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细胞生物学技术课件
数据显示：FCM的数据
显示方式包括单参数直 X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用
方图、二维点图、二维 等高图、假三维图和列
“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系 或对数关系
表模式等。
Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征 性细胞的频率
二 维 等 高 图
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
细胞生物学技术
—流式细胞仪 应 用： ❖ 目前流式细胞仪(FCM)已在各学科中获得应
用。
❖ 细胞生物学：定量分析细胞周期并分选不同 细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如 DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质 与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分 析，并可纯化X或Y染色体,等等。
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
细胞生物学技术
★流式细胞术 ★Western Blot ★蛋白质芯片
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
FALS Sensor
Fluorescence detector
+
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
细胞生物学技术
—流式细胞仪
细胞生物学重要技术
三、显微操作技术
• 在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作 的一种方法。 的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜 视野内移动的机械装置。 视野内移动的机械装置。 • 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、 胚胎移植以及显微切割等。 胚胎移植以及显微切割等。 –细 胞 核 移 植 技 术 已 有 几 十 年 的 历 史 ， Gordon 等 人 细 1962） 对非洲爪蟾进行核移植获得成功。 （ 1962 ） 对非洲爪蟾进行核移植获得成功 。 我国著名 学者童第周等上个世纪70 年代在鱼类细胞核移植方面 学者童第周等上个世纪 70年代在鱼类细胞核移植方面 70 进行了许多工作，并取得了丰硕成果。 进行了许多工作，并取得了丰硕成果。
（一）透射电子显微镜
1. 原理
• 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短， 波长与加速电压(通常50～120KV)的平方根成反比。 波长与加速电压(通常50～120KV)的平方根成反比。 50 KV)的平方根成反比 • 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、 真空系统、 统、电源系统等5部分构成。 电源系统等5部分构成。 • 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 分辨力0 nm，放大倍数可达百万倍。 • 用于观察超微结构 ， 即小于 0.2µm、 光学显微镜下无法看 用于观察超微结构， 即小于0 m 清的结构，又称亚显微结构。 清的结构，又称亚显微结构。
• 原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一 个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电 压（2mV~2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强 度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流 的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 • 分辨率：横向为0.1~0.2nm，纵向可达0.001nm。 • 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。
细胞生物学课件PDF 细胞生物学技术
戊二醛 CH2
C
O
H
包埋剂: 环氧树脂(万能胶)
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首页
不使用超薄切片的
透射电镜技术
负染法和投影法
负染法是在将颗粒和纤
