热点实验：PKC蛋白激酶活性检测实验
重大突破！治疗肝癌新可能，抑癌分子新发现—蛋白激酶PKCλi
重大突破！治疗肝癌新可能，抑癌分子新发现—蛋白激酶PKCλi一、肝癌和基因突变有关肝癌目前仍是世界范围内最能对人类健康构成威胁的一种恶性肿瘤。
由于其主要诱因是HBV等肝炎病毒的慢性感染，因此，很多人每天都在惊惧中度过。
肝癌具有早期发现难、恶性程度高以及术后复发率高、5年生存率低等令人闻风丧胆的特征，因此很多乙肝战友谈虎色变。
除了HBV等肝炎病毒的慢性感染，非酒精性脂肪性肝病、酒精性脂肪肝、黄曲霉素的摄入等都是肝癌的危险因素。
然而，很多人不知道的是，肝癌的起源其实跟我们自身的一些基因突变有关。
如果这些基因突变确定了，科学家们根据突变基因的特征设计治疗方案，也是肝癌治疗的思路之一。
二、抑癌蛋白分子PKC λ/i今年来自美国国家癌症研究所的Jorge教授发现了一种蛋白激酶PKC λ/i，并证明该种分子可以作为肿瘤抑制因子阻碍肿瘤的生长和扩散。
该分子已被证明在结肠癌中起抑癌作用。
氧化应激在肝组织损伤和肝细胞癌（HCC）的发生和发展中起着重要作用。
然而，在活性氧（ROS）生成过程中调节自噬和代谢重编程的机制，以及活性氧如何促进肿瘤发生，仍需充分了解。
该文发现肝细胞中蛋白激酶C（PKC）λ/ι的丢失促进了自噬和氧化磷酸化。
这导致活性氧的产生，通过NRF2通过细胞自主和非自主机制驱动该细胞癌。
尽管PKCλ/ι在癌基因驱动的癌症模型中促进肿瘤发生，但新的证据表明，它在更复杂的致癌过程中是一种肿瘤抑制因子。
一直以来，PKCλ/ι水平与HCC的组织学肿瘤分级呈负相关，证明这种激酶在肝癌中是一种肿瘤抑制因子。
为了获得能量，肝癌细胞需要消耗葡萄糖和脂肪，这2个过程导致了一种名为“NRF2蛋白”的激活，这种蛋白可以驱动肿瘤的生长。
研究人员发现，PKCλ/ι可以阻碍上述的代谢过程，从而使肿瘤组织变得更没有侵略性。
研究人员通过观察肝癌小鼠模型以及人类肝癌样本确定了上述猜想。
即PKCλ/ι在非肿瘤组织中的低表达与肿瘤组织侵袭性降低有关。
2024年高考生物复习专题题型归纳解析—情境信息类
2024年高考生物复习专题题型归纳解析—情境信息类情境信息类题是生物学考试中的热门题型,《中国高考评价体系》中提到,考生应当能够客观全面地获取可相关信息,能够从情境中提取有效信息。
获取信息的能力主要包括:(1)从提供的材料中获取相关的生物学信息、加工处理信息、转换信息、交流信息的能力;(2)关注对科学、技术和社会发展有重大影响的、与生命科学相关的突出成就及热点问题。
情境信息类题目主要包括:文字信息类、曲线图信息类、柱形图信息类、表格信息类和过程模式图信息类。
这些题目往往具有一定的难度，做这类题时重点是提取新信息，将其与教材的知识进行结合、转化、分析。
其特点可概括为“新情境、旧知识”。
所以这种题型往往是高起点、低落点。
【题型1】文字信息类【典例分析1】（2023·河北·统考高考真题）拟南芥发育早期的叶肉细胞中，未成熟叶绿体发育所需ATP须借助其膜上的转运蛋白H由细胞质基质进入。
发育到一定阶段，叶肉细胞H基因表达量下降，细胞质基质ATP向成熟叶绿体转运受阻。
回答下列问题：(1)未成熟叶绿体发育所需ATP主要在合成，经细胞质基质进入叶绿体。
(2)光照时，叶绿体类囊体膜上的色素捕获光能，将其转化为ATP和中的化学能，这些化学能经阶段释放并转化为糖类中的化学能。
(3)研究者通过转基因技术在叶绿体成熟的叶肉细胞中实现H基因过量表达，对转H基因和非转基因叶肉细胞进行黑暗处理，之后检测二者细胞质基质和叶绿体基质中ATP相对浓度，结果如图。
相对于非转基因细胞，转基因细胞的细胞质基质ATP浓度明显。
据此推测，H基因的过量表达造成细胞质基质ATP被（填“叶绿体”或“线粒体”）大量消耗，细胞有氧呼吸强度。
(4)综合上述分析，叶肉细胞通过下调阻止细胞质基质ATP进入成熟的叶绿体，从而防止线粒体，以保证光合产物可转运到其他细胞供能。
【答案】(1)线粒体（或“线粒体内膜”）(2) NADPH（或“还原型辅酶Ⅱ”）暗反应（或“卡尔文循环”）(3) 降低叶绿体升高(4) H基因表达（或“H蛋白数量”）过多消耗光合产物（或“有氧呼吸增强”）【分析】由题干可知，拟南芥发育早期的叶肉细胞中，未成熟叶绿体发育需要来自细胞质基质的ATP，ATP是细胞中的直接能源物质，主要细胞呼吸和光合作用产生，其中细胞呼吸产生的ATP可以用于各种生命活动，因此未成熟的叶绿体发育所需的ATP来自细胞呼吸，细胞有氧呼吸产生大量ATP，有氧呼吸的场所主要在线粒体，因此细胞线粒体产生大量ATP通过叶绿体膜上的H蛋白转运至叶绿体促进其发育。
专题02光合作用与呼吸作用相关实验探究(原卷版)【实验攻略】备战2024年高考生物热点实验分析与预测
专题02 光合作用与呼吸作用相关实验探究目录导航一、真题考法归纳考法01 借助细胞呼吸的影响因素考查科学思维考法02 借助细胞呼吸的原理与应用考查社会责任考法03 借助光合色素考查生命观念考法04 借助光合作用因素考查科学探究新考法借助光合作用和呼吸作用的关系考查社会责任二、常考热点实验梳理三、实验热点专练四、实验命题预测TTC法检测种子活力，TTC（无色）进入活细胞后可被[H]还原成TTF（红色）。
大豆充分吸胀后，取种胚浸于0.5%TTC溶液中，30℃保温一段时间后部分种胚出现红色。
