细胞生物学常用技术原理与应用

细胞侵袭试验
细胞侵袭试验
细胞迁移侵袭选择的时间点须尽量控制 （12-48h）。除了考虑细胞侵袭力外， 不能忽视处理因素对细胞数目的影响。 不宜过长：时间点必须限定在处理因素 不影响实验组细胞数目内。 不宜过短：细胞内储存一定量的MMPs， 短时间内细胞的侵袭能力可能不会有太 大改变，而且处理因素影响MMPs从表 达到释放需要一个过程。

六、划痕愈合实验
技术原理
简称划痕实验，适用于体外研究细胞迁 移运动能力，操作简单、应用广泛。 在融合的单层细胞上人为制造一个空白 区域，称为“划痕”。 臵于镜下拍照，记录划痕边缘的细胞逐 渐进入空白区域，即“划痕”愈合过程。 根据“划痕”愈合的速率反映细胞迁移的 速率。

技术原理
原适用于非贴壁生长细胞，但某些恶性 肿瘤细胞不仅在贴壁状态下能增殖，在 悬浮状态下也能增殖，其在软琼脂中形 成克隆的能力同样反映其恶性程度。 某些细胞（如正常成纤维细胞）在悬浮 状态下不能增殖，则不适用该方法。

软琼脂克隆形成
底层琼脂的制备：将1.2%低熔点琼脂糖 与2×培养基等体积混合，室温下待完 全凝固。 上层琼脂的制备：将0.7%低熔点琼脂糖 与2×培养基等体积混合，加入细胞悬 液，充分混匀，≥3孔/组。 常规培养2-3周，加入0.1%结晶紫染液， 室温染色1h，镜下计数。 每个细胞集落≥50个细胞为1个克隆。

冻存方法
快冻程序 冻存管（管口要朝上）放入纱布袋内， 纱布袋系以线绳。 通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口， 按1-2℃/min速度降温，在30-40min内降 至液氮表面，停30min后直接投入液氮 中。

复苏方法

从液氮中取出冻存管，迅速投入37℃水 浴并不断摇晃，使管中的液体快速融化。 在5min内将细胞悬液转移至培养瓶内， 补充适量的预热的新鲜培养液。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将 MTT还原成不溶于水的蓝紫色结晶产物 formazan（甲瓒），并沉淀在细胞中， 而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解 沉积的甲瓒，溶液颜色深浅与其含量成 正比，可用酶标仪测定OD值。 MTT法广泛应用于新药筛选、细胞毒性、 肿瘤放射敏感性实验等。
台盼蓝法
将细胞悬液与等量的0.4%台盼蓝染液混 合，染色2-3min。 镜下可见死细胞被台盼蓝染成深蓝色， 活细胞不被染色呈无色透明状。 细胞活力测定须与细胞计数合并进行， 但要考虑染液对细胞悬液的倍比稀释。

细胞在6孔板或平皿内培养至90%融合 状态时，用10μL枪头沿底部划线。 加入培养基及不同处理因素，常规培养。 在不同时间点分别拍照记录。 计算细胞迁移率。迁移率=【（T0时划 痕宽度值-Tt时划痕宽度值）/T0时划痕 宽度值】×100%。
结果分析
七、细胞凋亡检测
基本概念
细胞凋亡（Apoptosis）又称为细胞程序 性死亡，由不同的生理或者病理因素引 起，是一个主动的、高度有序的、基因 控制的、一系列酶参与的过程。 细胞凋亡对个体的正常发育及在病理学 研究中的重要作用，成为目前生命医学 最为热门的研究领域之一。 细胞凋亡主要表现在细胞形态学及生物 化学变化。
技术原理
在细胞冻存时应加入低温保护剂。常用 的低温保护剂是二甲基亚砜（DMSO）。 DMSO是一种渗透性保护剂，可迅速透 入细胞，降低冰点，延缓冻结过程；并 提高胞膜对水的通透性，使胞内水分在 冻结前析出胞外，减少胞内冰晶，从而 减少冰晶对细胞的损伤。

冻存方法
预先配制冻存液：70%培养基 + 20%血 清 + 10% DMSO。胰酶消化对数生长期 细胞，经离心弃上清后加入适量冻存液 吹打成细胞悬液（1-5×106个/ml）。 细胞悬液按规格加入至冻存管中，密封 后标记细胞名称、研究者姓名和日期。 4年内存活率最高可达80%以上。
பைடு நூலகம்
基本概念
针对细胞凋亡不同阶段的研究方法 形态学观察 DNA Ladder ELISA法 TUNEL法 Hoechst 33258染色法 流式细胞术