维样品分散在具有亲水性支 撑膜的载网上以后，滴加磷 钨酸或醋酸双氧铀等染料， 并随即吸去多余的染液。样 品干燥后残余染料将沉积在 样品的周围以及样品的凹陷、 空隙处，而样品本身反而呈 浅色，故称为负染。
把放射性前体(例如3H-胸苷、14C-尿苷和
3H-亮氨酸分别是DNA、RNA和蛋白质合成的前
体)加到细胞中，使放射性前体与已存在的前体
分子混合，因为它们原子之间仅是原子核重量
不同，而化学性质相同，这样，细胞就以同样
方式对其产生反应。
蛋白质
3H-亮氨酸
细胞
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首页
2.3.3. 放射自显影技术
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首页 用超速离心机分离细胞器和大分子
用制备超速离心机可从细胞匀浆的混合物中分 离出细胞的各种组分。
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首页 离心级段
图解表示如何用递增的速 度反复离心、分离纯化细胞提 取液较小的细胞组分一般要求 巨大的离心力速度才能沉淀。 图中备个离心级段的典型数值：
低 速： 1000g l 0分钟 中 速： 2000g 20分钟 高 速： 80000g 1小时 超高速：150000g 3小时
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首页 复型和冷冻蚀刻技术
升华后，细胞内外
凡空隙处或含游离水较 多的地方将下陷，从而 除上述膜的脂质面外， 其他一些结构也被显示 出来，并进一步增强了 断面的浮雕效果。
细胞生物学技术[PPT课件]
![细胞生物学技术[PPT课件]](https://img.taocdn.com/s3/m/6748299f360cba1aa811da81.png)
优 点：
细胞生物学技术
—流式细胞仪
❖ 1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器 中，就会得出数据。
❖ 2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出 许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能 迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧 光标记细胞的比例。
❖ 3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和 细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静 止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰 ，又可 测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
-
Charged Plates
中；其它液体被当作废
液抽吸掉，某些类型的
仪器也有采用捕获管来
进行分选的。
Single cells sorted
into test tubes
FALS Sensor
Fluorescence detector
+
细胞生物学技术
—流式细胞仪
单参数直方图（Histogram）
数据处理原理：FCM的 数据处理主要包括数据 的显示和分析，至于对 仪器给出的结果如何解 释则随所要解决的具体 问题而定。
细胞生物学技术
—流式细胞仪 应 用：
❖ 目前流式细胞仪(FCM)已在各学科中获得应 用。
❖ 细胞生物学：定量分析细胞周期并分选不同 细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如 DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质 与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分 析，并可纯化X或Y染色体,等等。
细胞生物学技术
细胞生物学技术
—流式细胞仪
工作原理
流式细胞仪技术，主要是测 量群体中单个细胞经适当染 色后其成分所发出的散射光 和荧光，经染色的细胞在悬 液中以单行流过高强度光源 的焦点，当每个细胞经过焦 点时，发出一束散射光/或荧 光。它们经过过滤及光镜系 统收集到达一个光电检测器 (光电倍增管或一个固态装 置)，光检测器把散射光定量 转化成电信号，经数字转换 器进行数字化后而成整数， 然后进行电子存储，以后数 据可以调出显示和进行分析。 如左图所示。
细胞生物学技术
第二章细胞生物学技术细胞生物学的发展是与实验技术的进步密切相关的，细胞生物学的每一个重大进展都是由于引入了新的研究技术的结果。
光学显微镜的发明开创了细胞学，电子显微镜的出现使人们对细胞结结构的认识深入到超微结构水平。
细胞化学和分析细胞学技术可对细胞的各种成分进行定位和定量的分析，有利于细胞结构与功能的研究。
