法可以用于高级分离现象，其中一些是像柱层析、集成离子交换以及沉淀法，这些技术被广泛应用于生物大分子的分离和纯化。
总的来说，生物大分子的分离纯化是一种复杂的过程，需要仔细挑选一种或多种分离
纯化技术，以实现所需的纯度要求的目的。选择的技术必须适合特定的大分子和纯度要求，以实现最佳效果。
生物大分子的分离纯化与鉴定方法研究
生物大分子的分离纯化与鉴定方法研究
生物大分子的分离纯化与鉴定是生物学研究中非常重要的一步。合理选择适用的方法能够高效地分离纯化目标物质，可帮助研究者深入了解其结构和功能。本文将介绍几种常用的生物大分子分离纯化与鉴定方法。
一、凝胶电泳法
凝胶电泳法是一种常用的生物大分子分离方法。通过电场的作用，将样品中的生物大分子按照尺寸或电荷迁移，从而实现分离。常见的凝胶电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）等。PAGE适用于蛋白质的分离纯化，而琼脂糖凝胶电泳适用于DNA和RNA的分离纯化。
二、超速离心法
超速离心法是利用离心机产生高速转动，使样品中的物质根据其密度和大小差异分层离心的一种方法。通过超速离心可以实现生物大分子的纯化，如蛋白质的沉淀、核酸的沉淀等。超速离心法可以快速分离不同密度或不同分子量的生物大分子，得到纯度较高的目标物质。
三、气相色谱法（Gas chromatography）
气相色谱法是一种常用的化合物分离和定量分析方法，常用于分离和鉴定挥发性或半挥发性有机化合物。该方法主要通过样品在固定相与流动相共同作用下，依据不同的分配系数在色谱柱中发生分离。气相色谱法广泛应用于有机化学、环境监测、食品安全等领域。
四、质谱法（Mass Spectrometry）
质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可用于生物大分子的分离和鉴定。它主要通过测量被测目标物质的质荷比，进而得到目标物质的质
量信息和结构信息。质谱法在生物学研究中被广泛应用于蛋白质组学、代谢组学等领域，可用于分析和鉴定复杂生物样品中的分子。
生物大分子的分离纯化和鉴定
03
生物大分子的鉴定
鉴定方法
化学分析法：通 过化学反应对生 物大分子的组成 和结构进行分析。
免疫分析法：利 用抗体与抗原的 特异性结合，对 生物大分子进行 检测和识别。
生物活性测定法： 通过检测生物大 分子对细胞或生 物体的活性影响， 确定其结构和功 能。
分子生物学方法： 利用分子杂交、 PCR等技术对生 物大分子进行基 因水平和蛋白质 水平的鉴定。
分离纯化的应用
生物制药：分离纯化技术用于制备高纯度药物，提高药物的疗效和安全性。
基因工程：通过分离纯化技术获得纯化的基因或蛋白质，用于基因治疗、药物研发和生物 医学研究等领域。
蛋白质组学：分离纯化技术用于蛋白质的分离、纯化和鉴定，促进蛋白质组学的研究和发 展。
生物燃料：分离纯化技术用于生产高纯度的生物燃料，如乙醇、生物柴油等，替代化石燃 料，减少环境污染。
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生物大分子的分离纯化和
鉴定
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生物大分子的分离纯化
生物大分子的鉴定
生物大分子分离纯化和鉴定的技术 发展
生物大分子分离纯化和鉴定的应用 领域
01
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02
生物大分子的分离纯化
分离纯化的方法
离心法：利用离心机的高速旋转产生的离心力使生物大分子沉降或悬浮，达到分离纯化 的目的。
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
1. 透析
自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。
生物大分子的分离和纯化技术
生物大分子的分离和纯化技术生物大分子是指具有较大分子量的生物分子，如蛋白质、核酸、多糖等。要研究这些生物大分子的结构和功能，需要对它们进行
分离和纯化。生物大分子的分离和纯化技术是生物学和生物工程
学中的重要内容，它们的发展和应用使得我们能够更深入地了解
生命的奥秘，同时也推动了医药、农业、工业等领域的发展。
生物大分子的分离和纯化需要经过多个步骤，这些步骤通常包
括细胞破碎、分子分离、分子鉴定等。其中，分子分离是最基本、最关键的步骤之一，它可以使得目标分子从复杂混合物中被分离
出来，并得到相对纯度较高的产物。目前，生物大分子的分离和
纯化技术包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、尺寸排
除层析、逆向相色谱层析和高效液相色谱层析等方法。
凝胶过滤层析是一种基于分子尺寸差异的分离方法。在这种方
法中，样品被加入到一列凝胶柱中，较大的分子无法穿过凝胶孔隙，而较小的分子则可以顺着凝胶孔隙通过。因此，随着溶液通
过凝胶柱，不同大小的分子会被分离出来。这种方法适用于大小
分子差异较大的生物大分子的分离。
离子交换层析是基于分子电荷的分离方法。在这种方法中，一
种带有正电荷或负电荷的树脂被用来吸附目标分子，通过控制溶
液的pH和离子强度等参数，可以使得目标分子从树脂上逐渐被洗下来。这种方法适用于分子之间的电荷差异较大的生物大分子的
分离，如蛋白质。
亲和层析是一种基于分子亲和性的分离方法。在这种方法中，
一种特殊的树脂被用来吸附具有特定结构或性质的目标分子。例如，可以将某种亲合剂固定在树脂上，然后用于吸附与该亲合剂
有特异结合关系的目标分子。这种方法适用于具有高度特异性活
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加磷酸缓冲溶液、再加硫酸铵饱和溶液。要在搅拌下缓 慢匀少量多次地加入尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造 成不应有的蛋白质沉淀。
在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离。
转移
离心
匀浆液+ 药品混匀
粗蛋白
等电点沉淀技术 许多蛋白质在其等电点（pI）处净电荷为零， 溶解 度最低，可以沉淀出来。故选用适当 的缓冲液，调节pH，可将目的物以沉淀状 态分离，再重新溶于适当的缓冲液，以供 进一步纯 可尝试调配pi=6.2 ，沉淀所需蛋白。
生物材料选择
