生物大分子分离纯化的方法01
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）2. 透析自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。
在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。
通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。
保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。
透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。
商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。
为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。
可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。
实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。
使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。
生物样品中生物大分子的分离纯化
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（六） 生物大分子的抽提
✓ “抽提”是将经过预处理或破碎了的细胞或组织置于一 定条件下和溶剂中，使被提取的生物大分子以溶解状态 充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不 丢失生物活性的过程。
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组织与细胞破碎
1、机械破碎法
✓ 研磨：这种方法比较柔和，适宜实验室使用； ✓ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法。利用高速
旋转的叶片产生的剪切力将组织细胞破碎。处理材料量较大 时，经常使用。 ✓ 匀浆器：匀浆器用来破碎那些比较柔软，易于分散的组织细 胞。科研上若材料处理量少，可使用匀浆器。
生物大分子的 分离纯化和鉴定
生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类分子， 是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命 的基本单位。
包括
小分子（如脂类、激素、维生素等） 生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）
什么是生物大分子？
生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分 的各种分子量达到上万或更多的有机分子，结构具 有一定的规律性，大多是由基本结构单位按一定顺 序和方式连接而形成的多聚体。
常见的生物大分子包括蛋白质(包括酶)、核酸、 多聚糖等。
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生物大分子分离纯化的特殊性
1. 生物材料的组成复杂，种类极多；分离纯化方法千 差万别，没有一种标准方法可通用于各种生物大 分子的分离制备。
2. 许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离 纯化的步骤多，流程长。
生物大分子分离与纯化技术
生物大分子分离与纯化技术是生物学、生物医学和生物工程领域中非常重要的技术之一。
它可以用于提取和分离生物大分子，从而达到纯化的目的。
本文将着重探讨的原理、方法和应用。
一、原理在生物细胞中，不同的生物大分子有着不同的形态、结构和性质。
为了分离和纯化这些生物大分子，需要利用它们的理化性质差异。
例如，蛋白质可以通过电泳分离，根据电荷、分子量等差异分离出不同的成分；核酸则可以通过浓度梯度离心分离，根据密度差异分离出单独的成分。
还有一些生物大分子，如多肽、糖类、脂质等，可以通过其他特殊方法分离。
二、方法1. 柱层析法柱层析法是中常用的重要方法之一。
它利用固定相（柱子中的树脂）和流动相（洗脱缓冲液）之间的相互作用来分离和纯化生物大分子。
根据固定相和洗脱缓冲液的不同性质，可以选择不同的柱层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
2. 电泳法电泳法是基于生物大分子的电荷差异和分子量差异的原理，将不同的生物大分子分离并捕获的技术。
根据电泳介质、运行方式以及电场的不同条件，可以选择不同的电泳方法，如蛋白质电泳、DNA电泳、脂质电泳等。
3. 超滤法超滤法是利用微孔过滤膜的不同截留分子量，将生物大分子按照大小分离纯化的技术。
超滤法分为正压式和负压式，正压式是通过液体压力将生物大分子向膜孔内压缩，从而分离得到小分子；负压式是通过负压将大分子向膜孔内吸附，难以通过的是大分子。
4. 溶剂萃取法溶剂萃取法是将生物大分子从混合物中溶解到特定的有机溶剂中，然后通过反萃取、扩散等工艺，使它在不同相中转移、分离和纯化的方法。
5. 其他方法生物大分子的分离和纯化方法还有一些其他方法，例如磁性珠法、浓缩法、冷冻干燥法等。
三、应用在生物医学、生物工程、食品工业、环境保护和新能源开发等领域中有广泛的应用。
具体来说，1. 生物医学领域生物医学领域的应用主要是分离和纯化蛋白质和多肽类物质，如酶、抗体、激素、血浆蛋白等。
这些物质可以作为药物、诊断试剂、生物治疗的原材料等。
第七章 生物大分子的色谱分离和纯化
吸附色谱分离
是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂） 是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于 固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。 固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。 吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、 吸附剂有氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙、 有氧化铝 氧化钛、氢氧化锌凝胶等。 氧化钛、氢氧化锌凝胶等。 新的吸附色谱技术有： 新的吸附色谱技术有：
