生物大分子分离纯
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）2. 透析自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。
在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。
通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。
保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。
透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。
商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。
为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。
可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。
实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。
使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。
生物大分子分离与纯化技术
生物大分子分离与纯化技术是生物学、生物医学和生物工程领域中非常重要的技术之一。
它可以用于提取和分离生物大分子，从而达到纯化的目的。
本文将着重探讨的原理、方法和应用。
一、原理在生物细胞中，不同的生物大分子有着不同的形态、结构和性质。
为了分离和纯化这些生物大分子，需要利用它们的理化性质差异。
例如，蛋白质可以通过电泳分离，根据电荷、分子量等差异分离出不同的成分；核酸则可以通过浓度梯度离心分离，根据密度差异分离出单独的成分。
还有一些生物大分子，如多肽、糖类、脂质等，可以通过其他特殊方法分离。
二、方法1. 柱层析法柱层析法是中常用的重要方法之一。
它利用固定相（柱子中的树脂）和流动相（洗脱缓冲液）之间的相互作用来分离和纯化生物大分子。
根据固定相和洗脱缓冲液的不同性质，可以选择不同的柱层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
2. 电泳法电泳法是基于生物大分子的电荷差异和分子量差异的原理，将不同的生物大分子分离并捕获的技术。
根据电泳介质、运行方式以及电场的不同条件，可以选择不同的电泳方法，如蛋白质电泳、DNA电泳、脂质电泳等。
3. 超滤法超滤法是利用微孔过滤膜的不同截留分子量，将生物大分子按照大小分离纯化的技术。
超滤法分为正压式和负压式，正压式是通过液体压力将生物大分子向膜孔内压缩，从而分离得到小分子；负压式是通过负压将大分子向膜孔内吸附，难以通过的是大分子。
4. 溶剂萃取法溶剂萃取法是将生物大分子从混合物中溶解到特定的有机溶剂中，然后通过反萃取、扩散等工艺，使它在不同相中转移、分离和纯化的方法。
5. 其他方法生物大分子的分离和纯化方法还有一些其他方法，例如磁性珠法、浓缩法、冷冻干燥法等。
三、应用在生物医学、生物工程、食品工业、环境保护和新能源开发等领域中有广泛的应用。
具体来说，1. 生物医学领域生物医学领域的应用主要是分离和纯化蛋白质和多肽类物质，如酶、抗体、激素、血浆蛋白等。
这些物质可以作为药物、诊断试剂、生物治疗的原材料等。
生物大分子分离纯化技术(159页)
亲和色谱法由于具有极高的生物特异性，分离目的物受到理 化性质相似的杂质干扰极少，能从比较复杂的组织抽提液或细菌 发酵液中一步提取分离出所需的物质，提纯倍数可达一百倍以上 。
早期分离提纯的方法，选择的原则一般是从低分辨能力到高分 辨能力，而且负荷量较大为合适。但随着许多新技术的建立，一 个特异性方法其分辨能力越高，便意味着提纯步骤的简化，提纯 步骤的减少，回收率越高，具有生理活性物质变性的危险性就越 少。
制备物均一性的鉴定
对一个新分离的物质是否纯，常用“均一性 ”表示，均一性即指所获得的制备物只具有一 种完全相同的成分。蛋白质均一性常用的几种 鉴定方法：
1.溶解度法： 2.电泳均一性的测定法： 3.高速离心沉淀法：
生物大分子的纯化和分析方法
生物大分子的纯化和分析方法生物大分子是生命体系中最基本的组成部分，其中包括蛋白质、核酸、多糖等。
纯化和分析这些生物大分子是生物学研究的重要内容之一。
本文将介绍常用的生物大分子纯化和分析方法。
一、蛋白质的纯化方法1.盐析法盐析法是最常用的蛋白质分离方法之一。
通过加入盐类来改变水的离子强度以影响蛋白质的溶解度，从而将蛋白质与其他分子分离出来。
这种方法适用于分子量较大的蛋白质，对于小分子蛋白质效果不佳。
2.层析法层析法依据化学性质和大小形状的差异来分离蛋白质。
常用的层析法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和逆相层析等。
3.电泳法电泳法是将蛋白质在电场中移动分离的方法，常用的电泳方式有SDS-PAGE和2D-PAGE。
二、核酸的纯化方法1.硅胶凝胶柱层析法硅胶凝胶柱层析法通过核酸与硅胶上化学键接触而吸附在柱胶上，不同大小的核酸在这些化学键上停留的时间不同，从而实现核酸的分离。
2.等电点电泳法等电点电泳法根据核酸的等电点，将核酸在特定电位下移动，分离出不同等电点的核酸，适用于分离等电点差异较大的核酸。
3.差示电泳法差示电泳法利用核酸在电场下移动速度的不同，将不同大小、结构和电性的核酸分离。
三、多糖的纯化方法1.醇沉法醇沉法是将多糖溶液中的酒精浓度逐渐提高，使得多糖从水溶解态转为沉淀态的方法。
2.凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法利用多糖分子的差异性，在凝胶中筛选分子大小相似的多糖物质。
3.亲和层析法亲和层析法是一种采用选择性结合的谷蛋白或其他多糖结合剂来分离多糖的方法。
结论生物大分子的纯化和分析方法多种多样，常用的方法有盐析法、层析法、电泳法、醇沉法、差示电泳法等。
选择合适的方法能够有效地纯化和分离目标大分子，为生物学研究提供了重要的帮助。
