链霉素发酵提取工艺

中罐种子 大罐发酵液
提炼车间
培养方式

斜面孢子培养


摇瓶种子培养
种子罐扩大培养
发酵培养
(一)斜面孢子培养
将砂土管 ( 或冷冻管 ) 菌种接种到斜面培养基上，经培
养后即得原始斜面。
斜面培养基的主要成分有葡萄糖、蛋白胨和豌豆浸汁
等，其中蛋白胨和豌豆浸汁的质量对斜面孢子质量影响很
大。蛋白胨是最关键的原材料，对产孢子数量的影响不容 忽视。豌豆的品种和产地以及培养基的pH值(以中性或偏酸 性为宜)对产孢子质量亦有影响，需特别注意。
链霉素的提取和精制

1.发酵液的过滤及预处理 2.吸附与解吸附

3.精制
链霉素的提取和精制过程
吸附 洗脱
发酵液
洗脱液
过滤 脱色 中和 精制
原液
脱色
饱和树脂
精制液
浓 缩 成品浓缩液
水针剂
粉针剂
1．发酵液的过滤及预处理
发酵终了时，所产生的链霉素，有一部分是与菌丝体相
结合的。用酸、碱或盐作短时间处理以后，与菌丝体相结
(2)氮源
有机氮源包括黄豆饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、酵母粉和麸
质水，其中以黄豆饼粉为最佳。无机氮源以硫酸铵和尿素
为最常用，氨水可作无机氮源使用，又可调节发酵 pH 。采 用黄豆饼粉浸液(pH6.0，38—40℃处理2h)作为氮源，其发 酵单位高峰出现比未处理者为早，这说明可溶性氮比不溶 性氮易于利用，对缩短周期有好处。
斜面孢子(代1)
摇瓶种子 小罐种子
小罐种子培养36±0.5℃，24-30h转速60-300rpm， 搅拌功率5.5kw通气量2m3/min,罐压0.03Mpa 中罐种子培养36±0.5℃，25h转速60-240rpm接种 量15%通气量1.5VVM罐压0.03Mpa搅拌功率22kw 大罐发酵36±0.5℃，136h转速60-130rpm接种量 15%通气量0.75VVM罐压0.04Mpa搅拌功率115kw
明显作用。Fe2+浓度超过60ug／mg以上，就要产生毒性，显
著影响链霉素的产量，而对菌丝体生长影响较小，一般适 用量在20ug／ul左右。
3．链霉素的发酵条件及中间控制
(1)通气和搅拌：灰色链霉菌是一种高度需氧菌。 在黄豆饼粉培养基内增加通气量能提高发酵单位， 又能使pH升高。 (2)温度：灰色链霉菌对温度敏感。一般认为链霉素 发酵温度以28．5℃左右为宜。
(三)种子罐扩大培养
种子罐培养是用来扩大种子量的。种子罐培养为1—3级，
可根据发酵罐的体积大小和接种量来确定。第一级种子罐
一般采用摇瓶种子接种， 2—3 级种子罐则是逐级转移，接 种量一般都为 10 ％左右。种子质量对后期发酵的影响甚大， 因此种子必须符合各项质量要求。故在培养过程中，必须 严格控制好罐温、通气搅拌和泡沫控制，以保证菌丝生长
差。各组链球菌、铜绿假单胞菌和厌氧菌对该品耐药。链霉
素主要与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质的合成。 细菌与链霉素接触后极易产生耐药性。链霉素和其他抗菌药 物或抗结核药物联合应用可减少或延缓耐药性的产生 也用于 结核病的二线治疗，多与其它抗结核药合用。
链霉素研究现状
链霉素(Streptomycin)是1944年发现的第一个氨基糖贰类
理，进一步除去蛋白质，或者直接用 NaOH 凋 pH 值至 6.7— 7.2。
原滤液的质量标准一般是：①外观澄明；②pH＝6.7—7.2；③
温度在10℃以下；④高价离子含量很少；⑤链霉素浓度为5000U／ml
左右。 根据链霉素的稳定性、解离度和树脂的离解度，选择原滤液 pH 值为中性附近，即pH＝7左右，既可保证链霉素不受破坏，又能使链 霉素和钠型羧基树脂全部解离，有利于离子交换。为防止链霉素破坏， 温度应适当降低，维持在10℃左右,原液中高价离子(Ca2+，Mg2+)对离 子交换吸附影响很大，因此必须在发酵液预处理时将这些离子除掉。 草酸能将Ca2+去除掉。一些配合剂如三聚磷酸钠 (Na5P3O10)，能和Mg2+ 形成络合物，减少树脂对Mg2+的吸附。
双氢链霉素
链霉素
硫酸链霉素
5-(2,4-diguanidino-3,5,6-trihydroxy-cyclohexoxy)- 4-[4,5dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-methylamino-tetrahydropyran-2-yl] oxy-3-hydroxy-2-methyl-tetrahydrofuran-3-carbaldehyde
兰、印度、保加利亚、西班牙等国家的一些公司。