色谱分离的分类
1. 按分离机理不同分类
吸附色谱分离（ Chromatography，AC） 吸附色谱分离（Adsorption Chromatography，AC） 分配色谱（ Chromatography，DC） 分配色谱（Distribution Chromatography，DC） 离子交换色谱（ Chromatography，IEC） 离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography，IEC） 凝胶色谱（ Chromatography，GC） 凝胶色谱（Gel Chromatography，GC） 亲合色谱（ Chromatography，AFC） 亲合色谱（Affinity Chromatography，AFC）
纯化蛋白的设备和生产成本相当昂贵，以致在 基因工程生产治疗蛋白的生产总成本中，分离和 纯化要占70%～90%。 色谱所分离出的杂蛋白的种类和数量要比传统 的方法多的多，这类蛋白可能有热源、病毒、 DNA和RNA、不准确转化的蛋白、糖化或氧化 产物、聚集体和与目标产品有类似构象的异构体 等，以及某些蛋白的复性工序所带入的新杂质。
凝胶色谱
以凝胶为固定相， 以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子 大小不同而进行分离的色谱技术， 大小不同而进行分离的色谱技术，又称为分子 筛色谱（ Chromatography， 筛色谱（Molecular Sieve Chromatography， MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（ ）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱 MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC）。 Chromatography，SEC）
生物大分子分离纯化技术(159页)
亲和色谱法由于具有极高的生物特异性，分离目的物受到理 化性质相似的杂质干扰极少，能从比较复杂的组织抽提液或细菌 发酵液中一步提取分离出所需的物质，提纯倍数可达一百倍以上 。
早期分离提纯的方法，选择的原则一般是从低分辨能力到高分 辨能力，而且负荷量较大为合适。但随着许多新技术的建立，一 个特异性方法其分辨能力越高，便意味着提纯步骤的简化，提纯 步骤的减少，回收率越高，具有生理活性物质变性的危险性就越 少。
制备物均一性的鉴定
对一个新分离的物质是否纯，常用“均一性 ”表示，均一性即指所获得的制备物只具有一 种完全相同的成分。蛋白质均一性常用的几种 鉴定方法：
1.溶解度法： 2.电泳均一性的测定法： 3.高速离心沉淀法：
生物大分子的纯化和分析方法
生物大分子的纯化和分析方法生物大分子是生命体系中最基本的组成部分，其中包括蛋白质、核酸、多糖等。
纯化和分析这些生物大分子是生物学研究的重要内容之一。
本文将介绍常用的生物大分子纯化和分析方法。
一、蛋白质的纯化方法1.盐析法盐析法是最常用的蛋白质分离方法之一。
通过加入盐类来改变水的离子强度以影响蛋白质的溶解度，从而将蛋白质与其他分子分离出来。
这种方法适用于分子量较大的蛋白质，对于小分子蛋白质效果不佳。
2.层析法层析法依据化学性质和大小形状的差异来分离蛋白质。
常用的层析法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析和逆相层析等。
3.电泳法电泳法是将蛋白质在电场中移动分离的方法，常用的电泳方式有SDS-PAGE和2D-PAGE。
二、核酸的纯化方法1.硅胶凝胶柱层析法硅胶凝胶柱层析法通过核酸与硅胶上化学键接触而吸附在柱胶上，不同大小的核酸在这些化学键上停留的时间不同，从而实现核酸的分离。
2.等电点电泳法等电点电泳法根据核酸的等电点，将核酸在特定电位下移动，分离出不同等电点的核酸，适用于分离等电点差异较大的核酸。
3.差示电泳法差示电泳法利用核酸在电场下移动速度的不同，将不同大小、结构和电性的核酸分离。
三、多糖的纯化方法1.醇沉法醇沉法是将多糖溶液中的酒精浓度逐渐提高，使得多糖从水溶解态转为沉淀态的方法。
2.凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法利用多糖分子的差异性，在凝胶中筛选分子大小相似的多糖物质。
3.亲和层析法亲和层析法是一种采用选择性结合的谷蛋白或其他多糖结合剂来分离多糖的方法。
结论生物大分子的纯化和分析方法多种多样，常用的方法有盐析法、层析法、电泳法、醇沉法、差示电泳法等。
选择合适的方法能够有效地纯化和分离目标大分子，为生物学研究提供了重要的帮助。
生物大分子的分离纯化技术(共34张PPT)
离心(3)
最大速度方法：
移动界面（Moving Boundary)超 速离心法
移动区带(Moving Zone)超速离心法
等密度方法(Isodensity)：
样品的类型、采集与保存 酶样品的准备
亲和色谱
琼脂糖的溴化氰活化法
6-氨基己酸－琼脂糖和,1,6-己二胺－琼脂糖
层析柱短 配基－与大分子间以氢键离子键或疏水相互作用结合
透析 微过滤 盐析 冷冻干燥 离心
透析
透析膜:
材料: 火棉胶(Collodion), 玻璃纸(Cellophane), 纤维素 (Cellulose)
纤维透析管的处理: 1%乙酸水溶液 1h, 碱性EDTA (1% Na2CO3, 1 mM EDTA) 煮1h, 纯水清洗,保存.
透析液:
离心(2)
(Relative centrifugal force)：
F=mω2r;
Fcf=(1.119×10-5)(rpm)2r
F摩擦=fv
F净=(Mp-Ms)ω2r-fv
沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒的沉降速度 ）， 蛋白质\核酸\病毒等的沉降系数介于1×10-13到200×10-13秒的
紫外-可见吸收法 荧光检测法
电化学检测法
质谱法
高效毛细管电泳
电泳淌度 电渗流
淌度和迁移时间 分离效率 分离度
高效毛细管电泳分离模式
毛细管区带电泳
以1×10-13s 为一个单位,称为斯韦德贝格单位(Svedberg)，用S(大写)表示.
（Capillary Zone Electrophoresis, CZE) 纤维透析管的处理: 1%乙酸水溶液 1h, 碱性EDTA (1% Na2CO3, 1 mM EDTA) 煮1h, 纯水清洗,保存.