生物大分子的纯化和结构分析
生物大分子的纯化和结构分析在生物学研究中，大分子是一个非常重要的研究对象。
它们是生物体内一些重要的分子，如蛋白质、核酸、糖类等。
这些大分子的复杂性和多样性使得它们的纯化和结构分析非常具有挑战性。
本文将探讨生物大分子的纯化和结构分析的基本原理和方法。
一、生物大分子的纯化生物大分子的纯化是生物学研究中的一个基础性实验步骤，也是研究生物大分子结构和功能的前提。
生物大分子的纯化就是把它们从其他生物体内分子中分离出来，使其达到一定的纯度，以满足后续的结构和功能研究需要。
其中，蛋白质纯化是生物学研究中的一个重要问题之一，因为蛋白质是生物体内最为重要的大分子之一。
1.1 分离方法生物大分子的纯化需要一系列的实验分离步骤。
根据大分子的化学性质和生物来源不同，分离方法也有所不同。
主要的方法包括：（1）分子排斥色谱（size exclusion chromatography）：根据分子的大小分离。
（2）离子交换色谱（ion exchange chromatography）：根据分子的电荷差异分离。
（3）亲和色谱（affinity chromatography）：根据分子的特异配体分离。
（4）逆向相色谱（reverse-phase chromatography）：根据分子的疏水性分离。
1.2 纯度检测生物大分子的纯度检测是生物学研究中的一个关键环节。
生物大分子的结构和功能的研究都需要高纯度的样品。
目前常用的纯度检测方法有：（1）SDS-PAGE：钠二十硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳。
（2）Western blotting：蛋白质的免疫印迹。
（3）UV吸收光谱：在280纳米处进行吸光度检测。
二、生物大分子的结构分析生物大分子的结构分析是生物学研究中一个非常重要的研究领域，因为分子的结构直接关系到其功能。
目前，生物大分子的结构分析主要有两种方法：晶体学和核磁共振。
2.1 晶体学晶体学是生物大分子结构分析的传统方法。
该方法要求分子能够形成晶体，然后通过X射线衍射得到分子的三维结构。
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。
为了避免盲目，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。
常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。
本章以介绍沉淀法为主。
1 沉淀法沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。
沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。
通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH 值、离子强度和极都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：⑴中盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。
⑶选择沉淀（热变沉淀和酸碱变沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变的杂蛋白。
⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
⑸有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法，主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。
1.1 中盐沉淀（盐析法）在溶液中加入中盐使生物大分子沉淀析出的过程称为"盐析"。
除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清。
分离纯化方法
分离纯化方法分离纯化方法是化学和生物学实验中非常重要的步骤，它可以帮助我们从混合物中提取出所需的物质，并使其纯度达到要求。
在实验室中，我们常常需要用到各种不同的分离纯化方法，下面将介绍几种常见的方法及其原理。
一、过滤法。
过滤法是一种常见且简单的分离纯化方法，通过不同孔径的滤膜或滤纸，可以将混合物中的固体颗粒或大分子物质分离出来。
这种方法适用于颗粒较大的混合物，操作简便，但不能用于分离溶液中的溶质。
二、结晶法。
结晶法是将溶液中的溶质通过结晶的方式分离出来，其原理是在适当的条件下，使溶质在溶剂中结晶沉淀出来，再通过过滤或离心等方法将其分离出来。
结晶法适用于固体溶解于液体中的情况，可以得到较高纯度的物质。
三、萃取法。
萃取法是利用两种不相溶的溶剂对混合物进行萃取，通过两种溶剂对不同成分的亲和力不同的特点，将混合物中的不同成分分离出来。
这种方法适用于有机物的提取和分离，可以得到较高纯度的溶质。
四、色谱法。
色谱法是一种高效的分离纯化方法，通过在固定相上的移动相的作用下，将混合物中的成分分离出来。
色谱法可以根据不同成分的在固定相上的吸附性能不同来实现分离，适用于各种化合物的分离和纯化。
五、电泳法。
电泳法是利用物质在电场中的迁移速度不同来实现分离的方法，适用于分离带有电荷的生物大分子，如蛋白质、核酸等。
电泳法可以根据物质的大小和电荷来实现不同成分的分离，是生物学实验中常用的分离纯化方法之一。
六、超滤法。
超滤法是利用超滤膜对混合物进行分离的方法，适用于分离分子量较大的溶质。
通过超滤膜的筛选作用，可以将溶质分离出来，得到较高纯度的物质。
以上介绍了几种常见的分离纯化方法及其原理，每种方法都有其适用的范围和特点，实验中需要根据具体情况选择合适的方法进行操作。
在实验过程中，还需要注意对操作条件的控制，以确保分离纯化的效果和纯度达到要求。
希望以上内容对大家有所帮助，谢谢阅读！。
生物大分子的纯化与鉴定技术
生物大分子的纯化与鉴定技术生物大分子是生命体内最基本的组成元素之一，包括蛋白质、核酸、多糖和脂质等。
它们的结构和功能对于生物体的发育、代谢、传递遗传信息等方方面面都有着非常重要的作用。