细胞培养技术可将细胞在体外环境中生长，在体外研究细胞的结构、功能和生命活动规律，而细胞工程技术则可人为地将细胞进行改造，以获得具有特定生物学特性的细胞。
近年来，分子生物学技术的广泛应用，更有力地推动了细胞生物学的发展。
细胞生物学技术种类很多，包括物理技术、化学技术和实验生物学技术等，本章仅对主要的细胞生物学技术作简略的介绍，对于在细胞生物学研究中广泛应用的分子生物学技术，由于篇幅有限，本书不作介绍了。
第一节显微镜技术显微镜技术是细胞学和细胞生物学得以建立和发展的重要工具，包括光学显微镜（light microscope）、电子显微镜(electron microscope )和扫描探针显微镜(scanning probe microscope)三个层次的显微镜和相应的技术。
在光学显微镜下看到的细胞结构称为细胞显微结构（microscopic structure），由于受到分辨率的限制，光学显微镜不能分辨直径小于0.2μm的结构，如生物膜、细胞骨架和一些细胞器等。
电子显微镜下则可以观察到这些光学显微镜下看不到的结构，称为细胞亚显微结构（submicroscopic structure）。
随着电子显微镜分辨率的不断提高，再结合一些其他技术如扫描探针显微镜和X光衍射等，己使人们对细胞结构的认识达到分子水平。
一般把细胞从亚显微水平到分子水平的结构统称为细胞超微结构（ultrastructure）。
图2-1显示了不同分辨率时所看到的拇指表皮结构，从大体、显微、亚显微、一直到分子、原子水平。
图2-1 细胞与原子比例图（引自Alberts等，2002）参照前书图2-1一、显微镜与分辨率人类最初只是用肉眼直接观察周围世界，可是人眼观察事物的能力是有限的，一般情况下在25cm的明视距离内，只能分辨相距0.1～0.2mm的两个物体，如果小于这一距离，人的眼睛就不能分辨。
细胞生物学研究技术
二、生物化学与分子生物学技 术
（一）、细胞化学技术
组织化学或细胞化学染色（histochemical or cytochemical staining）是利用染色剂可同细 胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种 成分进行定性或定位研究的技术。利用这种方 法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无 机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。
2 光镜标本的制备
以石蜡切片为例：
材料处理
固定 脱水
切片 染色
观察
包埋
染色剂：普通染色剂，荧光染色剂
3 光镜技术的应用 A 观察活细胞的形态结构，生命运动，
细胞周期。 B 细胞器的定位及功能研究。 C 基因产物与大分子物质的定位及定量。 D 监测细胞代谢活动。
例：胞内钙离子浓度的监测
钙是通用的第三信使，能特异地选 择性地调节细胞的活动，因此测定细胞 中钙离子浓度在空间和时间上的变化， 对于监控许多细胞的生理活动有重要作 用。如受精时，卵细胞突然定位地将钙 离子释放到胞浆中。
（五）、分子杂交技术
分子杂交技术（molecular hybridization） 是在研究DNA分子复性变化基础上发展 起来的一种技术。其原理是，具有互补 核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段， 在适当条件下，通过氢键结合，形成 DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交 的双链分子。这种技术可用来测定单链 分子核苷酸序列间是否具有互补关系。
D 倒置显微镜
组成和普通显微镜一样，只不过物 镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下， 后者在载物台之上，用于观察培养的活 细胞，具有相差物镜。
E 荧光显微镜
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫 外线照射后可发荧光；另有一些物质本 身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或 荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发 荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行 定性和定量研究的工具之一。
细胞生物学全套ppt课件
染色质与染色体的相 互转化及生物学意义
染色体的形态结构： 着丝粒、端粒、异染 色质等
DNA复制、转录和翻译
01
02
03
04
DNA复制的过程、特点及意 义
转录的过程、特点及意义
翻译的过程、特点及意义
基因表达的调控机制
05
细胞增殖与细胞周期
细胞增殖的方式与意义
细胞增殖的方式
真核细胞主要通过有丝分裂进行增殖 ，原核细胞则通过二分裂方式进行增 殖。
06
细胞分化与发育
细胞分化的概念及类型
细胞分化的概念
细胞分化是指在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳 定性差异的过程。