生物分子分离纯化的原理与技术路线
生物分子分离纯化的原理与技术路线生物分子分离纯化是现代生物科学研究的重要内容之一，它在生命科学、医学、化学、农业等许多领域中发挥着重要应用。
生物分子分离纯化是指将某种复杂生物体系中的生物分子依据其特定的物理化学性质从该体系中分离出来，进而纯化的过程。
这一过程需要基于分子的特性，结合各种理化技术手段，构建出相应的技术路线，进而实现对生物分子的高效分离纯化。
本文将详细介绍生物分子分离纯化的原理与技术路线。
一、生物分子的特性生物分子是一类由生物体内合成而成的，拥有特定结构的分子，包括蛋白质、核酸、多糖、脂质等，在代谢过程中发挥着极其复杂的生物功能。
不同的生物分子具有不同的物理化学性质，因此对于不同类型的生物分子，选择不同的分离策略与纯化方法是很有必要的。
二、生物分子分离的原理常用的生物分子分离方法包括离子交换、凝胶过滤、亲和层析、逆流层析、氢氧化铝纤维素膜过滤、高效液相色谱等。
下面将对其中几种方法进行详细介绍。
1、离子交换法离子交换法是利用载有不同离子电荷的基质，将带有相反电荷的生物大分子吸附并固定。
离子交换基质的离子交换能力取决于其离子化程度、离子交换基团的种类、柱子pH值等。
因此，在进行离子交换分离时，应综合考虑这些因素，进而选择最合适的离子交换柱。
常用的离子交换柱包括阴离子交换柱、阳离子交换柱和混合离子交换柱。
离子交换法分离出来的生物分子具有较高的纯度，但往往需要进行多次重复柱层析才能达到理想纯度。
2、凝胶过滤法凝胶过滤是最常见也是最简单的生物分子分离方法，它是利用凝胶颗粒的孔隙在生物分子样品中分子量大分子分离的方法。
大分子将通过直接流过凝胶颗粒填充层析柱时逐渐逼近凝胶颗粒的空隙，并逐渐进行“筛分”，从而被分离并纯化。
但凝胶颗粒的孔隙大小、分子量很容易受温度、pH值、离子强度等因素的影响，因此凝胶过滤应被认为是一种初步纯化方法。
3、亲和层析法亲和层析法是将含有亲和剂的固定相与生物样品进行反应，从而将特定的生物分子与固定相柱壁产生结合。
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化生物大分子的分离纯化是指对生物大分子，如蛋白质、核酸、多肽以及其他生物高分子的理化分离，以获得所需的高级别的纯度和净化标准的过程。
此外，功能地也可以应用于提取细胞和细胞组织特定的成分。
一般来说，分离纯化同表征大分子是以不同的方式实现的。
对于蛋白质，离心分离是一种常用的技术，这是一种使用立体速度分离不同物质的有效方法。
因为蛋白质它们有不同的表面电荷和大小，因此它们在加速度下受到不同的力，从而能够受到力，从而使不同的类型的蛋白质分离开来，产生分离纯化的产物。
此外，层析技术也可以用于对蛋白质进行分离纯化。
这个过程使用一种特定的介质，该介质被用于环境或两种环境之间的运动原理，通过独特的该介质通道，根据不同的冶金电荷，使得蛋白质分离到不同的有效产品中。
另外，还有其他许多特定技术可以用于生物大分子的分离纯化，比如电泳和柱层析技术。
这两种技术都是基于维持生物大分子的不同状态（流变或电泳）的原理，这种状态可以使不同的成分分离开来，从而获取高纯度的成分。
这两种技术的精确度取决于集成柱的大小和类型，以及实现特定的湿度和电荷的原理。
当讨论以上技术以外的技术时，分离和精制并不是只有蛋白质才有，尽管在蛋白质的技术中可能是最常见的，但核酸、多肽和其他有机分子也可以用这些技术进行分离和精制。
有几种不同的方法可以用于高级分离现象，其中一些是像柱层析、集成离子交换以及沉淀法，这些技术被广泛应用于生物大分子的分离和纯化。
总的来说，生物大分子的分离纯化是一种复杂的过程，需要仔细挑选一种或多种分离纯化技术，以实现所需的纯度要求的目的。
选择的技术必须适合特定的大分子和纯度要求，以实现最佳效果。
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法引言亲和层析是一种常用的分离纯化生物大分子的方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。
本文将介绍亲和层析的基本原理和常用方法。
一、亲和层析的基本原理亲和层析是利用化学结合的特异性，将目标分子与固定在层析柱上的亲和配体结合，从而实现目标分子的分离纯化。
其基本原理如下：1. 亲和配体选择性结合目标分子：亲和配体是一种具有特异性结合目标分子的生物大分子或化学物质。
通过选择合适的亲和配体，可以实现对目标分子的选择性结合。
2. 层析柱固定亲和配体：亲和配体通常通过共价键或非共价键的方法固定在层析柱的填料上。
固定亲和配体后，层析柱具有了对目标分子的特异性结合能力。
3. 样品溶液通过层析柱：样品溶液中含有目标分子和其他杂质分子。
当样品溶液通过层析柱时，目标分子会与层析柱上的亲和配体结合，而杂质分子则流经层析柱。
4. 目标分子的洗脱和回收：通过改变洗脱缓冲液的条件，可以使目标分子与亲和配体解离，从而实现目标分子的洗脱和回收。
二、常用的亲和层析方法亲和层析方法根据亲和配体的性质和结合方式的不同，可以分为多种不同的方法。