TUNEL法
细胞发生凋亡时，激活某些DNA内切 酶切断核小体间的基因组DNA。此时 抽提DNA进行电泳检测，可见180200bp的DNA Ladder。 基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH在 TdT催化下连接上Biotin-dUTP，随后和 Streptavidin-HRP结合，最后通过DAB显 色来显示凋亡细胞，从而可在镜下检测 到凋亡细胞。

基本概念
无论何种外形，关键部分均为杯子底层 的一张有通透性的膜，其余部分的材料 与普通孔板是一样的。 膜孔径大小规格0.1-12.0μm，一般常用 材料是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 Transwell小室内称“上室”，培养孔内 称“下室”，上室、下室内分别盛装上 层、下层培养液，两者以膜相隔。

细胞迁移试验
细胞侵袭试验

技术原理及要点同细胞迁移试验，唯一 不同之处是在膜上室侧铺上一层基质胶 （matrigel），以模仿体内细胞外基质。 细胞先分泌基质金属蛋白酶（MMPs）， 将基质胶降解后，方可穿过膜。计数进 入下室的细胞数可反映细胞的侵袭能力。 基质胶保存于-20℃，呈固态；4℃时融 化为液态；37℃时快速凝固成胶状。

趋化性试验
常选用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞 可穿过膜进入下室，计数进入下室的细 胞数可反映下室成分对上室细胞的趋化 能力。 例如：研究B细胞对A细胞的趋化作用， 操作步骤同共培养体系。

细胞迁移试验

常选用8.0、12.0μm膜，上室接种细胞， 下室加入某种趋化因子（如生长因子）， 细胞向高营养的下室迁移。计数进入下 室的细胞数可反映细胞的迁移能力。 细胞分组处理后，弃培养液，无血清饥 饿培养12h，经0.25%胰酶消化后，调整 细胞浓度。 上室加入细胞悬液，下室加入含趋化因 子的培养液，常规培养24h，≥3孔/组。

TUNEL法
TUNEL法
TUNEL法
本法适用于石蜡切片、冷冻切片和人工 培养的或从组织分离的细胞凋亡测定。 由于DNA断裂方式不同，本法可特异 性检测出细胞凋亡，因此可区分细胞凋 亡和细胞坏死。 严格判断细胞凋亡时，应同时检测多个 指标。①极少数细胞凋亡时无DNA断 裂，因而不适用本法；②个别类型的坏 死细胞可出现TUNEL法检测阳性。
四、克隆形成实验
平板克隆形成
适用于检测单个贴壁生长细胞形成克隆 的能力，从而反应细胞增殖状况。 对于肿瘤细胞来说，克隆形成能力越高 则反应其恶性程度越高。 两个指标反应细胞增殖能力：①克隆形 成率；②克隆大小。

平板克隆形成
每平皿（D=60mm）接种100-200个细 胞，补加培养液至10ml，≥3平皿/组。 十字形晃动使细胞分散均匀，常规培养 2-3周（当出现肉眼可见的克隆时终止 培养），弃培养液，PBS洗涤2次。 甲醇固定15min，姬姆萨染色20min，自 来水冲洗，空气干燥。 计数肉眼可见的克隆数。克隆形成率= （克隆数/接种细胞数）×100%。
贴壁细胞
计数设备
血细胞计数板 血细胞计数仪

计数方法

将血球计数板及盖片擦拭干净，将盖片 盖在计数板上。 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘， 使悬液充满盖片和计数板之间，静臵 3min。 镜下观察计算计数板四大格细胞总数， 压线细胞只计左侧和上方的。
计数方法

按如下公式计算

镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团， 应按单个细胞计算；若细胞团占10%以 上，需重新制备细胞悬液。
二、细胞活力测定
总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞 活力。细胞活力的测定是细胞体外研究 中应用最广的技术手段之一。 组织中分离细胞及细胞复苏常需要检查 活力。 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和 活细胞组成，很难从形态上区别死、活 细胞。 常用噻唑蓝比色（MTT）法、台盼蓝法。