因此，对它们进行纯化和鉴定是生物学和生命科学研究中不可或缺的重要步骤。
一、蛋白质的纯化与鉴定技术1. 活性层析技术活性层析是从混合样品中纯化蛋白质的一种常用技术。
它基于蛋白质与特定配体之间的互相作用，利用这种相互作用把想要纯化的蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法不仅可以分离出单一种类的蛋白质，还可以根据蛋白质与配体的亲和性进行分层次纯化。
同时，利用不同的配体也能够分离出不同功能的酶，从而进一步扩大了对蛋白质的纯化范围。
2. 离子交换层析技术离子交换层析是一种基于蛋白质电荷的分离方法。
它利用固定在树脂表面上的离子，通过与蛋白质表面的离子相互作用，将蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法常常用于分离带有不同电荷的蛋白质，以及酸性和碱性细胞因子等物质。
3. 尺寸排除层析技术尺寸排除层析技术是一种基于蛋白质大小的分离方法。
它通过让大分子在固定相中的孔隙中滞留时间长，从而将大分子和小分子分离出来。
这种方法通常用于分离相对分子质量较大的蛋白质，如重组蛋白、抗体等。
4. 逆相高效液相色谱技术逆相高效液相色谱是一种基于蛋白质亲水性的分离方法。
它利用逆相柱的反相作用，将亲水性较小的蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法常常被用于提纯高表达体系中的蛋白质。
5. SDS-PAGE和Western Blotting技术SDS-PAGE是一种基于蛋白质质量和电荷的分离技术，通过在凝胶中加入SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂，可以使不同电荷和大小的蛋白质变得相同，从而进行准确的大小分离。
Western Blotting是一种检测蛋白质表达的方法，它利用特异性抗体将蛋白质分子分离出来，并将其转移到膜上，然后通过特异性抗体进一步检测目标蛋白质的表达量。
二、核酸的纯化与鉴定技术1. 常规离心技术常规离心技术是一种对复杂混合物进行分离和预纯化的方法，通过调整离心速度和离心时间，将不同大小和形状的细胞组分分离出来。
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化生物大分子的分离纯化是指对生物大分子，如蛋白质、核酸、多肽以及其他生物高分子的理化分离，以获得所需的高级别的纯度和净化标准的过程。
此外，功能地也可以应用于提取细胞和细胞组织特定的成分。
一般来说，分离纯化同表征大分子是以不同的方式实现的。
对于蛋白质，离心分离是一种常用的技术，这是一种使用立体速度分离不同物质的有效方法。
因为蛋白质它们有不同的表面电荷和大小，因此它们在加速度下受到不同的力，从而能够受到力，从而使不同的类型的蛋白质分离开来，产生分离纯化的产物。
此外，层析技术也可以用于对蛋白质进行分离纯化。
这个过程使用一种特定的介质，该介质被用于环境或两种环境之间的运动原理，通过独特的该介质通道，根据不同的冶金电荷，使得蛋白质分离到不同的有效产品中。
另外，还有其他许多特定技术可以用于生物大分子的分离纯化，比如电泳和柱层析技术。
这两种技术都是基于维持生物大分子的不同状态（流变或电泳）的原理，这种状态可以使不同的成分分离开来，从而获取高纯度的成分。
这两种技术的精确度取决于集成柱的大小和类型，以及实现特定的湿度和电荷的原理。
当讨论以上技术以外的技术时，分离和精制并不是只有蛋白质才有，尽管在蛋白质的技术中可能是最常见的，但核酸、多肽和其他有机分子也可以用这些技术进行分离和精制。
有几种不同的方法可以用于高级分离现象，其中一些是像柱层析、集成离子交换以及沉淀法，这些技术被广泛应用于生物大分子的分离和纯化。
总的来说，生物大分子的分离纯化是一种复杂的过程，需要仔细挑选一种或多种分离纯化技术，以实现所需的纯度要求的目的。
选择的技术必须适合特定的大分子和纯度要求，以实现最佳效果。
生物大分子的分离纯化与鉴定方法研究
生物大分子的分离纯化与鉴定方法研究生物大分子的分离纯化与鉴定是生物学研究中非常重要的一步。
合理选择适用的方法能够高效地分离纯化目标物质，可帮助研究者深入了解其结构和功能。
本文将介绍几种常用的生物大分子分离纯化与鉴定方法。
一、凝胶电泳法凝胶电泳法是一种常用的生物大分子分离方法。
通过电场的作用，将样品中的生物大分子按照尺寸或电荷迁移，从而实现分离。
常见的凝胶电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）等。
PAGE适用于蛋白质的分离纯化，而琼脂糖凝胶电泳适用于DNA和RNA的分离纯化。
二、超速离心法超速离心法是利用离心机产生高速转动，使样品中的物质根据其密度和大小差异分层离心的一种方法。
通过超速离心可以实现生物大分子的纯化，如蛋白质的沉淀、核酸的沉淀等。
超速离心法可以快速分离不同密度或不同分子量的生物大分子，得到纯度较高的目标物质。
三、气相色谱法（Gas chromatography）气相色谱法是一种常用的化合物分离和定量分析方法，常用于分离和鉴定挥发性或半挥发性有机化合物。
该方法主要通过样品在固定相与流动相共同作用下，依据不同的分配系数在色谱柱中发生分离。
气相色谱法广泛应用于有机化学、环境监测、食品安全等领域。
四、质谱法（Mass Spectrometry）质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可用于生物大分子的分离和鉴定。
它主要通过测量被测目标物质的质荷比，进而得到目标物质的质量信息和结构信息。
质谱法在生物学研究中被广泛应用于蛋白质组学、代谢组学等领域，可用于分析和鉴定复杂生物样品中的分子。
五、核磁共振法（Nuclear Magnetic Resonance）核磁共振法是一种常用的分析方法，可用于生物大分子的分离和鉴定。
它主要通过利用物质在外加磁场下核自旋进动特性的不同来获得物质的结构和性质信息。
核磁共振法在生物学研究中广泛应用于蛋白质结构研究、代谢组学等领域。
生物大分子的分离纯化和鉴定
利用溶解度差异 进行分离纯化
利用电荷性质进 行分离纯化
