SNP分子标记的原理及应用

遗传育种的应用 检测水稻SNP，研究优良性状与SNPs的关联关系，指 导育种。
SNP的检测方法
基于以下9 种基本原理: 1. 以结构为基础;
1.1 限制性片段长度多态性法 （RFLP ）; 1.2 单链构象多态性法 （SSCP ）; 1.3 变性梯度凝胶电泳 （DGGE ）;
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
SNP 的特点
（1）密度高 S N P在人类基因组的平均密度估计为 1\1000 bp , 在整个基因组的分布达 3×106个。 （2）富有代表性 某些位于基因内部的S N P 有可能 直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此, 它们可能代 表疾病遗传机理中的某些作用因素。 （3）遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标记相 比, SNP 具有更高的遗传稳定性。 （4）易实现分析的自动化 SNP标记在人群中只有两 种等位型(allele) 。这样在检测时只需一个“ + \- ”或 “全\无”的方式,这使得基于S N P的检测分析方法易实 现自动化。
通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDITOF质
谱技术相结合，实现基因分型检测。 基于MassARRAY® 分子量阵列平台的iPLEX GOLD技 术可以设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验 设计非常灵活，分型结果准确性高。特别适合于对全基
因组研究发现的结果进行验证，或者是有限数量的研究
8.变性高效液相色谱( DHPLC)
原理：目标核酸片段PCR扩增，部分加热变性后， 含有突变碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基 不能配对而形成异源双链。因包含错配碱基的杂合 异源双链区比完全配对的同源配对区和固定相的亲 和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来, 从而达到分 离的目的。SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰形或 数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突 变的碱基。 特点：使用高效液相色谱检测SNPs具有检测效率高， 便于自动化的优点，对未知SNPs的准确率可达95% 以上。但DHPLC检测对所用试剂和环境要求较高, 容易产生误差, 不能检测出纯合突变。
Seal plate
Analyze
加样 封口 震荡 30 分钟 离心 分析
BigDye® XTerminator™ Purification Kit
6.DNA测序法
直接测序是最容易实施的SNP检测方法。 原理: 通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较, 以确定所研究的碱基是否变异, 其检出率可达100%。 特点：可以得到SNP 的类型及其准确位置等SNP分型所需要的重 要参数。
特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知 基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突 变类型和具体位置。
1.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
原理：是利用长度相同的双链 DNA片段解链温度 不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开的电 泳技术。
2. 等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
3. RT-PCR
实时荧光PCR 技术( RT-PCR )一种通过检测PCR 过程中和 PCR 之后产生的荧光信号来区分等位基因类型的SNP 检测技 术, 同时基于荧光能量转移原理( FRET) 。每检测一个SNP 位 点需要一条探针, 其3„ 端连有淬灭剂基团, 5‟ 端连有荧光剂基 团, 最终与SNP 位点完全匹配时探针结构被破坏, 从而发出荧 光而被检测。
1.2 单链构象多态性(SSCP)
原理：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同 的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二 级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影 响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。 在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这 样在凝胶上的迁移速率不同，出现不同的条带，检 测SNP。
等位基因特异PCR（AS-PCR）; RT-PCR; 等位基因特异性杂交; 引物延伸法--单碱基延伸法; DNA直接测序法; 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测; 变性高效液相色谱 ( DH PLC )法；
1.1 RFLP法
原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或 两种以上的限制性内切酶作用于同一DNA片断，如果存 在SNP位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根 据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。