制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源 无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。 选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本 低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎 后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先 破碎细胞。 植物要先去壳、除脂。 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。 生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度 冷冻保存。
(3)化学与生物化学方法：
1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度 下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等） 的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。 2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀 盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细 胞膜胀破释放出细胞内含物。
分离纯化
• 刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品， 含有许多杂质，必须进一步分离纯化。分 离提纯各种生物大分子，主要根据各种物 质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力 大小等差异，选用有机溶剂沉淀，等电点 沉淀，盐析，层析，电泳，超离心，吸附， 结晶等方法
分离 纯化
刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多 杂质，必须进一步分离纯化。分离提纯各种生物大分 子，主要根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、 亲和力大小等差异，选用有机溶剂沉淀，等电点沉淀， 盐析，层析，电泳，超离心，吸附，结晶等方法。
电荷性质的差异
离子交换层析法 凝胶过滤法
电泳法
分子大小形状差异
超滤法 离心法
透析法 沉 淀 法 盐析 有机溶剂沉淀 选择性沉淀
溶解度差异
分配层析 萃取 结晶
产品处理
• 浓缩、干燥
• 经过分离、纯化得到的提取液有时很稀，体积较 大，需要采用蒸馏法、冰冻法、吸收法、超滤法 等，去除水分而浓缩、干燥。
• 保存
(2)物理法：
1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然 后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于 细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀 破碎。 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁 和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。 3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在 1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一 个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用 此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却， 如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。
一、生物大分子的分离与纯化技术
二、肝酶提取
引言
在自然科学，尤其是生命科学高度发展 的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的 结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课 题，而生物大分子结构与功能的研究，必须 首先解决生物大分子的制备问题，有能够达 到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题， 结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大 分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困 难的工作。
组织细胞的破碎
不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破 碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞 膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤 维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方 法。
(1)机械法：
1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少 量石英砂研磨或匀浆。 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常 可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用 10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分 散器)将组织的细胞打碎。
移 入 匀 浆 器
蛋白质的粗提
原 理 中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面的 双电层和水膜，从而使蛋白质从溶液中 凝聚沉淀析出。（但沉淀不同的蛋白质 所需盐类的浓度不同。例如，50％饱和 的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而 33％饱和的硫酸铵则使γ-球蛋白沉淀。） 因此，可根据所要分离的蛋白质，选择 不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。
粗蛋白
纯 化 蛋 白
活性的检验