以下是几种常用的亲和层析方法：1. 金属离子亲和层析：利用金属离子与亲和配体之间的配位作用，实现对目标分子的选择性结合。
常用的金属离子包括Ni2+、Cu2+和Zn2+等。
2. 免疫亲和层析：利用抗体与抗原之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
免疫亲和层析广泛应用于生物医学领域，用于分离纯化抗体和抗原。
3. 亲和色谱层析：利用染料、受体或配体等分子与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
常用的亲和色谱层析方法有离子交换层析、亲和柱层析等。
4. 亲和吸附层析：利用亲和吸附剂与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
常用的亲和吸附层析方法有亲和蛋白A/G层析、亲和葡萄糖层析等。
三、亲和层析的应用领域亲和层析作为一种常用的分离纯化方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。
生物大分子的分离纯化与鉴定方法研究
生物大分子的分离纯化与鉴定方法研究生物大分子的分离纯化与鉴定是生物学研究中非常重要的一步。
合理选择适用的方法能够高效地分离纯化目标物质，可帮助研究者深入了解其结构和功能。
本文将介绍几种常用的生物大分子分离纯化与鉴定方法。
一、凝胶电泳法凝胶电泳法是一种常用的生物大分子分离方法。
通过电场的作用，将样品中的生物大分子按照尺寸或电荷迁移，从而实现分离。
常见的凝胶电泳方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）等。
PAGE适用于蛋白质的分离纯化，而琼脂糖凝胶电泳适用于DNA和RNA的分离纯化。
二、超速离心法超速离心法是利用离心机产生高速转动，使样品中的物质根据其密度和大小差异分层离心的一种方法。
通过超速离心可以实现生物大分子的纯化，如蛋白质的沉淀、核酸的沉淀等。
超速离心法可以快速分离不同密度或不同分子量的生物大分子，得到纯度较高的目标物质。
三、气相色谱法（Gas chromatography）气相色谱法是一种常用的化合物分离和定量分析方法，常用于分离和鉴定挥发性或半挥发性有机化合物。
该方法主要通过样品在固定相与流动相共同作用下，依据不同的分配系数在色谱柱中发生分离。
气相色谱法广泛应用于有机化学、环境监测、食品安全等领域。
四、质谱法（Mass Spectrometry）质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可用于生物大分子的分离和鉴定。
它主要通过测量被测目标物质的质荷比，进而得到目标物质的质量信息和结构信息。
质谱法在生物学研究中被广泛应用于蛋白质组学、代谢组学等领域，可用于分析和鉴定复杂生物样品中的分子。
五、核磁共振法（Nuclear Magnetic Resonance）核磁共振法是一种常用的分析方法，可用于生物大分子的分离和鉴定。
它主要通过利用物质在外加磁场下核自旋进动特性的不同来获得物质的结构和性质信息。
核磁共振法在生物学研究中广泛应用于蛋白质结构研究、代谢组学等领域。
生物大分子的分离纯化和鉴定
利用溶解度差异 进行分离纯化
利用电荷性质进 行分离纯化
利用生物活性进 行分离纯化
分离纯化的过程
分离纯化的目的：去除杂质， 获得高纯度的生物大分子
分离纯化的方法：沉淀法、色 谱法、电泳法等
分离纯化的原理：利用生物大 分子在物理性质、化学性质等 方面的差异进行分离
分离纯化的流程：样品制备、 粗分离、精制纯化、产物检测
高效液相色谱法：随着技术的不断改进， 液相色谱法的分离效果和鉴定准确性得到 显著提高。
毛细管电泳技术：具有高效、快速、高分 辨率的特点，成为生物大分子分离纯化的 重要手段。
质谱技术：随着蛋白质组学研究的深入， 质谱技术在生物大分子鉴定中发挥着越来 越重要的作用。
生物信息学方法：通过计算机技术对生 物大分子数据进行处理和分析，为生物 大分子的分离纯化和鉴定提供了有力支 持。
03
生物大分子的鉴定
鉴定方法
化学分析法：通 过化学反应对生 物大分子的组成 和结构进行分析。
免疫分析法：利 用抗体与抗原的 特异性结合，对 生物大分子进行 检测和识别。
生物活性测定法： 通过检测生物大 分子对细胞或生 物体的活性影响， 确定其结构和功 能。
分子生物学方法： 利用分子杂交、 PCR等技术对生 物大分子进行基 因水平和蛋白质 水平的鉴定。
随着新材料的出现和应用，将会有更多高效、低成本的分离纯化材料应用 于实际操作中。
人工智能和机器学习等先进技术的应用，将有助于提高生物大分子分离纯 化和鉴定的自动化程度和智能化水平。
生物大分子分离纯化和鉴定技术将与生物信息学、系统生物学等学科交叉 融合，形成更加全面和深入的研究和应用领域。
05
生物大分子分离纯化和鉴定的应用领域
酶工程：通过分离 纯化技术获取酶， 用于酶催化反应研 究和酶制剂的生产 。
化学反应中的生物大分子的分离纯化技术及应用研究