下列叙述正确的是（）A．该反应需要在光下进行B．TTF可在细胞质基质中生成C．TTF生成量与保温时间无关D．不能用红色深浅判断种子活力高低2．（2021·湖南·统考高考真题）下列有关细胞呼吸原理应用的叙述，错误的是（）A．南方稻区早稻浸种后催芽过程中，常用40℃左右温水淋种并时常翻种，可以为种子的呼吸作用提供水分、适宜的温度和氧气B．农作物种子入库贮藏时，在无氧和低温条件下呼吸速率降低，贮藏寿命显著延长C．油料作物种子播种时宜浅播，原因是萌发时呼吸作用需要大量氧气下列叙述错误的是（）A．干制降低食品的含水量，使微生物不易生长和繁殖，食品保存时间延长B．腌制通过添加食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖C．低温保存可抑制微生物的生命活动，温度越低对食品保存越有利D．高温处理可杀死食品中绝大部分微生物，并可破坏食品中的酶类4．（2022·浙江·高考真题）下列关于细胞呼吸的叙述，错误的是（）A．人体剧烈运动会导致骨骼肌细胞产生较多的乳酸B．制作酸奶过程中乳酸菌可产生大量的丙酮酸和CO2C．梨果肉细胞厌氧呼吸释放的能量一部分用于合成ATPD．酵母菌的乙醇发酵过程中通入O2会影响乙醇的生成量5．（2021·湖北·统考高考真题）采摘后的梨常温下易软化。
果肉中的酚氧化酶与底物接触发生氧化反应，逐渐褐变。
干细胞因子受体c-Kit的研究进展
醇４，５一二磷酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔａｌ ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ， ＰＩＰ２），生成二酰甘油及１，４，５．三磷酸肌醇，从而调 节细胞内钙水平，产生相应的生物学活性¨引。磷酯 酶ｃ１主要与ｃ－Ｋｉｔ酪氨酸残基７３０及９３６相作用， 激活下游信号分子，在抗凋亡方面发挥蘑要作用。
此外，细胞内还存在一些下调ｃ—Ｋｉｔ表达的激 酶，例如：ＰＫＣ可以通过激活相应的蛋白激酶，水解 ｃ．Ｋｉｔ膜外区蛋白功能区而下调Ｋｉｔ的表达；还可以 磷酸化残基７４１及７４６，通过某些机制抑制ｃ．Ｋｉｔ激 酶的活性¨５｜。而酪氨酸激酶ＳＨＰＩ（Ｐ１１Ｐ１ Ｃ、ＨＣＰ、ＳＨ— ＰＴＰＩ）主要作用于ｃ·Ｋｉｔ的近膜区（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ，ＪＭＤ），下凋ｃ－Ｋｉｔ的活性，且调节作用仅限于 某些特定的细胞系中。此外，研究还表明，ｃ．Ｋｉｔ受体 蛋白胞内ＪＭＤ区的特定窄间构象的存在对抑制受体 的自发二聚化及胞内酪氨酸激酶的激活有重要作用。 ３肿瘤与ｃ－Ｋｉｔ靶向治疗
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｅ—Ｋｉｔ；Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ；Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ；Ａｎｔｉ｝ｍｄｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ
大鼠蛋白激酶CPKC酶联免疫分析ELISA
大鼠蛋白激酶C（PKC）酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，组织及相关液体样本中蛋白激酶C（PKC）的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠蛋白激酶C（PKC）水平。
用纯化的大鼠蛋白激酶C（PKC）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入蛋白激酶C（PKC），再与HRP标记的PKC抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的蛋白激酶C（PKC）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠蛋白激酶C（PKC）浓度。
试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
大鼠磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)ELISA试剂盒说明书
大鼠磷酸化蛋白激酶C(P-PKC)酶联免疫分析试剂盒使用说明书厦门慧嘉生物科技有限公司本试剂盒仅供体外研究使用!预期应用ELISA法定量测定大鼠血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中P-PKC含量。
实验原理用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗P-PKC抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗P-PKC抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。
TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的P-PKC呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制1. 酶联板：一块（96孔）2. 标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为100 U/L，做系列倍比稀释(注：不要直接在板中进行倍比稀释)后，分别稀释成100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，1.56 U/L，样品稀释液直接作为标准浓度0 U/L，临用前15分钟内配制。