利用生物活性进 行分离纯化
分离纯化的过程
分离纯化的目的：去除杂质， 获得高纯度的生物大分子
分离纯化的方法：沉淀法、色 谱法、电泳法等
分离纯化的原理：利用生物大 分子在物理性质、化学性质等 方面的差异进行分离
分离纯化的流程：样品制备、 粗分离、精制纯化、产物检测
高效液相色谱法：随着技术的不断改进， 液相色谱法的分离效果和鉴定准确性得到 显著提高。
毛细管电泳技术：具有高效、快速、高分 辨率的特点，成为生物大分子分离纯化的 重要手段。
质谱技术：随着蛋白质组学研究的深入， 质谱技术在生物大分子鉴定中发挥着越来 越重要的作用。
生物信息学方法：通过计算机技术对生 物大分子数据进行处理和分析，为生物 大分子的分离纯化和鉴定提供了有力支 持。
03
生物大分子的鉴定
鉴定方法
化学分析法：通 过化学反应对生 物大分子的组成 和结构进行分析。
免疫分析法：利 用抗体与抗原的 特异性结合，对 生物大分子进行 检测和识别。
生物活性测定法： 通过检测生物大 分子对细胞或生 物体的活性影响， 确定其结构和功 能。
分子生物学方法： 利用分子杂交、 PCR等技术对生 物大分子进行基 因水平和蛋白质 水平的鉴定。
随着新材料的出现和应用，将会有更多高效、低成本的分离纯化材料应用 于实际操作中。
人工智能和机器学习等先进技术的应用，将有助于提高生物大分子分离纯 化和鉴定的自动化程度和智能化水平。
生物大分子分离纯化和鉴定技术将与生物信息学、系统生物学等学科交叉 融合，形成更加全面和深入的研究和应用领域。
05
生物大分子分离纯化和鉴定的应用领域
酶工程：通过分离 纯化技术获取酶， 用于酶催化反应研 究和酶制剂的生产 。
化学反应中的生物大分子的分离纯化技术及应用研究
化学反应中的生物大分子的分离纯化技术及应用研究随着人类对生命科学的研究与深入，生物大分子在生命科学领域中发挥着越来越重要的作用。
然而，想要从复杂的生物体系中获取纯净的生物大分子是一项相当艰巨的任务。
在化学反应中，为了获取纯净的产物，我们可以通过一系列的化学反应、溶剂萃取、蒸馏、结晶等步骤来进行分离纯化。
类似地，生物大分子也需要专业的分离纯化技术来获得单一、纯净的样品。
本文将重点介绍当前常用的生物大分子分离纯化技术及其应用研究。
一、凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）也称为分子筛层析法，是其中的一种分离技术，是利用分子筛过滤作用，通过大小分离生物大分子的方法。
也就是说，当一个混合物在溶液中进行层析时，它们将按大小顺序逐渐与凝胶内的微孔隔离出来。
而较大的生物大分子将无法通过凝胶微孔，而较小的物质则可随着溶液进一步深入凝胶内部，最终通过洗脱。
凝胶过滤层析法的主要优点是操作简单，具有较好的纯化效果。
它特别适用于大分子的纯化，例如酶、蛋白质、多肽、高分子以及其它具有不同分子量的物质混合物的分离。
凝胶过滤层析法被广泛应用于生物学、有机化学、生物制药等领域。
二、离子交换层析法离子交换层析法（Ion-exchange chromatography），是指利用固定正、负离子的功能基团，与可带电荷的分子间的相互作用力，实现对样品分离纯化的技术。
离子交换层析法的选择与离子交换柱的理化性质、样品离子性质和操作条件有关。
离子交换层析法的主要优点是它是一种高效、简便、快速并且基本上不损害生物大分子的分离纯化方法。
在生物大分子的纯化过程中，如果杂质物质与目标物质都带有电荷，离子交换层析是非常好的选择。
离子交换层析可以用于酸性、碱性、中等等多种环境下的分离纯化。
三、膜过滤分离技术膜过滤技术（Membrane Filtration）是指利用膜的结构及其物理化学理性，在分离过程中分离溶液体系。
生物大分子的分离和纯化技术
生物大分子的分离和纯化技术生物大分子是指具有较大分子量的生物分子，如蛋白质、核酸、多糖等。
要研究这些生物大分子的结构和功能，需要对它们进行分离和纯化。
生物大分子的分离和纯化技术是生物学和生物工程学中的重要内容，它们的发展和应用使得我们能够更深入地了解生命的奥秘，同时也推动了医药、农业、工业等领域的发展。
生物大分子的分离和纯化需要经过多个步骤，这些步骤通常包括细胞破碎、分子分离、分子鉴定等。
其中，分子分离是最基本、最关键的步骤之一，它可以使得目标分子从复杂混合物中被分离出来，并得到相对纯度较高的产物。
目前，生物大分子的分离和纯化技术包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、尺寸排除层析、逆向相色谱层析和高效液相色谱层析等方法。
凝胶过滤层析是一种基于分子尺寸差异的分离方法。
在这种方法中，样品被加入到一列凝胶柱中，较大的分子无法穿过凝胶孔隙，而较小的分子则可以顺着凝胶孔隙通过。
因此，随着溶液通过凝胶柱，不同大小的分子会被分离出来。
这种方法适用于大小分子差异较大的生物大分子的分离。
离子交换层析是基于分子电荷的分离方法。
在这种方法中，一种带有正电荷或负电荷的树脂被用来吸附目标分子，通过控制溶液的pH和离子强度等参数，可以使得目标分子从树脂上逐渐被洗下来。
这种方法适用于分子之间的电荷差异较大的生物大分子的分离，如蛋白质。
亲和层析是一种基于分子亲和性的分离方法。
在这种方法中，一种特殊的树脂被用来吸附具有特定结构或性质的目标分子。
例如，可以将某种亲合剂固定在树脂上，然后用于吸附与该亲合剂有特异结合关系的目标分子。
这种方法适用于具有高度特异性活性的生物大分子的纯化。
尺寸排除层析是一种基于分子形状的分离方法。
在这种方法中，一种具有多孔性的材料被用来吸附目标分子，具有大分子尺寸和形状的目标分子沿着孔隙穿过，而具有小分子尺寸的分子则通过孔隙空隙。
这种方法常用于分离蛋白质和糖类等生物大分子。
逆向相色谱层析是一种基于亲水性的分离方法。
生物大分子的分离纯化技术
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：
1. 确定要制备的生物大分子的目的和要求。 2. 建立可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的 关键。
3. 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的 产物的物理化学性质。 4. 生物材料的破碎和预处理。