化学反应中的生物大分子的分离纯化技术及应用研究随着人类对生命科学的研究与深入，生物大分子在生命科学领域中发挥着越来越重要的作用。
然而，想要从复杂的生物体系中获取纯净的生物大分子是一项相当艰巨的任务。
在化学反应中，为了获取纯净的产物，我们可以通过一系列的化学反应、溶剂萃取、蒸馏、结晶等步骤来进行分离纯化。
类似地，生物大分子也需要专业的分离纯化技术来获得单一、纯净的样品。
本文将重点介绍当前常用的生物大分子分离纯化技术及其应用研究。
一、凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）也称为分子筛层析法，是其中的一种分离技术，是利用分子筛过滤作用，通过大小分离生物大分子的方法。
也就是说，当一个混合物在溶液中进行层析时，它们将按大小顺序逐渐与凝胶内的微孔隔离出来。
而较大的生物大分子将无法通过凝胶微孔，而较小的物质则可随着溶液进一步深入凝胶内部，最终通过洗脱。
凝胶过滤层析法的主要优点是操作简单，具有较好的纯化效果。
它特别适用于大分子的纯化，例如酶、蛋白质、多肽、高分子以及其它具有不同分子量的物质混合物的分离。
凝胶过滤层析法被广泛应用于生物学、有机化学、生物制药等领域。
二、离子交换层析法离子交换层析法（Ion-exchange chromatography），是指利用固定正、负离子的功能基团，与可带电荷的分子间的相互作用力，实现对样品分离纯化的技术。
离子交换层析法的选择与离子交换柱的理化性质、样品离子性质和操作条件有关。
离子交换层析法的主要优点是它是一种高效、简便、快速并且基本上不损害生物大分子的分离纯化方法。
在生物大分子的纯化过程中，如果杂质物质与目标物质都带有电荷，离子交换层析是非常好的选择。
离子交换层析可以用于酸性、碱性、中等等多种环境下的分离纯化。
三、膜过滤分离技术膜过滤技术（Membrane Filtration）是指利用膜的结构及其物理化学理性，在分离过程中分离溶液体系。
生物大分子的分离和纯化技术
生物大分子的分离和纯化技术生物大分子是指具有较大分子量的生物分子，如蛋白质、核酸、多糖等。
要研究这些生物大分子的结构和功能，需要对它们进行分离和纯化。
生物大分子的分离和纯化技术是生物学和生物工程学中的重要内容，它们的发展和应用使得我们能够更深入地了解生命的奥秘，同时也推动了医药、农业、工业等领域的发展。
生物大分子的分离和纯化需要经过多个步骤，这些步骤通常包括细胞破碎、分子分离、分子鉴定等。
其中，分子分离是最基本、最关键的步骤之一，它可以使得目标分子从复杂混合物中被分离出来，并得到相对纯度较高的产物。
目前，生物大分子的分离和纯化技术包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、尺寸排除层析、逆向相色谱层析和高效液相色谱层析等方法。
凝胶过滤层析是一种基于分子尺寸差异的分离方法。
在这种方法中，样品被加入到一列凝胶柱中，较大的分子无法穿过凝胶孔隙，而较小的分子则可以顺着凝胶孔隙通过。
因此，随着溶液通过凝胶柱，不同大小的分子会被分离出来。
这种方法适用于大小分子差异较大的生物大分子的分离。
离子交换层析是基于分子电荷的分离方法。
在这种方法中，一种带有正电荷或负电荷的树脂被用来吸附目标分子，通过控制溶液的pH和离子强度等参数，可以使得目标分子从树脂上逐渐被洗下来。
这种方法适用于分子之间的电荷差异较大的生物大分子的分离，如蛋白质。
亲和层析是一种基于分子亲和性的分离方法。
在这种方法中，一种特殊的树脂被用来吸附具有特定结构或性质的目标分子。
例如，可以将某种亲合剂固定在树脂上，然后用于吸附与该亲合剂有特异结合关系的目标分子。
这种方法适用于具有高度特异性活性的生物大分子的纯化。
尺寸排除层析是一种基于分子形状的分离方法。
在这种方法中，一种具有多孔性的材料被用来吸附目标分子，具有大分子尺寸和形状的目标分子沿着孔隙穿过，而具有小分子尺寸的分子则通过孔隙空隙。
这种方法常用于分离蛋白质和糖类等生物大分子。
逆向相色谱层析是一种基于亲水性的分离方法。
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3）透析法纯化过氧化氢酶:将沉淀重溶于 0.05mol/L旳磷酸缓冲液(pH=7.2) 中, 4 ℃ 透析过夜,然后按1∶1旳百分比向透析液中 加入预冷旳正丁醇进行脱脂,4℃静置过夜. 然后6000r/min离心,弃去沉淀以及正丁醇 层,反复2次,得粗酶液.
2.DEAE2Sep haro se 离子互换层析： 用磷酸缓冲液(0.05 mol/ L , p H =7.2) 平衡 至少4 倍柱体积(20 mL) , 上样5 mL . 用0～1 mol/ LNaCl溶液(含0.05 mol/ L , p H =7.2 旳 磷酸缓冲液) 进行梯度洗脱, 流速30 mL/ h , 每管搜集5 mL , 紫外监测波长为280 nm ; 测 定各管过氧化氢酶活性和蛋白含量; 搜集活 性较高旳各管酶液, 4 ℃透析过夜, 冷冻干燥 后进行凝胶过滤.