细胞分化的类型
包括稳定性分化和不稳定性分化。稳定性分化是指细胞在分化后，其形态、结构和功能长期保持相对 稳定；不稳定性分化则是指细胞在分化后，其形态、结构和功能仍可发生可逆性变化。
干细胞与再生医学的应用
干细胞的类型与特性
包括胚胎干细胞和成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能的特性。
再生医学的概念及应用
再生医学是利用干细胞、生长因子等生物活性物质，促进机体损伤组织的再生与修复的 新兴医学领域。其应用包括细胞治疗、组织工程和基因治疗等。
干细胞治疗的优势与挑战
干细胞治疗具有来源广泛、可塑性强、免疫原性低等优势，但也面临着安全性、有效性 和伦理等方面的挑战。
细胞组分分离技术
超速离心、层析、电泳等。
细胞生物学研究技术
基因编辑、细胞成像、蛋白质 组学等。
02
细胞膜与物质运输
细胞膜的结构与功能
细胞膜的基本结构
01
磷脂双分子层、膜蛋白等
细胞膜的功能
细胞生物学技术2011111
二甲苯：
最常用，易挥发，透明力强，能溶于 醇及醚，但不能与水混合，是石蜡的溶剂。 组织在二甲苯中透明的时间不宜过长，否则 易于收缩、变硬、变脆。故一般在浸入二甲 苯前，应先经二甲苯与酒精混合液，以减少 组织的收缩。
（五）、组织浸蜡与包埋
1. 浸蜡：组织经脱水、透明后，即进入已溶化 了的石蜡中，熔化的石蜡透过组织间隙，渗透 到组织中，然后包埋成组织蜡块。
组织透明
组织块经脱水后，需进行石蜡包埋，然后切片，但 酒精不能与石蜡混合，需经一种乙醇与石蜡之间的媒 介物进行透明，即透明剂。
透明剂 可取代组织中的乙醇 使组织透明，组织透 明后浸入石蜡中，石蜡可取代组织中的透明剂，浸入 组织中。 透明剂是石蜡的溶剂。 透明剂的种类：最常用的有二甲苯、甲苯、苯、香柏 油等。
生物素
酶
抗生物素
生物素标记一抗
标记抗生物素——生物素技术
酶标记抗生物素
生物素
酶
抗生物素
生 物 素 —— 抗 体 复合物
以抗生素为桥连接两个复合物
生 物 素 —— 酶 复
合物
桥式抗生物素-生物素技术（BRAB）
重症妊娠中毒症子宫蜕膜IGF-1的表达
重症妊娠中毒症绒毛膜IGF-1的表达
1 正常组织阴性对照
特制的包埋框
纸盒的制作
选蜡原则 包埋：以硬蜡为好。 夏天用溶点高的蜡（60-62℃）
冬天用稍软的蜡即可（56-58℃）
石蜡包埋的操作过程：
⑴ 组织浸蜡至第三号
3
蜡中
⑵ 装好金属包埋框
⑶ 包埋蜡置电炉上
溶化，到温度应控
制在65℃左右。
标
签
⑷ 点燃酒精灯，准备
无齿尖镊子，写好标
签；
细胞生物学技术
细胞生物学技术
1.可以直接观察和分辨单离子通道电流及其 开闭时程，使细胞信号的跨膜转导和细胞 分泌机制的研究更加直接。
2.能够区分离子通道的离子选择性，可以借 此技术发现新的离子通道。极大的推动了 细胞生物学的发展。
3.可以应用与药物开发和药理分析推动医学 进一步发展。
电泳技术
概念：电泳是指混悬于溶液中的样品电荷颗粒,在 电场影响下向着与自身带相反电荷的电极移动的 现象。
分离提纯一些微量物质，在医学诊断及刑 侦方面的应用广，具有准确操作简单等优 点。
在农业中应用于鉴别假冒伪劣种子，比之 传统的生态法鉴种，具有速度快，可靠性 强，成本少，不受环境影响等优点。
原理：一些基团在溶液中能吸收或者给出氢离子， 从而成为电荷粒子；又由于电荷粒子的多少不等 以及影响下，它们移动的速度 也不相同了。人们利用这种特性，用电泳的方法 对上述物质进行定性及定量分析，或者将一定的 混合物分离成。它是一项生物学研究中常用的技 术。
1.可以直接观察和分辨单离子通道电流及其 开闭时程，使细胞信号的跨膜转导和细胞 分泌机制的研究更加直接。
2.能够区分离子通道的离子选择性，可以借 此技术发现新的离子通道。极大的推动了 细胞生物学的发展。
3.可以应用与药物开发和药理分析推动医学 进一步发展。
电泳技术
概念：电泳是指混悬于溶液中的样品电荷颗粒,在 电场影响下向着与自身带相反电荷的电极移动的 现象。
分离提纯一些微量物质，在医学诊断及刑 侦方面的应用广，具有准确操作简单等优 点。
在农业中应用于鉴别假冒伪劣种子，比之 传统的生态法鉴种，具有速度快，可靠性 强，成本少，不受环境影响等优点。
原理：一些基团在溶液中能吸收或者给出氢离子， 从而成为电荷粒子；又由于电荷粒子的多少不等 以及影响下，它们移动的速度 也不相同了。人们利用这种特性，用电泳的方法 对上述物质进行定性及定量分析，或者将一定的 混合物分离成。它是一项生物学研究中常用的技 术。
细胞生物学技术
一、细胞分离和原代培养 二、培养细胞的传代 三、细胞计数 四、观察 五、细胞的冻存、复苏和运输 六、污染的检测和对策
一、细胞分离
细胞悬液：离心收集 细胞悬液： 组织块
1. 机械分散 2. 剪切分离 3. 消化分离 胰蛋白酶法 胶原酶法
二、培养细胞的传代 (subculture)
原代培养的首次传代 细胞传代方法
特征： 特征：失去原有形态，分化特性减弱
形态和功能趋于单一 一定代数后衰老死亡， 或发生转化， 获不死性而成为能无限传代
培养细胞的类型及其特点
1. 贴附型