如配制50 U/L标准品：取0.5ml（不要少于0.5ml）100 U/L的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3. 样品稀释液：1×20ml。
4. 检测稀释液A：1×10ml。
5. 检测稀释液B：1×10ml。
6. 检测溶液A：1×120μl（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100μl/孔），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。
如10μl检测溶液A加990μl检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
7. 检测溶液B：1×120μl/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B 1:100稀释。
激酶活性测试实验报告
一、实验目的本实验旨在通过磷酸肌酸底物法测定肌酸激酶（Creatine Kinase，CK）的活性，并探讨其在生物体内的功能。
通过实验，了解CK活性受温度、pH值等因素的影响，以及酶的激活和抑制现象。
二、实验原理肌酸激酶（CK）是一种广泛存在于生物体内的重要酶，参与细胞内能量代谢过程。
磷酸肌酸底物法是一种常用的测定CK活性的方法。
该法基于CK催化磷酸肌酸（Creatine Phosphate，CP）与ADP反应生成ATP和肌酸（Creatine，Cr）的原理。
在特定条件下，ATP的生成量与CK的活性成正比。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 肌酸激酶样品- 磷酸肌酸（CP）- ADP- NADH- 磷酸氢二钠（NaH2PO4）- 磷酸二氢钠（Na2HPO4）- 氯化镁（MgCl2）- 氯化钠（NaCl）- 碘化钾（KI）- 碘液- 水浴锅- 移液器- 试管- 离心机2. 实验仪器：- 分光光度计- 烧杯- 量筒- 胶头滴管- 恒温箱四、实验方法与步骤1. 配制底物溶液：- 称取一定量的CP，用磷酸缓冲液溶解并定容至一定体积。
- 称取一定量的ADP，用磷酸缓冲液溶解并定容至一定体积。
- 将NADH用磷酸缓冲液溶解并定容至一定体积。
2. 配制反应混合液：- 取若干试管，分别加入不同浓度的肌酸激酶样品、磷酸肌酸溶液、ADP溶液、NADH溶液、磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢钠溶液、氯化镁溶液和氯化钠溶液。
- 将混合液置于水浴锅中，调节温度至实验设定的温度。
3. 测定酶活性：- 在特定时间点，向反应混合液中加入碘液，观察溶液颜色的变化。
- 用分光光度计测定溶液在特定波长下的吸光度值。
- 根据吸光度值计算酶活性。
4. 稳定酶活性：- 在实验过程中，分别调节pH值和温度，观察酶活性的变化。
五、实验结果与分析1. 酶活性与温度的关系：- 实验结果表明，随着温度的升高，CK的活性逐渐增加，但当温度超过一定范围时，酶活性开始下降。
高考生物热点情境80 周期蛋白依赖性蛋白激酶
高考生物热点情境80周期蛋白依赖性蛋白激酶一、选择题1．(2022·天津南开中学高三月考)CDK蛋白是一类调控细胞周期进程的激酶。
P27蛋白可以插入到CDK蛋白中改变其构象，使细胞周期停滞于DNA复制前。
研究发现，敲除小鼠的P27基因，基因敲除小鼠的体型和一些器官的体积均大于正常小鼠。
以下推论不正确的是()A．CDK蛋白可激活细胞有丝分裂B．P27蛋白是CDK蛋白的活化因子C．敲除P27基因可能引发细胞癌变D．P27基因表达能抑制细胞的增殖答案 B2．研究表明，细胞周期依赖性蛋白激酶(CDK)是细胞周期调控的核心物质，各种CDK在细胞周期内特定的时间被激活，驱使细胞完成细胞周期。
其中CDK1(CDK 的一种)在分裂间期活性高，分裂期活性迅速下降，以顺利完成分裂。
下列说法正确的是()A．幼年个体体内CDK含量较高，成年后体内无CDKB．温度的变化不会影响一个细胞周期持续时间的长短C．CDK1可能与细胞分裂过程中纺锤丝的形成有关D．CDK1可干扰细胞周期，在癌症治疗方面有一定的积极作用答案 C解析由题意可知，细胞周期依赖性蛋白激酶是细胞周期调控的核心物质，不管是幼年个体还是老年个体内都会进行细胞的分裂，A错误；酶的活性是受温度影响的，所以温度的变化会影响一个细胞周期持续时间的长短，B错误；各种CDK 在细胞周期内特定的时间被激活，驱使细胞完成细胞周期，故能促进癌细胞分裂间期的某些活动，促进癌细胞的增殖，D错误。
3．细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(简称CDK)对细胞周期起着核心性调控作用，不同种类的CDK沿细胞周期时相交替活化：活化的CDK1启动细胞向分裂期推进，活化的CDK2可促使细胞进入S期(DNA合成期)。
癌细胞中的某个基因突变后可诱导激活CDK抑制因子，造成细胞周期停滞，引发细胞衰老。
下列叙述错误的是()A．活化的CDK1可能会促进染色质凝缩、核膜解体B．CDK2的活性进入分裂期后可能会下降C．控制CDK抑制因子合成的基因可能属于原癌基因D．研发CDK抑制剂药物可能为癌症的治疗提供思路答案 C解析细胞内激活的CDK抑制因子具有抑制细胞增殖、促进细胞衰老的作用，因此控制CDK 抑制因子合成的基因属于抑癌基因，C错误。