1.粗酶液旳制备：1）称取新鲜鸭肝100 g , 用自来水 洗净, 再用消毒双蒸水漂洗洁净. 按1:5 旳百分比加 入预冷旳0.05 mol/ L 旳磷酸缓冲液(p H 7.2) , 用高 速组织捣碎机捣碎, 置于4 ℃冰箱抽提2 h ; 离心(6 000 r/ min ,4 ℃, 30 min) , 搜集上清液。 2）盐析法粗提过氧化氢酶:加入硫酸铵至40 %饱和 度, 离心(6 000 r/ min , 4 ℃, 30 min) 去沉淀, 上清中 再加硫酸铵至60 %饱和度, 离心搜集沉淀。
试验原理
1.离子互换层析原理:固定相为离子互换剂， 是利用离子互换剂对多种离子有不同旳亲 和力，来分离混合物中多种离子旳层析技 术。
2.凝胶过滤层析原理:也称分子筛层析、排阻 层析。是利用具有网状构造旳凝胶旳分子 筛作用，根据被分离物质旳分子大小不同 来进行分离。
3.电泳法旳基本原理:电泳（electrophoresis）是指 带电荷旳溶质或粒子在电场中向着与其本身所带 电荷相反旳电极移动旳现象。物质分子在正常情 况下一般不带电，即所带正负电荷量相等，故不 显示带电性。但是在一定旳物理作用或化学反应 条件下，某些物质分子会成为带电旳离子（或粒 子）。不同旳物质，因为其带电性质、颗粒形状 和大小不同，因而在一定旳电场中它们旳移动方 向和移动速度也不同，所以可使它们分离。
生物大分子的分离纯化技术
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：
1. 确定要制备的生物大分子的目的和要求。 2. 建立可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的 关键。
3. 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的 产物的物理化学性质。 4. 生物材料的破碎和预处理。
5. 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。
6. 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要 求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或 HPLC和毛细管电泳都是一个峰。
分析测定的方法主要有两类：
即生物学和物理、化学的测定方法。 物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱 法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度 法）、电泳法、以及核磁共振等。
生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含 量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪 法等；
实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更 加快速、简便。
抽提有效成分的影响因子
• 在抽提阶段，pH值、金属离子、溶剂的浓度和极
性等因子，可明显影响有效成分的性质和数量。 因此选择抽提液必须考虑这些因素。
(1)溶剂的极性和离子强度：
有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中 稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。 例如提取刀豆球蛋白A时，用0.15mol/L甚至更高浓度 的NaCl溶液，都可使其从刀豆粉中溶解出来，稳定存 在。而抽提脾磷酸二酯酶时，则需用0.2 mol/L蔗糖 水溶液。 一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关（相似 相溶原理）；离子强度通过影响溶质的带电性也影响 溶质的溶解度。 降低极性：在水溶液中加蔗糖，甘油，二甲亚砜， 二甲基甲酰氨。
三 、 生物大分子的提取（抽提）
（一）抽提的含义 “抽提”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的 细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地 释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不 丢失生物活性的过程。 影响提取的因素主要有： 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； 由固相扩散到液相的难易； 溶剂的pH值和提取时间等。
第09章 生物大分子的分离与纯化技术
结果：疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟； 结果：疏水性强的蛋白质亲合力大，出峰迟；疏水性小的蛋 白质就容易被洗脱。 白质就容易被洗脱。
9.2.2 色谱条件
链烃作为配基（键合在固体基质上） ①固定相：常用C4 ～ C8链烃作为配基（键合在固体基质上） 固定相：常用 为填料。孔径25～ 为填料。孔径 ～50nm。 。 流动相： ②流动相： 水溶性有机溶剂（ 液 甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃） 水溶性有机溶剂（B液） （甲醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃） 洗脱能力增大 ＋水（A液） 液 强酸（三氟醋酸、甲酸、 ＋强酸（三氟醋酸、甲酸、磷酸 ） 加酸作用： 加酸作用： ∵－SiOH == －SiO- ＋ H+ • 蛋白质易与 蛋白质易与—SiO- 结合很难洗脱，加酸抑制上述平衡向右 结合很难洗脱， 离解。 离解。 • 减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。 减小蛋白质的疏水性，使其保留减弱，易被洗脱。 ③温度：常温 温度：