贴附于支持物表面，生长中形成汇片。大 多数细胞属此型。失去在体内特有形态。
– 成纤维细胞型、上皮细胞型、游走型、多形型
2. 悬浮型 悬浮生长，单个分散或成团。各种源自血 液的细胞、骨髓、脾细胞。
一、细胞培养的基本概念 二、培养细胞的类型及其特点 三、培养细胞的增殖过程
细胞培养cell 细胞培养cell culture culture） （组织培养 tissue culture）概念
从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境， 从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境， 在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之 在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养， 生存和生长并维持其结构和功能的技术。 生存和生长并维持其结构和功能的技术。 始于20世纪初（1907年Harrison，1912年Carrel） 始于20世纪初（1907年Harrison，1912年Carrel） 世纪初 特点 1.条件可控：研究影响因素 1.条件可控：研究影响因素 2.体外： 可用各种手段研究 2.体外： 3.长期： 遗传性状 3.长期： 4.大量提供条件相同的细胞 4.大量提供条件相同的细胞
一、细胞分离
细胞悬液：离心收集 细胞悬液： 组织块
1. 机械分散 2. 剪切分离 3. 消化分离 胰蛋白酶法 胶原酶法
二、培养细胞的传代 (subculture)
原代培养的首次传代 细胞传代方法
特征： 特征：失去原有形态，分化特性减弱
形态和功能趋于单一 一定代数后衰老死亡， 或发生转化， 获不死性而成为能无限传代
培养细胞的类型及其特点
1. 贴附型
贴附于支持物表面，生长中形成汇片。大 多数细胞属此型。失去在体内特有形态。
– 成纤维细胞型、上皮细胞型、游走型、多形型
2. 悬浮型 悬浮生长，单个分散或成团。各种源自血 液的细胞、骨髓、脾细胞。
一、细胞培养的基本概念 二、培养细胞的类型及其特点 三、培养细胞的增殖过程
细胞培养cell 细胞培养cell culture culture） （组织培养 tissue culture）概念
从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境， 从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境， 在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之 在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养， 生存和生长并维持其结构和功能的技术。 生存和生长并维持其结构和功能的技术。 始于20世纪初（1907年Harrison，1912年Carrel） 始于20世纪初（1907年Harrison，1912年Carrel） 世纪初 特点 1.条件可控：研究影响因素 1.条件可控：研究影响因素 2.体外： 可用各种手段研究 2.体外： 3.长期： 遗传性状 3.长期： 4.大量提供条件相同的细胞 4.大量提供条件相同的细胞
细胞生物学2细胞生物学技术
2. 微量蛋白质的研究
真核细胞含有的几千种不同的蛋白，其中包括
一些相当重要的蛋白，它们的含量相当低，所以很
难，甚至不可能得到几微克的纯蛋白。从原理上，
重组DNA技术能制造出细胞中任何蛋白，其中包括 含量极少的蛋白，用以研究它们的结构和功能。
cDNA
蛋白质
细胞
3.基因打靶
第一步：是把含有已更改的突变体基因(或基因的一部分) 片段插入到载体，并引入到来自小鼠胚胎干细胞 的特殊细胞系；(胚胎干细胞，ES细胞)中。
应用：蛋白质鉴定
X射线衍射与核磁共振
在原子分辨水平上，发现 分子（其中包括蛋白质）的三 维结构的主要技术是X-射线衍 射。
X-射线衍射图上每个衍射 点的位置与强度反映出晶体中 原子的位置。所以可从衍射图 中推导出大分子的三维（空间） 结构。蛋白质的结晶工作要求 待测的蛋白质样品是非常纯的， 并且要找出得到结晶的适宜条 件。
LDLR gene
22号染色体
Multicolor Fluorescence in Situ Hybridization (mFISH)
each chromosome is painted in a different color
Multicolor Fluorescence in Situ Hybridization (mFISH)
蛋白质
3H-亮氨酸
细胞
2）. 放射自显影技术
显微放射自显影图
3）. 利用抗体示踪细胞分子
A. 抗体 + 荧光素 LM(免疫荧光显微镜)
B. 抗体 + 胶体金 EM(免疫电镜)
C.抗体＋酶 ELISA
酶 底物
显色
酶
四、重组DNA技术
细胞生物学第二章细胞生物学实验技术(共103张PPT)
距离最近两个光点的能力）为，扫描电镜的有效放 大倍率为。
Figure 3-23.