国内链霉素相关情况
链霉素是我国较早投入生产的抗生素之一。生产企业曾有
十几家，包括杭州药厂、扬州制药厂等。近几年仅剩华北制药
厂等五家药厂生产。近十年来，我国链霉素的年产量一直维持 在1000吨以上，国内产量最大的是华北制药厂，年产量在650 吨左右，其次是大连制药厂和山东济宁坑生素厂，年产量均在 200-250吨左右。
(3)其他无机离子
在复合培养基中已经存在，一般就不需再添加。为了
调节pH，中和代谢过程中所产生的有机酸，尚需加人CaCO3。
Co+是一种酶的激活剂，又是生物合成维生素B12的前体，通 常需加入极微量， K+有促进生长的作用，Na+ 与维持细胞渗 透压有关，通常加入 0.25 ％左右量的 NaCl 即可，增加用量 会明显影响菌的生长繁殖。Mn2+、Mg2+对链霉菌菌丝生长有
(二)摇瓶种子培养
生产斜面的菌落接种到摇瓶培养基中，经过培养即
得摇瓶种子。链霉素发酵经常使用：瓶种子来接种种子 罐。种子质量以菌丝阶段、发酵单位、菌丝黏度或浓度、 糖氮代谢、种子液色泽和无杂菌检查为指标。摇瓶种子 (母瓶)可以直接接种子罐，也可以再扩大培养，用培养 所得的子瓶接种。摇瓶种子检查合格后，贮存于冷藏库 内备用，冷藏时间最多不超过7天。
(3)pH：适合链霉菌菌丝生长的pH6.5—7.0，适合于 链霉素合成的pH为6.8—7.3，pH低于6.0或高于7.5， 对链霉素的生物合成都不利。 （4)中间补料控制：为了延长发酵周期，提高产量， 链霉素发酵采用中间补碳、氮源，通常补加葡萄糖、 硫酸铵和氮水，这样还能调节发酵的pH。根据耗糖 速率，确定补糖次数和．补糖量。
合的大部分链霉素就能释放出来。工业上，常采用草酸或 磷酸等酸化剂处理，以草酸效果较好，可用草酸将发酵液 酸 化 至 pH ＝ 3 左 右 ， 直 接 蒸 汽 加 热 (70 － 75℃) ， 维 持 2min( 这样能使蛋白质凝固，提高过滤速度 ) ，迅速冷却、
过滤或离心分离。过滤后，所得酸性滤液也可进行碱性处
抗生素，也是继青霉素后的第二个重要抗生素一般认为链霉素
是治疗结核杆菌感染的首选药物，除此以外，还用于治疗革兰 氏阴性菌所引起的泌尿道感染、结核性脑膜炎、鼠疫、肠道感 染、肺炎、败血症、百日咳等。链霉素的缺点是容易产生耐药 性，长期使用对第八对脑神经有毒害。

除了医用外，也有报道将链霉素用
于农牧业的。例我国新疆某生产建设兵
发酵单位 30000-40000 a/ml, 但发酵周期比我国长 1
倍);提炼效率高于葛兰素公司，我国处于领先水平。
谢
谢
！
良好，得到合格的种子。
(四)发酵培养
链霉素的发酵培养基主要由葡萄糖、黄豆饼粉、硫酸铵、 玉米浆、磷酸盐和碳酸钙等所组成。
(1)碳源及其代谢
葡萄糖是链霉素发酵的一种较好的碳源，用其 他碳源(如淀粉、糊精、麦芽糖等)发酵单位都比葡 萄糖低。葡萄糖的用量，视补料量的多少而定，总 量一般在10%以上，以保证在发酵过程中有足够的 碳源.
其中主要的公司有美国的默克 (Merck)公司、辉瑞(Pfizer)公
司、施贵宝 (Squibb)公司，英国的格兰素 (Glaso)公司、比彻 姆 (Beecham) 公 司 ， 德 国 的 赫 斯 (Hoechst) 公 司 ， 法 国 的 罗 纳·普朗克 (Rhone Poulenc) 公司，丹麦的挪佛 (Novo) 公司， 日本的协和(Kyowa)发酵株式会社等等。此外还有原苏联、荷
链霉素产品存在的问题