9.1.1 生物大分子分离纯化的特殊性
1、要求产品保持其生物活性，也就是说要避免不可逆结构 、要求产品保持其生物活性， 变化发 生。 2、多孔填料必须使用大 孔径基质。 、 孔径基质。 3、生物大分子的色谱特性常不同于有机小分子。所以在选 、生物大分子的色谱特性常不同于有机小分子。 条件。 择色谱条件时不能随便套用小分子的 条件。
OH OCH2CH3
蛋 白 质
CH3
Ph
NH2 Ph COOH
OH 蛋白质疏水基团分布示意图
配基和蛋白质分子之间的吸附推动力和样品组分的洗脱机理 （即：溶质在色谱中的保留行为）： 溶质在色谱中的保留行为）： • 用“疏溶剂化理论”：蛋白质与配基的结合是由于溶质分 疏溶剂化理论” 子有一个减少其与水接触的非极性表面的倾向， 子有一个减少其与水接触的非极性表面的倾向，它们在盐 水溶液中，两个非极性的表面趋向于避开水相而互相接触。 水溶液中，两个非极性的表面趋向于避开水相而互相接触。 溶质和疏水配基的结合是伴随着它们非极性表面暴露在水 中的面积的多少而进行的。（即蛋白质在盐水体系中，有 中的面积的多少而进行的。 即蛋白质在盐水体系中， 一倾向产生：避开水相而吸附在固定相上。 一倾向产生：避开水相而吸附在固定相上。∵生物物质界 面自由能比水低，与表面自由能低的固定相产生亲合力） 面自由能比水低，与表面自由能低的固定相产生亲合力） 讨论
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(4) 亲和色谱
1、原理
亲和色谱(Affinity Chromatography AC)又 叫功能色谱(Function Chromatography)， 它的原理是填料上的配基与生物大分子特 异结合，用特殊的洗脱条件把被吸附的生 物分子洗脱下来。一种亲和色谱填料只能 用于一种或有限的一类生物分子。
中性pH可以保持蛋白质的活性，当pH偏碱性时， 有利于洗脱。
3、疏水色谱的特点
1. 分离效果好，成本低。 2. 洗脱条件温和，处理样品量大，分辨 率高。 3. 配合其他色谱使用更能发挥它的分离 效果。
4、疏水色谱应用
苯基琼脂糖凝胶纯化培养液中的抗体。
5.疏水色谱纯化细胞培养样品中的抗体
1800 1500
3. 环氧氯丙烷活化法
这种活化的方法时间短，而且价格便宜，也很常用。
4.高碘酸盐活化法
可以很温和在中性条件下偶联配基，但是需要用还原剂 还原才能得到稳定的填料
5.NHS活化法
可以在短时间内温和条件下偶连任何带氨基的物质，特 别适合偶连生物大分子，以保证它们的生物活性，它有 6-9个碳原子的手臂，是合成亲和填料不错的选择。
A280(mAu)
1200 900 600 300 0 0 50 100 150 200 250 300
volume(ml)
苯基琼脂糖凝胶分离抗体
填料：苯基琼脂糖凝胶 FF 5ml Buffer A:50mM PBS，0.6M 硫酸铵，pH7.0 Buffer B: 50mM PBS，pH7.0 结果：洗脱蛋白量4.5mg/ml×20ml=90mg
3、凝胶过滤色谱的缺点
处理量小，时间长，效率低。
凝胶过滤色谱填料
传统的凝胶过滤的填料用的是葡聚糖交联凝胶如 sphadex系列以及改性的sephacryl系列，凝胶刚性不理 想流速不快，特别是前者压力和盐都会导致凝胶收缩， 所以难提高流速，也不容易制备成小颗粒的高分辨率 的填料。 新的凝胶过滤色谱填料将葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶混 合造粒，再经过高度交联制备出流速快、重复性好、 分离效果更好的新型凝胶过滤填料，如superdex系列及 琼葡糖凝胶系列都是用这样的。它比普通的葡聚糖凝 胶填料相比流速快，刚性好，颗粒均匀，没有非特异 吸附，装填后体积不收缩，因此可以在高流速下保持 很好的分离效果可以制备成平均粒径为34μm或13 μm高效填料。
3000-80000 琼葡糖凝胶 G100 HP及FF 4000-120000 琼葡糖凝胶 G150 HP及FF 5000-300000
琼葡糖凝胶 G200 HP及FF 5000-600000
(2) 离子交换色谱
1、原理
离子交换色谱（Ion Exchange Chromatography IEC）原理是带电的生物大分子和离子交换色 谱填料上的离子基团进行交换而被分离纯化。
苯基琼脂糖纯化SDS-PAGE图
1.marker 2. 培养液上清 3.苯基柱 穿透 4.和5 .苯基柱洗脱
6、疏水色谱填料
介质名称 苯基琼脂糖凝胶 FF Phenyl sepharose FF 丁基琼脂糖凝胶 FF Butyl sepharose FF 辛基琼脂糖凝胶 FF Octyl sepharose FF 功能基团 苯基 -OCH2CH(OH) CH2OC6H5 丁基 -OCH2CH (OH) CH2OC4H9 辛基 –OCH2CH (OH) CH2OC8H17
凝胶过滤色谱填料
型号
琼葡糖凝胶 G10 HP及FF 琼葡糖凝胶 G15 HP及FF 琼葡糖凝胶 G25 HP及FF 琼葡糖凝胶 G50 HP及FF 琼葡糖凝胶 G75 HP及FF
分离范围 ＜700 100-1500 1000-5000 1000-30000
平均粒径(μm) 34和 90 34和 90 34和90 34和90 34和90 34和90 34和90 34和90
1.螯合金属离子的影响
常用的有Ni2+、Cu2+、Zn2+、Co2+和Ca2+。其中Cu2+、 Ni2+对蛋白吸附力强， Co2+ ，Zn2+比较弱。