• 根据不同的蛋白酶的不同结构，有相对的 药品进行检验，造成颜色反应等。 • 如谷丙转氨酶加丙氨酸和a-酮戊二酸，生成 丙酮酸和谷氨酸，再加显色剂2，4-二硝基 苯肼生成丙酮酸二硝基苯肼，用比色法， 可计算其活性。
纯化蛋白 标准蛋白
SDS凝胶 电泳 根据与标准蛋 白的比对鉴定 出蛋白
蛋白的纯化
• 层析： • 离子交换层析：定相是具有固定电荷的离子交换剂， 动相是具有不同PH值和离子强度的溶液 • 凝胶层析：又称凝胶过滤、分子筛层析、凝胶渗透层 析等。主要是根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效 应不同而进行分离的。 • 吸附层析：主要根据物质对活性固体表面吸附亲和力 的差异来分离。 • 分配层析：是根据素质在定相中溶解度的差异或在 定相和动相中溶解度的差异来进行分离的 • 亲和层析：是根据生物大分子的生物特异性吸附来进 行分离的。
设计思路
• 前期准备 初级提取分离 精细分离纯化 生物材料的选择 及预处理 组织与细胞破碎 纯度鉴定
产物处理
前期准备
一、明确目的和要求 二、了解的生物大分子的物学性质
1)在水和各种有机溶剂中的溶解性。 2)在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的 稳定性 3)固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 4)各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电 的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、 树脂等填料中的分配系数 5)其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性 和对各种化学试剂的稳定性。 6)对其他生物分子的特殊亲和力。
结构的蛋白质中具有三级结构的球蛋白
• 结合酶：分蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)和辅助因子
(cofactor)，辅助因子中含金属离子、小分子化合物
• PI：等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子
和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性， 此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点。
• 保存应在低温避光环境下，有时还需加入防腐剂 或稳定剂，防止生物大分子变性失活。
肝酶分离纯化与鉴定
• 设计从动物肝组Fra Baidu bibliotek中分离、提取、纯 化、和鉴定一种酶（该酶由不同的亚基组 成，为结合酶，pI=6.2）的技术路线，并说 明试验各步骤的原理
相关问题
• 亚基：组成蛋白质四级结构最小的共价单位，是指四级
碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；
温度升高，溶解度加大； 远离等电点的pH值，溶解度增加。
提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。
⑴ 水溶液提取：蛋白质和酶的提取一般以水 溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳 定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常 用的溶剂。 ⑵ 有机溶剂提取：一些和脂类结合比较牢固 或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶 于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比 例的有机溶剂提取。
“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使 被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状 态不丢失生物活性的过程。 影响提取的因素主要有： 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；
由固相扩散到液相的难易；
溶剂的pH值和提取时间等。 通常：极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；
3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶 和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞 壁分解。 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜 溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
生物大分子的提取
什么是生物大分子？
生物体内结构具有一定的规律 性，由基本结构单位按一定顺序和 方式连接而形成的多聚体称为生物 大分子。其分子量一般大于10000。 有：蛋白质(包括酶)、多聚糖和核 酸类化合物等。
生物大分子分离纯化的特殊性
• ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种 乃至几千种化合物。 • ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微， 分离纯化的步骤繁多，流程长。 • ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境 时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活， 就是生物大分子提取制备最困难之处。 • ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的， 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种 组成的综合影响，很难准确估计和判断。
取动物肝脏组织
凝胶电泳鉴定提取纯度
制作组织浆液
实验主要流程
活性的检验
所需蛋白的粗提
蛋白的纯化
取动物肝脏组织
• 材料选择。选取新鲜的，饥饿24小时的动 物的肝脏，生理盐水多次洗涤，低温保存。
制作组织浆液
取新鲜动物肝脏剪碎 冰放进培养皿中
为减低研磨或匀浆过程中发热，所用 器皿和溶液需要预冷
匀浆液
过滤