PKC的酶学特征及在结肠癌中的研究进展
・
１２６７・
・综述・讲座・ ＰＫＣ的酶学特征及在结肠癌中的研究进展
范桂莲 王玉国 何 苗
ＰＫＣ的酶学特征 ＰＫＣ的超家族成员 根据不同亚单位在结构和功能上
蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶的家族成
１ １．１
员，对细胞的生长、分化：凋亡等信号转导均起重要作用。因而
Ｊ０１ａｎｄａ Ｈ．ＬｉｏｎｅＩ Ｇ，Ｅｒｉｋ
ｔｉｏｎ Ｂ，ｅｔ ａＩ．Ｐｒｏｔｅｉｎ
ＰＫＣ与结肠癌细胞的分化
Ｒｉｃｋａｒｄｌ等Ｈ１在人类结肠
上皮细胞的体外研究还发现ＰＫＣ的激活可以增加丁酸盐诱
导的细胞分化和更新。丁酸盐是一个潜在的分化因素，在结 肠癌细胞中，它能促进许多细胞分化标记物的表达，包括碱性
ｃ ａｃｔｉｖａ—
ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｃｅＩｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｔｅｎｉｎ—ｎｅｇｅｔｉｖｅ
ｃｏｌｏｎ
ｃａｎｃｅｒ
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１１６
ｏｆ
ｄｅｓｍｏｓｏｍｅｓ
［Ｊ］．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１９９７，１３７（５）１１ １０３—１
ＰＫＣ的结构及调节
对ＰＫｃ各亚单位分子的结构分
析表明，ＰＫＣ分子中有４个相对保守的区域，从氨基端到羧
基端分别命名为Ｃ１一Ｃ４结构域。Ｃ１是ＤＡＧ的结合位点，
Ｃ２是ｃａ”的结合位点，Ｃ１和Ｃ２合称ＰＫｃ的调节区。Ｃ３有 一个ＡＴＰ结合基序，为ＰＫＣ提供能量和磷酸基团，ｃ４是底 物结合区，Ｃ３和Ｃ４合称为ＰＫＣ的催化区。
收稿日期２０１０一０２～２２
丙酮酸激酶活性测定实验报告
丙酮酸激酶活性测定实验报告
原理：在二磷酸腺苷（ADP）存在的条件下丙酮酸激酶（PK）催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）转化成丙酮酸，在辅酶Ⅰ还原型（NADH）存在情况下，丙酮酸被LDH转化为乳酸，若标记荧光于NADH上，此时有荧光的NADH变为无荧光的NAD。
参考值：正常荧光在20min内消失。
（15.0±1.99）U/gHb（37℃）（ICSH推荐Blume法）。
临床意义：PK严重缺乏者荧光60min不消失；PK中间缺乏时荧光25～60min消失。
纯合子PK值在正常活性到25%以下，杂合子为正常25%～50%。
丙酮酸激酶是糖酵解途径中的一个关键酶，能催化磷酸烯醇式丙酮酸转化为烯醇式丙酮酸，并产生ATP，所以具有重要的生理作用。
丙酮酸激酶在人体分布广泛，有四种同工酶，分为L、R、M1和M2。
L型仅存在于肝实质、肾脏及小肠黏膜中，R型仅存在于成熟红细胞中，M1型存在于大脑及肌肉中，M2型除骨骼肌外，广泛分布于各种组织中，特别是肾脏与恶性肿瘤细胞中含量较高。
在正常成人肝脏主要是L型，而在胎儿则主要为R型。
蛋白激酶检测方法
1.RT-PCR 测定PKCαmRNA 表达用TRIZOL 一步提取法提取总RNA ,按Ivit rogen 公司Super Script First-st rand Synthesis For RT-PCR 步骤进行逆转录。
以β-actin 作为内参照。
引物序列, PKCα上游为5′-TGCTGACTTTGGGATGTG-3′, 下游为5′- TGTTTGT2TCTCGCTGGTG-3′,扩增产物长度605 bp ;β-actin 上游为5′- TGACTTA GTTGCGTTACACCC-3′,下游为5′- CGAAG2GCTCATCATTCAAAA-3′,扩增产物长度450 bp 。
RT 反应条件: 50 ℃ 30 min ,99 ℃ 5 min ,5 ℃5 min 一个循环。
PCR 反应条件: 94 ℃预变性2 min ,然后按照94 ℃ 30 s ,55 ℃30 s ,72 ℃ 1 min 进行30 个循环, 最后72 ℃延伸10 min。
2. Western blot 检测PKCα蛋白表达（1）胞质、胞膜蛋白的提取:所有实验操作均在4 ℃下进行。
各样品取50 mg ,加入5 倍于湿重的粉碎缓冲液,剪碎、匀浆,4 ℃12 000 r/ min 条件下离心2 h ,上清液即为胞质蛋白。
将上述沉淀用2 ml 胞膜蛋白提取液悬起,超声粉碎后抽提30 min ,再于4 ℃12 000 r/ min 离心2 h ,上清即为胞膜蛋白。
将蛋白定量后,调定至等蛋白浓度备用。
（2）PKCα分析:取20μg 蛋白与等体积样品缓冲液混合,煮沸5 min ,十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶( SDS-PAGE)电泳,电转移至硝酸纤维素膜上, 5 %脱脂奶粉封闭3 h ,0. 1 % TTBS 清洗,加入PKCα 抗体、室温孵育过夜, 再用TTBS 清洗,以碱性磷酸酶标记的二抗室温孵育l h , TTBS清洗,与偶联辣根过氧化物酶的第二抗体( sigma) 反应,Western blot 增强化学发光法( ECL) 发光试剂显色并拍照。
热点实验：PKC蛋白激酶活性检测实验