由于链霉素的耳毒性较严重，世界各国的产量 和使用量呈逐年下降趋势。如原苏联1976年链霉素 的产量达1415吨，1987年降为600吨，1989年为800 吨左右。美国施贵宝公司和匈牙利的诺因工厂先后 于1977年和1980年停产。目前国外链霉素的主要生 产企业是美国的辉瑞公司和法国的罗纳·普朗克公 司。目前全世界链霉素产量估计在2500吨至3000吨 左右。
链霉素的发酵工艺
链霉素结构的图片
1、概 述
链霉素（ streptomycin ）是一种氨基葡萄糖型抗生素， 分子式C21H39N7O12。 1943 年美国 S.A. 瓦克斯曼从链霉菌中分离得到，是 继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素。它的抗结核 杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。从此，结 核杆菌肆虐人类生命几千年的历史得以有了遏制的希望。
灰色链霉菌的孢子柄直而短，不呈螺旋形。 孢子量很多，呈椭圆球形。气生菌丝和孢子都呈 白色。单菌落生长丰满，呈梅花形或馒头形，直 径约为3～4mm。基内菌丝透明，在斜面背后产生 淡棕色色素。 链霉素产生菌诱变育种常用的诱变剂有：紫外 线、γ射线、氮芥、乙烯亚胺、亚硝酸和硫酸二乙 酯等。一些化学诱变剂又经常和紫外线等进行复 合处理。近年来采用亚硝基胍、快中子和激光等， 诱变选育出营养缺陷型或再回复突变型高产菌株。 杂交育种与诱变育种相结合的方法，对提高菌种 的生产能力，收到了较好的效果。
高交联度的氢型磺酸树脂的结构紧密，金属小
离子可以自由地扩散到孔隙度很小的树脂内部与阳 离子交换，而有机大离子就难于扩散到树脂内部进 行交换。
经过高交链度树脂交换后，交换液变酸，需经弱碱羟型
树脂中和，就得精制液。其反应方程式如下。
国外链霉素产品相关公司
国外生产链霉素的有近二十个国家的约三十家制药公司。
性状：
白色或类白色粉末，无臭或微臭。
溶解情况：
易溶于水，微溶于乙醇，不溶于甲醇、氯仿和丙酮。
作用范围： 硫酸链霉素为一种氨基糖苷类抗生素。 链霉素对结核分枝杆菌有强大抗菌作用， 其最低抑菌浓度一般为0.5mg/ml。非结核 分枝杆菌对该品大多耐药。
链霉素对许多革兰阴性杆菌如大肠埃希菌、肠杆菌属、 沙门菌属等也具抗菌作用；脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌亦对 该品敏感。链霉素对葡萄球菌属及其他革兰阳性球菌的作用
实验室涂片结果
灰 色 链 霉 菌 生 长 状 态
液氮保藏(-196℃)
或
沙土管保藏(2-4℃)
2.工 艺 流 程
Biblioteka Baidu
斜面培养恒温恒湿35-36℃，7天
原斜面孢子
斜面培养恒温恒湿34-35℃，6天 摇瓶培养33-34℃，39.5h转速250rpm 装量80ml/750ml接种量一块斜面/瓶50-64h

产品质量
目前国内所有链霉素生产企业都能达到出口标准，一般认
为华北制药与上海第四制药厂的质量相对较好。链霉素质量方
面的共性间题是:成品色级达不到新优级品标准，异常毒性偏
高，生物效价偏低，澄明度不符合标准等。
国内外技术水平比较
我国链霉素生产量居世界前列。生产技术指标中，
发酵水平与英、美公司比略显落后 (英国葛兰素公司
团的农场自1985年起应用链霉素治疗菜 类、瓜类和粮食等作物的病害，取得较
好效果 ; 链霉素还可用于猪肺炎、雏鸡
白痢疾、以及鸡、鸭、鹅的巴氏杆菌感 染等的治疗。国内有些厂家将生产的链
霉素作为农用出口，效益较好。
1.生产菌种
2.工艺流程
3.链霉素的发酵条件及中间控制
1、生产菌种
早期发现产链霉素的生产菌种是灰色链霉菌。 后来 又找到了产链霉素的其他类型链霉素族抗生素(如羟基链霉 素或双氢链霉素)的菌种。 如比基尼链霉菌、灰肉链霉菌 等。
2.吸附与解吸附
链霉素在中性溶液中呈三价的阳离子，可以用 阳离子交换树脂吸附。试验表明，磺酸型树脂虽能吸 附链霉素，但二者的亲和力太强，不易用酸洗脱下来。 羧酸型树脂吸附链霉素后，很容易洗脱。因此，目前 生产上都用羧酸树脂的钠型来提取链霉素。其交换吸 附和洗脱的反应可用下列方程式表示：
3.精制
高交联度树脂精制