5. 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。
6. 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要 求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或 HPLC和毛细管电泳都是一个峰。
分析测定的方法主要有两类：
即生物学和物理、化学的测定方法。 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱 法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度 法）、电泳法、以及核磁共振等。
生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含 量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪 法等；
实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更 加快速、简便。
抽提有效成分的影响因子
• 在抽提阶段，pH值、金属离子、溶剂的浓度和极
性等因子，可明显影响有效成分的性质和数量。 因此选择抽提液必须考虑这些因素。
(1)溶剂的极性和离子强度：
有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中 稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。 例如提取刀豆球蛋白A时，用0.15mol/L甚至更高浓度 的NaCl溶液，都可使其从刀豆粉中溶解出来，稳定存 在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则需用0.2 mol/L蔗糖 水溶液。 一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关（相似 相溶原理）；离子强度通过影响溶质的带电性也影响 溶质的溶解度。 降低极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜， 二甲基甲酰氨。
三 、 生物大分子的提取（抽提）
（一）抽提的含义 “抽提”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的 细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地 释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不 丢失生物活性的过程。 影响提取的因素主要有： 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； 由固相扩散到液相的难易； 溶剂的pH值和提取时间等。
第09章 生物大分子的分离与纯化技术
结果：疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟； 结果：疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟；疏水性小的蛋 白质就容易被洗脱。 白质就容易被洗脱。
9.2.2 色谱条件
链烃作为配基（键合在固体基质上） ①固定相：常用C4 ～ C8链烃作为配基（键合在固体基质上） 固定相：常用 为填料。孔径25～ 为填料。孔径 ～50nm。 。 流动相： ②流动相： 水溶性有机溶剂（ 液 甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃） 水溶性有机溶剂（B液） （甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃） 洗脱能力增大 ＋水（A液） 液 强酸（三氟醋酸、甲酸、 ＋强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸 ） 加酸作用： 加酸作用： ∵－SiOH == －SiO- ＋ H+ • 蛋白质易与 蛋白质易与—SiO- 结合很难洗脱，加酸抑制上述平衡向右 结合很难洗脱， 离解。 离解。 • 减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。 减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。 ③温度：常温 温度：
9.1.1 生物大分子分离纯化的特殊性
1、要求产品保持其生物活性，也就是说要避免不可逆结构 、要求产品保持其生物活性， 变化发 生。 2、多孔填料必须使用大 孔径基质。 、 孔径基质。 3、生物大分子的色谱特性常不同于有机小分子。所以在选 、生物大分子的色谱特性常不同于有机小分子。 条件。 择色谱条件时不能随便套用小分子的 条件。
OH OCH2CH3
蛋 白 质
CH3
Ph
NH2 Ph COOH
OH 蛋白质疏水基团分布示意图
配基和蛋白质分子之间的吸附推动力和样品组分的洗脱机理 （即：溶质在色谱中的保留行为）： 溶质在色谱中的保留行为）： • 用“疏溶剂化理论”：蛋白质与配基的结合是由于溶质分 疏溶剂化理论” 子有一个减少其与水接触的非极性表面的倾向， 子有一个减少其与水接触的非极性表面的倾向，它们在盐 水溶液中，两个非极性的表面趋向于避开水相而互相接触。 水溶液中，两个非极性的表面趋向于避开水相而互相接触。 溶质和疏水配基的结合是伴随着它们非极性表面暴露在水 中的面积的多少而进行的。（即蛋白质在盐水体系中，有 中的面积的多少而进行的。 即蛋白质在盐水体系中， 一倾向产生：避开水相而吸附在固定相上。 一倾向产生：避开水相而吸附在固定相上。∵生物物质界 面自由能比水低，与表面自由能低的固定相产生亲合力） 面自由能比水低，与表面自由能低的固定相产生亲合力） 讨论
生物大分子的分离纯化及其应用