实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司， V5330）实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC活化度）。
操作步骤：1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。
2．在4℃，用14,000 × g 离心裂解液5 分钟，保存上清。
3．用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱，再把第2 步中得到的上清过柱。
用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。
4．用PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀释到2.5ug/ml。
随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。
5．用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。
6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag® PKC 5×Buffer,PepTag® C1 Peptide，超声过的PKC Activator 5X Solution，和水。
在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。
阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。
标准PKC检测PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5X Solution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ul样品 9ul去离子水使终体积为 25ulPKC阳性对照检测PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ulProtein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer） 4ul去离子水使终体积为 25ulPKC阴性对照检测（不加PKC）PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ulPepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ulPKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul短肽保护液（非必须） 1ul去离子水使终体积为 25ul（以阳性对照IOD值为100，其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值）。
4【终板】活性分析检测表达蛋白AKP
1 实验背景细胞破碎技术：利用外力破坏细胞膜和/或细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。
分类：机械法和非机械法。
超声波破碎法(ultrasonication)：利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。
常用电声型超声波振荡器。
它由发生器和换能器组成，其中发生器能产生高频电流，而换能器把电磁振荡转换成机械振动。
研磨破碎法(fine grinding)：将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。
在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机。
1 实验背景化学破碎法(chemical treatment)：采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分，常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂。
酶溶破碎法(enzyme lysis)：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。
溶菌酶(lysozyme)适用于革兰氏阳性菌细胞的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA，使之更有效地作用于细胞壁。
1 实验背景冻融破碎法(freezing and thawing)：将细胞放在低温下冷冻(约-15℃)，然后在室温中融化，反覆多次而达到破壁作用。
由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。
对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。
注意：细胞破碎释放出的蛋白质要保持原来的天然状态，不丧失活性，必须选择适当的含有目标蛋白保护剂和蛋白酶抑制剂缓冲液。
细胞破碎程度也影响内容物的释放和目标蛋白的活性，一般实验时要探索合适的破碎条件。
1 实验背景大肠杆菌碱性磷酸酶(E. coli alkaline phosphatase) 也称大肠杆菌碱性磷酸酯酶，简称AKP/ALP（EC.3.1.3.1)，在碱性环境下能水解多种磷酸单酯化合物，需要镁和锰离子为激活剂。