MTT法

技术原理

细胞接种在上室，由于膜有通透性，下 层培养液中的成分可以影响到上室的细 胞，从而可以研究下层培养液中的成分 对上室细胞生物学行为的影响。
技术原理
共培养体系
膜孔径≤3.0μm，细胞不能迁移通过。 若研究不涉及细胞运动能力，不需要细 胞穿过膜，则应选择3.0μm以下孔径。 例如：A细胞接种于上室，B细胞接种 于下室，研究B细胞分泌或代谢产物对 A细胞的影响。

平板克隆形成
平板克隆形成

必须选择对数生长期细胞。计数要准确， 至少三遍，取平均值。 在接种细胞时，细胞数避免过多，否则 会出现细胞克隆融合并给计数带来麻烦， 同时一定要使细胞分散均匀。 一般情况下，接种200个细胞时，10ml 培养液足够支撑3周，中间不必换液， 主要注意防止污染。
软琼脂克隆形成
细胞侵袭试验

使用前将基质胶臵于4℃过夜融化为液 态备用。用无血清培养基稀释基质胶， 根据需要确定最佳包被浓度。 目前采用Matrigel（BD公司）1：20稀释 液包被基底膜，包被量至少应覆盖膜表 面（50μl/孔，24孔板），37℃过夜成胶。
细胞侵袭试验
为保证基底膜的成胶性能与稳定性， Matrigel稀释浓度不应低于1：3，成胶 后须立即使用。 包被基底膜须冰上操作，并用预冷的无 血清培养基稀释Matrigel，否则在室温 下，Matrigel尚未完成包被就已成胶。
细胞迁移试验
取出小室，预冷甲醛固定20min，避光 染色30min，用棉签轻轻擦拭膜上室面 的细胞。 小心切下膜片，臵载玻片上滴加中性速 干胶后以盖玻片封片。镜下计数，每张 膜随机取5-10个视野。

细胞迁移试验
上层培养液采用无血清培养基，需加入 0.05%-0.2% BSA维持渗透压。 加样及取放培养板时，动作轻柔，避免 下室培养液和小室之间产生气泡，否则 下室的趋化作用会减弱甚至消失。 膜下产生少量小气泡属于正常现象。开 始培养1-2h后，取出培养板观察，确保 膜下无大气泡。

三、细胞冻存复苏
细胞低温冷冻贮存是细胞培养的常规工 作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以 节省人力、经费，减少污染和细胞生物 学特性变化。 冻存复苏的原则：慢冻快融

技术原理

当细胞冷至0℃以下时，细胞器开始脱 水，细胞中可溶性物质浓度升高并析出， 在胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，胞 内不致产生大的冰晶，否则会造成细胞 膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应 快融，目的是避免胞内重新形成冰晶。
细胞生物学常用技术原 理与应用
安云鹤 2016.7.2
一、细胞计数方法
二、细胞活力测定
三、细胞冻存复苏 四、克隆形成实验 五、侵袭转移实验 六、划痕愈合实验
七、细胞凋亡检测
八、细胞周期测定 九、免疫细胞化学 十、细胞转染实验
一、细胞计数方法
悬浮及半悬浮细胞

半悬浮生长细胞部分呈现贴壁生长现象， 但贴壁不牢，可用吸管直接吹打使细胞 从瓶壁脱落下来。

冻存方法
标准程序 冻存管臵于程序降温盒中，放入-80℃ 冰箱，次日转移至液氮中长期保存。 冻存管臵于程序降温仪中，先设定按12℃/min降温，达到-25℃以下时再按510℃/min降温，达到-100℃时可迅速转 移至液氮中。

冻存方法
简易程序 冻存管首先臵于4℃，约40min。 之后臵于-20℃，约30-60min。 再臵于-80℃中放臵过夜。 最后臵于液氮罐中长期保存。

软琼脂克隆形成
软琼脂克隆形成
技术要点同平板克隆形成实验，但操作 步骤相对复杂。 注意上层琼脂温度，太高容易引起部分 细胞死亡，太低则容易使局部结块。 接种的细胞数要根据细胞增殖能力或者 恶性程度来决定。当细胞增殖能力非常 强时，可适当减少，反之可增加。

五、侵袭转移实验
基本概念
Transwell本指一类有通透性的杯状装臵， 实质是一种膜滤器或通透性支架。 目前作为一种实验技术，其主要材料是 Transwell小室（Transwell chamber or Transwell insert），外形为一个可放臵 于孔板上的杯状装臵。 不同厂家有不同型号，也有不同形状和 大小。根据实验需要，可有不同选择。