传统蛋白质的分离方法有吸附沉淀、溶媒、萃 取、离子交换法等，这些工艺往往繁杂，提取时 间长，消耗大量原料，能耗高。
随着生物技术的发展和对各种蛋白质结构和功 能研究的深入，对蛋白质分离检测研究也有了迅 速发展，出现了许多高效的分离纯化技术和手段， 主要包括膜分离、高效液相色谱，毛细管电泳、 分子印迹技术及联用技术。2Fra bibliotek21/6/20
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（3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的 步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经过几十 步的操作才能达到所需纯度；
（4）分离纯化过程中要保证目标产物的活性。
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蛋白质的分离纯化
《生理学》提及蛋白质的功能： (1)构成组织与修补组织； (2)构成酶和某些激素的成分； (3)增强机体抵抗力，构成抗体； (4)调节渗透压 ； (5)供给热能。
应用强大的离心力，使物质因沉降速度不同而进 行分离的方法叫离心技术 。 常用方法：差速离心，密度梯度离心和等密度离心。
1.1差速离心
注：在沉离降心速管度中相进差行越，大样越品能在得离到心良时好受分离离心。作只用能移是向 一离种心粗管分底技部术。，多次重复操作是可以改善回收纯度 不的同。物质其大小、比重和形状不同而沉降速度不同。
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蛋白质具有广泛的功能性质，每一种性质都会 给食品及其加工过程带来特定的效果。具有生理活 性的蛋白质类物质在维持现代人类健康方面已必不 可少，在医疗和食品领域已逐渐得到应用。
如可将功能蛋白质如乳清蛋白、蛋清蛋白、大 豆蛋白等添加到食品中制得各种功能性食品。
正是由于蛋白质与人类生活密切相关，所以对 其质量和纯度要求也越来越高。
物质按其沉降速率的不同而沉降，到最后按各自的 比重平衡停留在相应密度的溶剂中。
生物大分子的分离纯化和鉴定
目前，电泳（electrophoresis）方法大致可分为 三类：显微电泳、自由界面电泳（没有支持物）及区带 电泳。以区带电泳应用比较广泛。显微电泳是用显微镜 直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为的过程。目前已用 于研究膜结构及癌细胞和正常细胞的差异性等方面。
自由界面电泳是被分离的溶质颗粒经电泳后与缓冲 溶液之间形成界面的电泳过程。利用适当的光学系统可 观察到界面的移动。在电泳过程中，每个移动界面 （峰）相当于某一特定的蛋白质。如：用于血浆蛋白成 分的电泳。
（1）吸附层析： 利用吸附剂（固定相）表面对不同组分物理吸附性能的差异
而达到分离的目的。 如 硅胶G薄层层析。 （2）分配层析：
利用各组分在给定的两相中不同的分配系数而得到分离。如 纸层析。 （3）离子交换层析：
利用离子交换剂与试样中不同离子结合吸引力的差异大小不 同而得到分离。常用的交换剂有CM—纤维素（弱酸型阳离子交
到 分级分离的目的.
盐析后必须脱盐。 脱盐最常见的方法是透析法，也可以用凝胶层析（葡聚糖凝 胶SephadexG25脱盐）、超过滤技术脱盐。盐析通常与等电点 沉 淀法相结合使用。脱盐是否彻底，要经常进行检查。如除去 (NH4)2SO4可用10%BaCl2检查；除去NaCl可用10%AgNO3检
3、有机溶剂分级法
电泳技术
电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反 的电极移动的现象。 原理：
在一定PH条件下，不同的物质具有不同的等电 点就带不同性质的电荷，因而在电场中它们的移动方 向和移动速度也不同，可使它们分离。
颗粒在电场中移动的速度主要决定于颗粒带电荷 的量，同时受颗粒形状和颗粒相对分子质量的大小的 影响。
而被排阻在凝胶颗粒之外，比“网眼”小的分子则进入凝 胶
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粗蛋白
纯 化 蛋 白
活性的检验
• 根据不同的蛋白酶的不同结构，有相对的 药品进行检验，造成颜色反应等。 • 如谷丙转氨酶加丙氨酸和a-酮戊二酸，生成 丙酮酸和谷氨酸，再加显色剂2，4-二硝基 苯肼生成丙酮酸二硝基苯肼，用比色法， 可计算其活性。
纯化蛋白 标准蛋白
SDS凝胶 电泳 根据与标准蛋 白的比对鉴定 出蛋白
3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶 和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞 壁分解。 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜 溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
生物大分子的提取
加磷酸缓冲溶液、再加硫酸铵饱和溶液。要在搅拌下缓 慢匀少量多次地加入尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造 成不应有的蛋白质沉淀。
在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离。
转移
离心
匀浆液+ 药品混匀
粗蛋白
等电点沉淀技术 许多蛋白质在其等电点（pI）处净电荷为零， 溶解 度最低，可以沉淀出来。故选用适当 的缓冲液，调节pH，可将目的物以沉淀状 态分离，再重新溶于适当的缓冲液，以供 进一步纯 可尝试调配pi=6.2 ，沉淀所需蛋白。
分离纯化
• 刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品， 含有许多杂质，必须进一步分离纯化。分 离提纯各种生物大分子，主要根据各种物 质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力 大小等差异，选用有机溶剂沉淀，等电点 沉淀，盐析，层析，电泳，超离心，吸附， 结晶等方法