蛋白激酶C激活的荧光共振能量转移分析
蛋白激酶C激活的荧光共振能量转移分析李俊青;江建明;冯瑞强;蒋晖;闫文娟;杨德鸿【摘要】Objective To investigate the changes in the expressions of Fas-associated death domain protein (FADD) and cellular-FLICE inhibitory protein (c-FLIP) in the articular cartilage of patients with Kashin-Beck disease (KBD) and the role of these proteins in the pathogenesis of KBD. Methods The cartilage samples were collected from patients with established diagnosis of KBD and osteoarthritis and from healthy control subjects undergoing amputation due to traffic accidents. The expressions of Fas-associated death domain protein (FADD) and cellular-FLICE inhibitory protein (c-FLIP) in the cartilage were detected by immunohistochemistry, and the positive chondrocytes were counted in different layers of the articular cartilage under microscope. Results The positivity rates of FADD in the middle layer of articular cartilage from patients with KBD [(28.68±2.19)%] and osteoarthritis [(35.40±2.34)%] were significantly higher than that in normal cartilage [(10.51 ±5.02)%, F=16.245, P=0.000], but the rates in the upper and deeper layers were comparable among the 3 groups (P=0.206-0.761). In KBD cartilage, FADD expression was the highest in the middle layer [(28.68±5.38)%] followed by the deeper layer [(17.94±8.38)%]. Compared with the healthy controls, KBD and osteoarthritis patients showed significantly higher FLIP expression in the upper layer of the cartilage (F=5.929, P=0.018) but similar expressions in middle and deeper layers. Conclusions KBD patients have significantincreased FADD expression in the middle layer but decreased FLIP expression in the upper layer of the cartilage, suggesting that the death receptor pathway and its regulators play important roles in the pathogenesis of KBD.%目的当前,检测蛋白激酶C(PKC)激活的方法尚缺乏灵敏性或直接性,这里我们提供了一种新的直接而灵敏的方法——利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术来构建检测PKC激活的方法.方法将表达PKC激活的报告分子(CKAR)的质粒单独转染或与表达甲状旁腺素1型受体(PTHR1)的质粒共转染HEK293细胞,培养72 h后用激光共聚焦显微镜检测FRET的变化,并以此判断甲状旁腺素或佛波酯是否激活PKC.结果在只转染CKAR质粒的HEK293细胞,佛波酯降低了CKAR分子的FRET效率,并使青色荧光与黄色荧光的比值(C/Y)增加,而PTH( 1-34)未能改变C/Y的值.在共转染了CKAR 和PTHR1质粒的HEK293细胞,PTH(1-34)则使C/Y增加.结论 PKC激活报告分子可用于检测PKC的激活,该方法也可作为PKC相关信号转导的实验平台.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2011(031)011【总页数】4页(P1867-1870)【关键词】蛋白激酶C;荧光共振能量转移;PKC激活报告分子【作者】李俊青;江建明;冯瑞强;蒋晖;闫文娟;杨德鸿【作者单位】南方医科大学南方医院脊柱骨科,广东广州510515;南方医科大学南方医院脊柱骨科,广东广州510515;南方医科大学南方医院脊柱骨科,广东广州510515;南方医科大学南方医院脊柱骨科,广东广州510515;南方医科大学南方医院口腔科,广东广州510515;南方医科大学南方医院脊柱骨科,广东广州510515【正文语种】中文【中图分类】R34蛋白激酶C（PKC）是一个重要的涉及细胞功能的信号分子，参与体内多个生理和病理过程［1-4］。