2.缓冲液的影响
缓冲液中最好没有EDTA，EGTA和氨盐，在缓冲液中加入适量 的表面活性剂或者减少盐浓度可以降低非特异的疏水吸附。
3.样品的影响
1.样品通常溶解在pH5.5-8.5的缓冲液中，pH高，载量也高。 2.缓冲液的pH不能小于5.5，否则金属离子会脱落。 3.样品不能含EDTA，EGTA和氨盐等
镍琼脂糖凝胶 FF分离带His标签的重组蛋白
800
A280(mAu)
600 400 200 0 0
穿透峰
1 2 3
4
40
பைடு நூலகம்
80 120 time(min)
160
图1镍柱色谱图
柱子： 镍琼脂糖凝胶 FF 1.6x20 10 ml 样品：13.5ml细胞破碎液 平衡缓冲液：20mM PBS pH 7.4 0.5M NaCl 洗脱缓冲液:平衡缓冲液中加不同浓度的咪唑
6.巯基活化法
把巯基和二巯物质进行反应而得到的填料可以用于在短 时间内温和偶联带巯基的物质，它是可以反复使用的， 同时也是纯化带巯基物质的有利工具。
7.卤素活化法
使填料碘化或者溴化，可以在短时间内温和偶联带巯基 的物质，溴化填料还可以偶联带氨基或者羟基的物质。
3、亲和色谱的应用 1 金属螯合色谱纯化带His标签蛋白
2、离子交换色谱优点
1. 处理量大，操作简单。 2. 应用广泛。
3、离子交换色谱缺点
样品要除盐，分离效果不如亲和和疏水色谱。
4、离子交换色谱填料
介质名称
DEAE琼脂糖凝胶 FF或(DEAE sepharose FF) Q 琼脂糖凝胶 FF) 功能基团 二乙基氨基乙基 -OCH2CH2N(C2H5)2
7 6
60
120 time(min)
180
图3 Cu2+螯合色谱图
柱子： Cu2+琼脂糖凝胶 FF 1.6x20 10 ml 样品：20ml细胞破碎液 平衡缓冲液：20mM PBS pH 7.45 0.5M NaCl 洗脱缓冲液:平衡缓冲液中加不同浓度的咪唑
图4 Cu2+柱SDS-PAGE 1: marker，2: 细胞破碎液，3:穿透峰，4: 10mM咪唑洗脱峰，5: 20mM咪唑洗脱峰 ，6: 50mM咪唑洗脱峰，7: 100mM咪唑 洗 脱 峰 ， 8 : 2 0 0 mM 咪 唑 洗 脱 峰 ， 9 : 300mM咪唑洗脱峰，10: 400mM咪唑洗 脱峰
2、活化方法 1. 溴化氰活化法
溴化氰活化及配基偶联的反应如下图所示。 对新活化的琼脂糖凝胶偶联分析表明，80% 配基是由氰酸酯偶联的，20%由亚氨碳酸盐 偶联的。 缺点： 偶联后形成的酰胺键不稳定，容易降解而使 配基脱落。
溴化氰活化及配基偶联的原理
2.缩水甘油醚活化法
这种活化的填料其偶联配基密度虽然只有溴化氰活化75%， 但它有合适的亲和手臂，所以有更好的分离效果，而化 学性质更加稳定。配基很少脱落。 此外它对琼脂糖凝胶还有交联作用，所以填料的刚性更 好，流速更快。
FF 或(Q sepharose 二乙基(2-羟丙基)季胺 -OCH2CH2N+ (C2H5)2CH2CH(OH)CH3 CM 琼脂糖凝胶 FF或(CM 羧甲基 –OCH2COOH sepharose FF) SP 琼脂糖凝胶 FF或(SP sepharose 磺酸丙基 -C3H6SO3H FF) 球形羟基磷灰石 FF 钙离子及磷酸根
生物大分子分离纯化方法
韦 新 桂(chromatography)
北京韦氏博慧色谱科技有限公司
色谱填料的定义
色谱填料（层析介质）
一、色谱分离的原理
1、生物分子的大小及形状 2、生物分子的荷电性质 3、生物分子的极性 4、生物分子的特异性
二、色 谱 种 类
1、凝胶过滤色谱（分子筛） 2、离子交换色谱 3、疏水色谱 4、亲和色谱
(1) 凝胶过滤色谱
1、原理
凝胶过滤色谱(Gel Filtration Chromatography GFC)又称为分子排阻 色谱(Size Exclusion Chromatography SEC）原理见图解。
2、凝胶过滤色谱的优点
1. 分离条件温和，蛋白质收率高，重现性好。 2. 分离的分子量范围广。 3. 易于操作。
金属螯合亲和色谱(Metal Chelate Affinity Chromatography)，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是 利用蛋白表面的一些氨基酸，例如组氨酸等能与多种过渡金 属离子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用， 利用这个原理对蛋白进行分离。因此螯合了金属离子的琼脂 糖凝胶就能够选择性的吸附那些含有组氨酸的蛋白和对金属 离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸 也能与固定金属离子产生吸附作用，但这种吸附力要远小于 组氨酸残基与金属离子的吸附作用。
图2 镍柱SDS-PAGE 1：Marker 2: 细胞破碎液，3,4：穿透峰 ，5: 10mM咪唑洗脱峰，6,7：20mM咪 唑洗脱峰，8：100mM咪唑洗脱峰，9、 10: 200mM咪唑洗脱峰
用Cu2+分离带His标签的重组蛋白
A280(mAu)
800 600 400 200 0 0
穿透峰 1 2 3 45
选择填料时，最好是选择琼脂糖凝胶系列的产 品，避免选择纤维素类的或者sephadex类的， 因为它们流速慢而且不能在柱子上进行再生清 洗，操作不便。如果采用线性洗脱的方法使用 细长柱子及颗粒细的HP级别的填料可以得到更 好的分离效果。
(3) 疏水色谱
1、原理
疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography HIC）原理是 在高浓度的盐溶液中，蛋白质会被吸附 到疏水色谱填料的疏水基团上，当逐渐 降低盐浓度时，它们会按疏水性的强弱 先后被洗脱。