分离 纯化
刚提取得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多 杂质，必须进一步分离纯化。分离提纯各种生物大分 子，主要根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、 亲和力大小等差异，选用有机溶剂沉淀，等电点沉淀， 盐析，层析，电泳，超离心，吸附，结晶等方法。
电荷性质的差异
离子交换层析法 凝胶过滤法
电泳法
分子大小形状差异
超滤法 离心法
透析法 沉 淀 法 盐析 有机溶剂沉淀 选择性沉淀
溶解度差异
分配层析 萃取 结晶
产品处理
• 浓缩、干燥
• 经过分离、纯化得到的提取液有时很稀，体积较 大，需要采用蒸馏法、冰冻法、吸收法、超滤法 等，去除水分而浓缩、干燥。
• 保存
一、生物大分子的分离与纯化技术
二、肝酶提取
引言
在自然科学，尤其是生命科学高度发展 的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的 结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课 题，而生物大分子结构与功能的研究，必须 首先解决生物大分子的制备问题，有能够达 到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题， 结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大 分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困 难的工作。
蛋白的纯化
• 层析： • 离子交换层析：定相是具有固定电荷的离子交换剂， 动相是具有不同PH值和离子强度的溶液 • 凝胶层析：又称凝胶过滤、分子筛层析、凝胶渗透层 析等。主要是根据多孔凝胶对不同大小分子的排阻效 应不同而进行分离的。ห้องสมุดไป่ตู้• 吸附层析：主要根据物质对活性固体表面吸附亲和力 的差异来分离。 • 分配层析：是根据素质在定相中溶解度的差异或在 定相和动相中溶解度的差异来进行分离的 • 亲和层析：是根据生物大分子的生物特异性吸附来进 行分离的。
(3)化学与生物化学方法：
1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度 下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等） 的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。 2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀 盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细 胞膜胀破释放出细胞内含物。
移 入 匀 浆 器
蛋白质的粗提
原 理 中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面的 双电层和水膜，从而使蛋白质从溶液中 凝聚沉淀析出。（但沉淀不同的蛋白质 所需盐类的浓度不同。例如，50％饱和 的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而 33％饱和的硫酸铵则使γ-球蛋白沉淀。） 因此，可根据所要分离的蛋白质，选择 不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。
结构的蛋白质中具有三级结构的球蛋白
• 结合酶：分蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)和辅助因子
(cofactor)，辅助因子中含金属离子、小分子化合物
• PI：等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子
和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性， 此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点。
“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使 被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状 态不丢失生物活性的过程。 影响提取的因素主要有： 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；
由固相扩散到液相的难易；
溶剂的pH值和提取时间等。 通常：极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；
取动物肝脏组织
凝胶电泳鉴定提取纯度
制作组织浆液
实验主要流程
活性的检验
所需蛋白的粗提
蛋白的纯化
取动物肝脏组织
• 材料选择。选取新鲜的，饥饿24小时的动 物的肝脏，生理盐水多次洗涤，低温保存。
制作组织浆液
取新鲜动物肝脏剪碎 冰放进培养皿中
为减低研磨或匀浆过程中发热，所用 器皿和溶液需要预冷
匀浆液
过滤
生物材料选择
制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源 无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。 选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本 低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎 后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先 破碎细胞。 植物要先去壳、除脂。 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。 生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度 冷冻保存。