大鼠脑出血蛋白激酶C与细胞凋亡关系的实验研究的开题报告
大鼠脑出血蛋白激酶C与细胞凋亡关系的实验研究
的开题报告
题目：大鼠脑出血蛋白激酶C与细胞凋亡关系的实验研究
背景：脑出血是一种常见、严重的神经系统疾病，其病理生理机制还不完全清楚。
近年来的研究表明，细胞凋亡是脑出血后神经细胞死亡的一种重要方式。
蛋白激酶C (PKC) 是一组重要的信号传导蛋白，在细胞凋亡过程中起着关键的作用。
然而，大鼠脑出血后 PKC 的变化及其与细胞凋亡的关系尚未得到全面研究。
研究内容和方法：本研究将采用大鼠脑出血模型，观察 PKC 在脑出血后的变化，并探究 PKC 与神经细胞凋亡的关系。
具体实验步骤如下：
1.建立大鼠脑出血模型：60只 SD 大鼠随机分为对照组和实验组，实验组采用穿刺法制备大鼠脑出血模型，对照组则进行假手术。
2.观察 PKC 的变化：在不同时间点（6h、12h、24h、48h）采集实验组大鼠的脑组织，通过 Western blot 和免疫荧光染色等技术检测 PKC 的变化。
3.检测细胞凋亡情况：采集大鼠脑组织，通过 TUNEL 和 DAPI 染色等技术检测神经细胞凋亡的情况。
4. PKC 干预实验：选取 PKC 的激动剂和抑制剂，干预实验组的大鼠脑出血模型，观察 PKC 干预对细胞凋亡的影响。
预期结果和意义：通过以上实验方法，我们将研究大鼠脑出血后PKC 的变化情况，以及 PKC 与神经细胞凋亡的关系。
结果有望为了解脑出血病理生理机制提供新的思路和实验依据，为脑出血的临床治疗提供新的目标和策略。
实验性脑血管痉挛中PKC活性表达及其意义
实验性脑血管痉挛中PKC活性表达及其意义陈铎;石玉秀;西泽茂【期刊名称】《中国医科大学学报》【年(卷),期】2000(29)2【摘要】目的 :探讨蛋白激酶 C(PKC)在实验性蛛网膜下腔出血所致脑血管痉挛发生发展过程中的作用及意义。
方法 :采用成年犬枕大池二次注血法建立脑血管痉挛动物模型 ,通过非放射性同位素标记蛋白激酶测定法动态测定犬脑基底动脉平滑肌细胞 PKC活性。
结果 :动态脑血管造影显示 ,实验组 day4组和 day7组基底动脉口径分别为正常对照组基底动脉口径的(73.8± 3.4) %和(5 1.1± 2 .1) % ,与对照组比较差异显著 (P 0 .0 5 ) ,day7组差异显著 (P <0 .0 1) ,day 4和 day 7组之间差异显著 (P <0 .0 1)。
结论 :脑血管痉挛过程中 PKC被持续激活 ,并在脑血管痉挛病理发展过程中起关键作用。
【总页数】1页(P91)【作者】陈铎;石玉秀;西泽茂【作者单位】不详;不详【正文语种】中文【中图分类】R743【相关文献】1.Ku70和DNA-PKcs在鼻咽癌放疗后复发组织中的表达及其意义 [J], 杜豆;孙宁2.DNA-PKcs在胶质瘤组织中的表达及其临床意义 [J], 邵翠杰;石德文;于如同3.卵巢上皮性肿瘤组织中DNA-PKcs、Ku70蛋白的表达变化及意义 [J], 由卫芝;申爱方;张玲;赵新蕊4.非小细胞肺癌组织中DNA-PKcs的表达变化及意义 [J], 蒋昌斌;甄俊杰;莫明聪;牛道立5.DNA-PKcs蛋白和MGMT蛋白在肝癌组织中的表达及意义 [J], 王万鹏;宋德霸;赵龙栓因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
激酶活性报告模板
激酶活性报告模板1. 引言本报告旨在描述激酶活性的实验结果和分析。
激酶活性是生物化学和药物研究中一个重要的指标，用于评估化合物对酶的影响。
在本实验中，我们使用了一种标准的酶抑制实验来测定激酶的活性。
本报告将详细介绍实验的设计、方法和结果，并进行相应的数据分析和讨论。
2. 实验设计2.1 实验目的本实验的目的是评估化合物对激酶的抑制活性。
我们选择了特定的激酶作为目标，并采用了一种已经验证过的酶抑制实验方法。
2.2 材料和仪器在本实验中，我们使用了以下材料和仪器：•激酶底物•收集样品并储存在适当的条件下的冷冻设备•酶抑制剂•显微镜和显微镜幻灯片•净化设备和试剂•高压液相色谱仪2.3 实验流程本实验的流程如下：1.准备酶底物溶液并将其酶解。
2.添加适当浓度的激酶和酶抑制剂，并使其反应。
3.根据反应时间收集样品。
4.通过离心等方式净化样品。
5.采用高压液相色谱仪分析样品。
6.记录实验数据并进行数据分析。
3. 实验方法3.1 酶底物酶解首先，我们准备了酶底物溶液并将其酶解。
酶底物溶液的配制方法如下：1.取适量的酶底物，并按照厂家提供的说明书中的方法进行配制。
2.确保酶底物溶液的浓度在实验需要的范围内。
3.将酶底物溶液加入适量的酶解缓冲液中，并根据实验需求进行酶解反应。
3.2 激酶活性测定在酶底物酶解完毕后，我们进行了激酶活性测定实验。
实验过程如下：1.取适量的酶底物酶解产物，并将其与适量的激酶和酶抑制剂混合。
2.根据实验要求，确定反应时间，并在相应时间点收集样品。
3.收集样品后，采用离心等方法净化样品，以去除杂质。
4.净化后的样品通过高压液相色谱仪进行分析，并记录各时间点的峰值面积。
3.3 数据处理和分析最后，我们对实验数据进行了处理和分析，以评估抑制剂对激酶活性的影响。
