snp分子标记作业

5、连接、转化与测序
由于本实验中的ＰＣＲ产物浓度达不到直接测序的要求， 故采用传统的连接、转化、涂板、检测、再测序的方法。
具体过程为：将回收的目的片段连接到ＰＭＤ１９－ Ｔ载体中（连接体系见表３），再将连接了目的片段的载 体转入感受态细胞内，置于ＳＯＣ培养基中摇床培养１ｈ； 将菌液均匀地涂在加入氨苄（Ａｍｐ）的ＬＢ固体培养基 上，于３７℃条件下培养１２ｈ；对生长状况良好的单菌 落进行挑菌，最后进行菌落ＰＣＲ检测，程序同２０μＬ ＰＣＲ反应体系，模板为枪头挑取的微量菌体，ｄｄＨ２ Ｏ的加入量为１６μＬ，其余成分不变。选择菌落检测为 阳性的菌液送北京三博远志生物技术有限责任公司测序
案例：基于ＳＮＰ分子标记的凹叶木兰遗传 多样性初步研究
技术路线： 1、采样，材料准备 2、基因组DNA提取 3、引物的获取与筛选 4、ＰＣＲ扩增及目的片段回收 5、连接、转化与测序 6、分析方法 7、结果分析
1、采样，材料准备
研究所用的２９个凹叶木兰个体的嫩芽样品（表１）于 ２００７年分别随机采自四川雷波县麻咪泽省级自然保护区 （２２个）和美姑县美姑大风顶国家级自然保护区（７个）。 样品采集后即置于有硅胶的密封袋中保存，防止DNA降解。引 物筛选所用正对照杨树叶片采自四川大学望江校园内。
❖ 它包括单碱基的转换、 颠换、 插入及缺失等形式。
SNP 的特点
（1）密度高 S N P在人类基因组的平均密度估计为 1\1000 bp , 在整个基因组的分布达 ຫໍສະໝຸດ Baidu×106个。
（2）富有代表性 某些位于基因内部的S N P 有可能 直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此, 它们可能代 表疾病遗传机理中的某些作用因素。
（3）遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标记相 比, SNP 具有更高的遗传稳定性。
（4）易实现分析的自动化 SNP标记在人群中只有两 种等位型(allele) 。这样在检测时只需一个“ + \- ”或 “全\无”的方式,这使得基于S N P的检测分析方法易实 现自动化。
SNP的检测方法
❖ 基于以下9 种基本原理: 1. 以结构为基础;
7、1测序结果与毛果杨相似性比对
对２９个样本进行测序，最终得到４条有效序列（表１）。表１ 测序结果显示，所测片段长度均为512ｂｐ，与实验中根据毛果杨序列 所设计的引物所对原始片段长度（５１０ｂｐ）相符。ＢＬＡＳＴ软件 进行相似比对结果显示，本实验所得凹叶木兰序列的确与毛果杨序列相 似，相似区域达３６％。利用Ｃｌｕｓｔａｌｗ ２在线比对软件，将 引物所对毛果杨序列片段与测序序列一一进行比对，相似度分别为３０ ％、２９％、３０％和２９％（表４）。４个样品的序列与毛果杨序列 的相似性一致。
2、基因组DNA提取
基因组ＤＮＡ 采用大连宝生（ＴａＫａ Ｒａ）公司的Ｇｅｎｏｍｅ Ｕｎｉｖｅｒ ｓａｌ ＤＮＡ 提取试剂盒分批提取。对 所提取的基因组ＤＮＡ 标号，贮存于－２ ０℃冰箱中备用。
3、引物的获取与筛选
3、1引物来源
美国加州大学戴维斯分校实验室从ＮＣＢＩ的 毛果杨ｕｎｉＧｅｎｅ数据库中下载了毛果杨的单 基因序列，并将其与拟南芥基因序列对比，发现其 中一段共有序列。由于毛果杨（杨柳科）与拟南芥 （十字花科）为系统位置跨度很大的两种植物，该 段序列共有的现象说明了此段序列具有高度的保守 性，故推断在凹叶木兰的基因序列中也应存在该段 序列。
4、ＰＣＲ扩增及目的片段回收
引物选定后，以所提取的凹叶木兰基因组ＤＮＡ 为模板， 用选定的３５６号引物进行目的片段扩增。由于要对所扩增的 目的片段进行测序，为避免Ｔａｑ酶引起的碱基突变而造成测 序结果不准确，本实验选用体积比为４∶１的Ｔａｑ酶与Ｐｆ ｕ高保真酶混合酶。
扩增条件：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性１５ｓ，５ ０℃ １５ｓ，７２ ℃延伸６０ｓ，循环４０次。ＰＣＲ扩增 后，采用Ｏｍｅｇａ胶回收试剂盒对目的片段进行回收，进而 进行之后的连接、转化等步骤；对暂时不用回收的产物进行编 号并贮存于－２０℃冰箱。
SNP分子标记的原理 及应用
、
SNP 的概念
❖ 单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指 由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在 不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大 多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。
7、2 ＳＮＰ位点检测
运用Ｃｌｕｓｔａｌｗ ２在线比对软件，对测序结果 进行样本间纵向比较。结果显示（表４），样本间同源 性很高，相似度均在９７％以上。１号样本与２、３、４ 号样本间的ＳＮＰ位点分别为：１１个、５个和７个，即在 ５１２ｂｐ长度的序列上，ＳＮＰ位点平均至少达７个，即 平均每７３ｂｐ长度的片段上就存在一个ＳＮＰ位点。利用 ＤｎａＳＰ软件计算得出凹叶木兰样本核苷酸多样性指数π 为０．０１７８。
1.1 限制性片段长度多态性法 （RFLP ）; 1.2 单链构象多态性法 （SSCP ）; 1.3 变性梯度凝胶电泳 （DGGE ）;
2. 等位基因特异PCR（AS-PCR）; 3. RT-PCR; 4. 等位基因特异性杂交; 5. 引物延伸法--单碱基延伸法; 6. DNA直接测序法; 7. 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测; 8. 变性高效液相色谱 ( DH PLC )法；
3、2引物设计与选择
Ｍｉｎｇｃｈｅｎｇ Ｌｕｏ实验室为这一研究设计出２２ ５对引物。在本研究中，随机选取了１０对引物（表２），并 从已提取的凹叶木兰样品基因组中随机选择一个作为模板、以 杨树模板为正对照，对１０对引物进行复选，最终选定了条带 清晰、无杂带的３５６号引物（图１）用于本实验。
引物筛选
6、分析方法
测序结果利用ＮＣＢＩ数据库中的在线序列比对软件 ＢＬＡＳＴ以及ＥＢＩ网页中在线序列比对软件Ｃｌｕｓ ｔａｌｗ ２进行样本序列与引物所对毛果杨序列的同源 性比对以及样本序列间相似性比对，找出ＳＮＰ位点。利 用ＤｎａＳＰ软件计算样本核苷酸多样性指数π，该指数 越高则遗传多样性越高。
7、结果分析