什么是生物大分子？
生物体内结构具有一定的规律 性，由基本结构单位按一定顺序和 方式连接而形成的多聚体称为生物 大分子。其分子量一般大于10000。 有：蛋白质(包括酶)、多聚糖和核 酸类化合物等。
生物大分子分离纯化的特殊性
• ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种 乃至几千种化合物。 • ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微， 分离纯化的步骤繁多，流程长。 • ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境 时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活， 就是生物大分子提取制备最困难之处。 • ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的， 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种 组成的综合影响，很难准确估计和判断。
(2)物理法：
1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然 后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于 细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀 破碎。 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁 和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。 3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在 1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一 个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用 此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却， 如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。
碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；
温度升高，溶解度加大； 远离等电点的pH值，溶解度增加。
提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。
⑴ 水溶液提取：蛋白质和酶的提取一般以水 溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳 定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常 用的溶剂。 ⑵ 有机溶剂提取：一些和脂类结合比较牢固 或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶 于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比 例的有机溶剂提取。
• 保存应在低温避光环境下，有时还需加入防腐剂 或稳定剂，防止生物大分子变性失活。
肝酶分离纯化与鉴定
• 设计从动物肝组织中分离、提取、纯 化、和鉴定一种酶（该酶由不同的亚基组 成，为结合酶，pI=6.2）的技术路线，并说 明试验各步骤的原理
相关问题
• 亚基：组成蛋白质四级结构最小的共价单位，是指四级
组织细胞的破碎
不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破 碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞 膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤 维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方 法。
(1)机械法：
1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少 量石英砂研磨或匀浆。 2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常 可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用 10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分 散器)将组织的细胞打碎。
设计思路
• 前期准备 初级提取分离 精细分离纯化 生物材料的选择 及预处理 组织与细胞破碎 纯度鉴定
产物处理
前期准备
一、明确目的和要求 二、了解的生物大分子的物学性质
1)在水和各种有机溶剂中的溶解性。 2)在不同温度、pH 值和各种缓冲液中生物大分子的 稳定性 3)固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。 4)各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电 的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、 树脂等填料中的分配系数 5)其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性 和对各种化学试剂的稳定性。 6)对其他生物分子的特殊亲和力。