数据处理和分析的方法如下：1.将每个时间点的峰值面积进行统计，并得到各时间点的相对活性值。
2.绘制相对活性值与时间的曲线，以观察激酶活性的变化趋势。
急性心肌梗塞血小板中PKC底物磷酸化程度的实验研究
急性心肌梗塞血小板中PKC底物磷酸化程度的实验研究孙胜玫;张丽霞
【期刊名称】《中国医科大学学报》
【年(卷),期】1998(027)002
【摘要】目的：研究急性心肌梗塞（ＡＭＩ）时脂蛋白（ａ）（ＬＰ（ａ），血小板（ＰＬＴ）及蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）的关系。
方法：分析以高ＬＰ（ａ）血症的急性，心肌梗塞（ＡＭＩ）病人及健康对照者为对象，检测其ＰＩＴ及ＰＬＴ中ＰＫＣ底物４０ｋｄ蛋白磷酸化程度，对检测结果进行统计学分析，结果：ＡＭＩ组ＰＬＴ数目及共４０ｋｄ蛋白磷酸化程度明显高于对照组，并且，磷酸化程度随时间延长而增强，结论：高ＬＰ（ａ）血症的ＡＭＩ患者
【总页数】2页(P158-159)
【作者】孙胜玫;张丽霞
【作者单位】沈阳第一临床学院检验科;沈阳第一临床学院检验科
【正文语种】中文
【中图分类】R542.22
【相关文献】
1.ZIP1和ZIP2不同程度激活PKC对钾离子通道的磷酸化 [J],
2.用酵母双杂交系统鉴定DNA-PKcs磷酸化簇区域和DNA-PKcs单链抗体anti-DPK3-scFv间的相互作用 [J], 吴成林;刘晓丹;王欲晓;杜丽;付凯飞;周平坤;周丽君
3.血小板中4种磷酸化程度不同的肌动蛋白结合蛋白的特性 [J], 吴满平
4.高血压血小板中蛋白激酶C底物磷酸化程度的实验研究 [J], 孙胜玫;陶方;王燕清
5.血小板中肌动蛋白结合蛋白的磷酸化程度与它的肌动蛋白结合能力之间关系及其部分氨基酸顺序 [J], 吴满平
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实验试剂：琼脂糖（Promega公司，V3125）；其他常备试剂购自sigma公司；PKC活性检测试剂盒（Promega公司， V5330）
实验仪器：电泳仪（北京六一厂，112-0640）；水平电泳槽（北京六一厂，122-3146）；电热恒温培养箱（碧云天生物，EBI025）；电热恒温水浴锅（江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8）基本原理：分离PKC蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将2种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性（PKC活化度）。
操作步骤：
1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。
2．在4℃，用14,000 × g 离心裂解液5 分钟，保存上清。
3．用PKC 抽提液预平衡1ml 的DEAE 纤维素柱，再把第2 步中得到的上清过柱。
用5ml的PKC 抽提液洗柱子，然后用5ml 含有200mM NaCl 的PKC 抽提液洗脱含有PKC 的组分。
4．用PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶C（Promtein Kinase C）稀释到2.5ug/ml。
随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。
5．用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。
6．对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml 小离心管中混合PepTag® PKC 5×Buffer,PepTag® C1 Peptide，超声过的PKC Activator 5X Solution，和水。
在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。
阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值（说明书第IV.部分）。
标准PKC检测
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ul
PKC Activator 5X Solution, 超声处理的 5ul
短肽保护液（非必须） 1ul
样品 9ul
去离子水使终体积为 25ul
PKC阳性对照检测
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ul
PKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul
短肽保护液（非必须） 1ul
Protein Kinase C (2.5ug/ml 溶于 PKC dilution buffer） 4ul
去离子水使终体积为 25ul
PKC阴性对照检测（不加PKC）
PepTag® PKC Reaction 5X Buffer 5ul
PepTag® C1 Peptide (0.4ug/ul) 5ul
PKC Activator 5XSolution, 超声处理的 5ul
短肽保护液（非必须） 1ul
去离子水使终体积为 25ul
（以阳性对照IOD值为100，其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值）。