一管做10个位点
对照: 30个反应


6条对照引物: 20A, 28G/A, 36G, 44T, 52C/T, 60C 对照模板DNA: Ampliconfrom CEPH DNA

0.01 ~ 0.4 pmol纯化的PCR模板 Matrix Standard DS-02
[dR110, dR6G, dTAMRA™, dROX™, LIZ™]
检测出来。
等位基因特异核苷酸片段分析( ASO) ，基因芯片和动态等 位基因特异性杂交( DASH) 等。
5.引物延伸法--单碱基延伸法
单重SNaPshot数据
多重SNaPshot反应原理
SNaPshot操作流程
SNaPshot™Multiplex试剂盒
SNaPshot™Multiplex Ready Reaction Mix
质粒
PCR产物
纯化
SNaPshot PCR 纯化 电泳样本制备 电泳 软件分析
SNaPshot PCR
用量 (μ L / Sample) Reaction Mix Pooled PCR Products Pooled Primers dH2O 总体积
标准体系 文献A 文献B 文献C 文献D 5 2 2 2 3 3 2 1.5 2 9 1 2 1 8 1 10 6 5 5 20
SNaPshot PCR产物纯化
乙醇沉淀法: 11 个步骤, > 1 小时
Add reagents
Seal plate & incubate
Centrifuge
Empty plate
Add reagents
Seal plate & incubate
Centrifuge
Empty plate
Dry
Re-suspend
AB——New Master Mix
定量分析 高灵敏
TaqMan® Gene Expression Master Mix
• 定性分析
– 高特异性
TaqMan® Genotyping Master Mix
4. 等位基因特异性杂交
等位基因特异性杂(Allele specific hybridization ,ASH) 根据核苷酸探针和互补的目的片段进行杂交，完全匹配和 有错配两种情况下杂交复合体稳定性的不同而将SNP 位点
SNP 的应用
种族遗传学 T a n g 等研究了来自世界五个地区(中国、马来、高加 索、印度和非洲) 人群的MDR1 基因的单倍体和连锁不
平衡特征,发现具有e12/ 1236T2e21/ 2677T2e26/ 3435T
亚型的单倍型m h 5 在非洲人群以外的四种人群中高度
表达,而具有e12/ 1236C2e21/ 2677G2e26/ 3435C 亚型的
管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中
离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真 空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而 检测出SNP位点信息。☺
优势
（1）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一——分子量，不涉及 荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机 器本身出错的概率非常低； （2）质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何pmol级别的物质 都能被检测出来； （3）通量高：几秒就能检测完一个反应孔； （4）操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规PCR仪器； （5）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应； （6）便宜：引物不带荧光标记，普通长度（3条引物总长80bp左 右），此外在一个反应孔内能完成4个或更多的反应，即通常所说 的4重反应； （7）兼容性强：质谱仪还能在核酸的其它方向，以及蛋白质组学、 微生物鉴定等领域也能应用。 （8）质谱技术是“一管式操作”，即反应体系在生化学实验过程 中始终在一个试管内反应，没有多次转移，这样就减少被污染的概 率。
单倍型mh7 在非洲人群中占了1/ 3 以上,进一步证明了 种族间的表形差异。
疾病易感性研究 原理：SNPs 被认为是一种稳定遗传的早期突变,与疾病有 着稳定的相关性。当一个遗传标记的频率在患者明显超过 非患者时,即表明该标记与疾病关联,通过比较分析两者的 单倍型和研究连锁不平衡性,可将基因组中任何未知的致 病基因定位。 Horikawa 等应用SNPs作为遗传标记通过基于连锁不平衡 的相关分析,在墨西哥裔美国人群和北欧人群中发现了一 个DM 易感基因,该基因第三个内含子上的A/ G多态性 (SNP43) 同2 型糖尿病(2 型DM) 连锁,该位点为纯合子G的 个体患2 型DM 的风险增加,这是目前为止所发现的第一个 与2 型DM 相关的SNP ,预示了SNP 在DM 相关基因研究中 的重要作用。
SNP分子标记的原理 及应用
、
SNP 的概念
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指 由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在 不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大 多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。 它包括单碱基的转换, 颠换、 插入及缺失等形式。
原理：根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3′末端与 SNP位点 的碱基互补(或相同) ,另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS-PCR 技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产 物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩 增产物的有无,从而确定基因型的 SNP。
位点已经确定的情况。
MassARRAY技术原理:
先通过P C R扩增目标序列，然后加入S N P序列特异延伸引
物，在 S N P 位点上，延伸 1个碱基，在反应体系中以
ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即 终止。根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP， 从而具有不同的分子量。 将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空
药物基因组学研究
SNPs 可以精细地反映个体的遗传差异,SNPs 位点与个 体的药物反应进行相关分析,从而确定基因在药物作用 中的功能和意义。这样既可以根据患者的遗传特性设 计治疗方案,实现“个性化治疗”,提高药效，降低药物 的毒副作用,又可以在临床试验阶段为特定的药物选择 合适的受试者,提高效率,减少费用。
7.飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测
原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合 物共价结合后, 在硅芯片上进行引物的退火,延伸反应,
突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不相同。根据引
物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪 上显示不同Байду номын сангаас而检测SNP。
SNP分型的方法多种多样，MassARRAY分子量阵列技 术是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具，