细胞生物学技术[PPT课件]

优 点：
细胞生物学技术
—流式细胞仪
❖ 1、具有操作简便，只要将染色的单个细胞推入仪器 中，就会得出数据。
❖ 2、具有较高的灵敏度及测定速度，而且每次可测出 许多数据，一般情况下，每秒可测5000个细胞，能 迅速分析和记数大量细胞，并能准确统计群体中荧 光标记细胞的比例。
❖ 3、应用广泛，即可用于测定细胞活力、繁殖周期和 细胞定型分析，也可区别死亡细胞、分裂细胞和静 止细胞群，既可测定DNA和RNA、测凋亡峰 ，又可 测蛋白含量，特别是胞浆蛋白。
-
Charged Plates
中；其它液体被当作废
液抽吸掉，某些类型的
仪器也有采用捕获管来
进行分选的。
Single cells sorted
into test tubes
FALS Sensor
Fluorescence detector
+
细胞生物学技术
—流式细胞仪
单参数直方图（Histogram）
数据处理原理：FCM的 数据处理主要包括数据 的显示和分析，至于对 仪器给出的结果如何解 释则随所要解决的具体 问题而定。
细胞生物学技术
—流式细胞仪 应 用：
❖ 目前流式细胞仪(FCM)已在各学科中获得应 用。
❖ 细胞生物学：定量分析细胞周期并分选不同 细胞周期时相的细胞；分析生物大分子如 DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质 与细胞增殖周期的关系，进行染色体核型分 析，并可纯化X或Y染色体,等等。
细胞生物学技术
细胞生物学技术
—流式细胞仪
工作原理
流式细胞仪技术，主要是测 量群体中单个细胞经适当染 色后其成分所发出的散射光 和荧光，经染色的细胞在悬 液中以单行流过高强度光源 的焦点，当每个细胞经过焦 点时，发出一束散射光/或荧 光。它们经过过滤及光镜系 统收集到达一个光电检测器 (光电倍增管或一个固态装 置)，光检测器把散射光定量 转化成电信号，经数字转换 器进行数字化后而成整数， 然后进行电子存储，以后数 据可以调出显示和进行分析。 如左图所示。
细胞生物学技术
★流式细胞术 ★Western Blot ★蛋白质芯片
细胞生物学技术
—流式细胞仪
流式细胞仪 （Flow Cytometer，FCM)
流式细胞仪
是将流体喷射技术、激光技术、 空气技术、γ射线能谱术及电子计 算机等技术与显微荧光光度计密 切结合的一种非常先进的检测仪 器。通过测量细胞及其他生物颗 粒的散射光和标记荧光强度，来 快速分析颗粒的物理或化学性质， 并可以对细胞进行分类收集，可 以高速分析上万个细胞，并能同 时从一个细胞中测得多个细胞特 征参数，进行定性或定量分析， 具有速度快、精度高、准确性好 等特点。
Fluorescence Activated Cell Sorting
流式细胞计的分选功能 是由细胞分选器来完成 的。
总的过程是：由喷嘴射
488 nm laser
出的液柱被分割成一连
串的小水滴，根据选定
的某个参数由逻辑电路
判明是否将被分选，而
后由充电电路对选定细
胞液滴充电，带电液滴 携带细胞通过静电场而 发生偏转，落入收集器
细胞生物学技术
结构组成：
除以下四个主要部分 外，还备有电源及压 缩气体等附加装置。
—流式细胞仪
流式细 胞仪
流动室和 激光源和 光电管和 计算机和 液流系统 光学系统 检测系统 分析系统
细胞生物学技术
—流式细胞仪
流动室和液流系统
流动室由样品管、鞘液管和喷嘴 等组成，常用光学玻璃、石英等 透明、稳定的材料制作。设计和 制作均很精细，是液流系统的心 脏。样品管贮放样品，单个细胞 悬液在液流压力作用下从样品管 射出；鞘液由鞘液管从四周流向 喷孔，包围在样品外周后从喷嘴 射出。为了保证液流是稳液，一 般限制液流速度υ<10m/s。由于 鞘液的作用，被检测细胞被限制 在液流的轴线上。流动室上装有 压电晶体，受到振荡信号可发生 振动。
—流式细胞仪
例如流式细胞仪检测细 胞凋亡—Annexin V/PI 双染色法
Annexin V/PI标记染色：
数据显示：FCM的数据
显示方式包括单参数直 X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用
方图、二维点图、二维 等高图、假三维图和列
“通道数”表示，可以与光强度之间线性关系 或对数关系
表模式等。
Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征 性细胞的频率
二 维 等 高 图
3D Plot 二维点图Dot Plot
液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱
细胞生物学技术
—流式细胞仪 光电管和检测系统
光电倍增管（PMT）
细胞生物学技术
—流式细胞仪
光电管和检测系统
经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转 变成电信号而进行测量的。光电倍增管（PMT）最为常用。PMT的响应 时间短，仅为ns数量级；光谱响应特性好，在200～900nm的光谱区， 光量子产额都比较高。光电倍增管的增益从10到10可连续调节 ，因此 对弱光测量十分有利。光电管运行时特别要注意稳定性问题，工作电压 要十分稳定，工作电流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；最大阳极 电流在几个毫安。此外要注意对光电管进行暗适应处理，并注意良好的 磁屏蔽。在使用中还要注意安装位置不同的PMT，因为光谱响应特性不 同，不宜互换。 从PMT输出的电信号仍然较弱，需要经过放大后才能输入分析仪器。流 式细胞计中一般备有两类放大器。一类是输出信号辐度与输入信号成线 性关系，称为线性放大器。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号 以及代表生物学线性过程的信号，例DNA测量等。另一类是对数放大器， 输出信号和输入信号之间成常用对数关系。
细胞生物学技术
计算机和分析系统
—流式细胞仪
细析器。多道的道数是和电 信号的脉冲高度相对应的，也 是和光信号的强弱相关的。对 应道数年纵坐标通常代表发出 该信号的细胞相对数目。多道 分析器出来的信号再经模-数转 换器输往微机处理器编成数据 文件，或存贮于计算机的硬盘 和软盘上，或存于仪器内以备 调用。计算机的存贮容量较大， 可存贮同一细胞的6～8个参数。 存贮于计算机内的数据可以在 实测后脱机重现，进行数据处 理和分析，最后给出结果。