Scanning electron microscope（ SEM）
• 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出 次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探 测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出 与电子束同步的扫描图像。
度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针 尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距 离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可 显示出原子水平的凹凸形态。
• 分辨率：横向为，纵向可达。 • 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。
扫描隧道显微镜原理
• 分辨力，放大倍数可达百万倍； • 用于观察超微结构（小于）。
表二、不同光线的波长
名 称 可见光 紫外光 X 射线 α 射线
电子束
0.1Kv 10Kv
波长（nm） 390~760 13~390 0.05~13 0.005~1 0.123 0.0122
TEM LIGHT PATHWAY
电镜与光镜的比较
第二章 细胞生物学实验技术
METHODS AND TECHNIQUES
对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 细胞生命活动
突突变变体体分分析析 基因表达
序列测定
DNA分离与克隆 功能基因组学
蛋白修饰分析
生物信息学
多肽定性分析
机器人技术
(robotics)
双向电泳分析
蛋白质分离与制备
蛋白质组学
（sc三an）nin扫g•描tu隧nn道进eli显ng微入m镜ic显rosc微ope，镜ST的M 光线为偏振光，镜筒中有检偏器 （与起偏器
Figure 3-23.
Scanning electron microscope（ SEM）
• 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出 次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探 测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出 与电子束同步的扫描图像。
度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV~2V），针 尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距 离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可 显示出原子水平的凹凸形态。
• 分辨率：横向为，纵向可达。 • 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。
扫描隧道显微镜原理
• 分辨力，放大倍数可达百万倍； • 用于观察超微结构（小于）。
表二、不同光线的波长
名 称 可见光 紫外光 X 射线 α 射线
电子束
0.1Kv 10Kv
波长（nm） 390~760 13~390 0.05~13 0.005~1 0.123 0.0122
TEM LIGHT PATHWAY
电镜与光镜的比较
第二章 细胞生物学实验技术
METHODS AND TECHNIQUES
对细胞生命活动的研究成为当今生命科学发展的瓶颈 细胞生命活动
突突变变体体分分析析 基因表达
序列测定
DNA分离与克隆 功能基因组学
蛋白修饰分析
生物信息学
多肽定性分析
机器人技术
(robotics)
双向电泳分析
蛋白质分离与制备
蛋白质组学
（sc三an）nin扫g•描tu隧nn道进eli显ng微入m镜ic显rosc微ope，镜ST的M 光线为偏振光，镜筒中有检偏器 （与起偏器
细胞生物学常用技术
MTT法
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以将 MTT还原成不溶于水的蓝紫色结晶产物 formazan （甲瓒），幵沉淀在细胞中， 而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解 沉积的甲瓒，溶液颜色深浅与其含量成 正比，可用酶标仪测定OD值。 MTT法广泛应用于新药筛选、细胞毒性、 肿瘤放射敏感性实验等。
细胞侵袭试验
使用前将基质胶置于 4 ℃过夜融化为液 态备用。用无血清培养基稀释基质胶， 根据需要确定最佳包被浓度。目前多采 用50mg/L Matrigel 1:8稀释液。 包被基底膜：稀释的基质胶的包被量至 少覆盖膜表面，4℃风干1h。 水化基底膜：去除未结合的基质胶，加 入无血清培养基，37℃孵育30min。
四、兊隆形成实验
平板兊隆形成
适用于检测单个贴壁生长细胞形成兊隆 的能力，从而反应细胞增殖状冴。 对于肿瘤细胞来说，兊隆形成能力越高 则反应其恶性程度越高。 两个指标反应细胞增殖能力：①兊隆形 成率；②兊隆大小。
平板兊隆形成
每平皿（D=60mm）接种100-200个细 胞，补加培养液至10ml，≥3平皿/组。 十字形晃动使细胞分散均匀，常觃培养 2-3 周（当出现肉眼可见的兊隆时终止 培养），弃培养液，PBS洗涤2次。 甲醇固定 15min ，姬姆萨染色 20min ， 自来水冲洗，空气干燥。 计数肉眼可见的兊隆数。兊隆形成率 = （兊隆数/接种细胞数）×100%。
冻存方法
快冻程序 冻存管（管口要朝上）放入纱布袋内， 纱布袋系以线绳。 通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口， 按 1-2℃/min 速度降温 ， 在 30-40min 内降至液氮表面，停30min后直接投入 液氮中。
复苏方法
从液氮中取出冻存管，迅速投入37℃水 浴幵不断摇晃，使管中的液体快速融化。 在 5min 内将细胞悬液转移至培养瓶内， 补充适量的预热的新鲜培养液。
细胞生物学课件第三章细胞技术ppt文档
• R = 0.61λ / N．A．
– 其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率 ＝ｎsinα/2，
n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。
• 如何提高显微镜的分辨能力？
表一、几种介质的折射率
介质 空气 水 香柏油 α 溴萘 折射率 1 1.33 1.515 1.66
• 显微镜的几个光学特点：
透射电子显微镜
表二、不同光线的波长
名 称 可见光 紫外光 X 射线 α 射线
电子束
0.1Kv 10Kv
波长（nm） 390~760 13~390 0.05~13 0.005~1 0.123 0.0122
2、制样技术
1）超薄切片 • 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅
50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制 作。 • 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂 包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅） 盐染色。
简单的比较显微镜可由两台普通显微镜加一个 可共享两台显微镜物镜的目镜系统（比较桥）组成。
专业的比较显微镜采用一体化结构，光学系统、 载物台等依照特殊需求进行专门设计，功能十分强 大。
• 比较显微镜是刑侦技术、检 察技术和法医鉴定的主要科 学技术手段之一，在比较显 微镜里，一颗子弹的两截可 以在同样的镜头下连成一体， 使得观察者可以借两者的异 常靠近来比较分析每颗子弹 上的痕迹。近年来在化学、 物理、冶金、医药、材料、 环境、微电子研究等方面也 有广泛应用。
• 物镜与照明系统颠倒，前 者在载物台之下，后者在 载物台之上，用于观察培 养的活细胞，通常具有相 差物镜，有的还具有荧光 装置。
（九）比较显微镜
属特种显微镜：用一组目镜同时观察到左右两 个光学系统物方物体的像。并通过对接、切割、重 叠、旋转等手段，对两个或两个以上物体进行宏观 或微观上的比较，以检查、分析和鉴别它们的微小 差别：形式、组织、结构、色彩或材料。
– 其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率 ＝ｎsinα/2，
n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角） 。
• 如何提高显微镜的分辨能力？
表一、几种介质的折射率
介质 空气 水 香柏油 α 溴萘 折射率 1 1.33 1.515 1.66
• 显微镜的几个光学特点：
透射电子显微镜
表二、不同光线的波长
名 称 可见光 紫外光 X 射线 α 射线
电子束
0.1Kv 10Kv
波长（nm） 390~760 13~390 0.05~13 0.005~1 0.123 0.0122
2、制样技术
1）超薄切片 • 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅
50nm的超薄切片，用超薄切片机（ultramicrotome）制 作。 • 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂 包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅） 盐染色。
简单的比较显微镜可由两台普通显微镜加一个 可共享两台显微镜物镜的目镜系统（比较桥）组成。
专业的比较显微镜采用一体化结构，光学系统、 载物台等依照特殊需求进行专门设计，功能十分强 大。
• 比较显微镜是刑侦技术、检 察技术和法医鉴定的主要科 学技术手段之一，在比较显 微镜里，一颗子弹的两截可 以在同样的镜头下连成一体， 使得观察者可以借两者的异 常靠近来比较分析每颗子弹 上的痕迹。近年来在化学、 物理、冶金、医药、材料、 环境、微电子研究等方面也 有广泛应用。
• 物镜与照明系统颠倒，前 者在载物台之下，后者在 载物台之上，用于观察培 养的活细胞，通常具有相 差物镜，有的还具有荧光 装置。
（九）比较显微镜
属特种显微镜：用一组目镜同时观察到左右两 个光学系统物方物体的像。并通过对接、切割、重 叠、旋转等手段，对两个或两个以上物体进行宏观 或微观上的比较，以检查、分析和鉴别它们的微小 差别：形式、组织、结构、色彩或材料。
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