蛋白质的分离提取方法共32页
蛋白质的分离纯化和表征
蛋白质的分离纯化和表征
第21页
2. 盐析 在蛋白质水溶液中，加入大量高浓度强
电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等， 可破坏蛋质分子表面水化层，中和它们电 荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称 为盐析。
而低浓度盐溶液加入蛋白质溶液中，会 造成蛋白质溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析机理：破坏蛋白质水化膜，中和表面 净电荷。
灵敏度高，能检测1微克蛋白，重复性好。
蛋白质的分离纯化和表征
第48页
蛋白质纯度判定
各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点， 末端氨基酸测定一个，溶解度曲线单转折。
蛋白质的分离纯化和表征
第49页
盐溶盐溶—盐析
• 等电点沉淀蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀 溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
许盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶
于水中 蛋白质的分离纯化和表征
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盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
蛋白质的分离纯化和表征
第46页
蛋白质含量测定Ⅱ
3．Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试
剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比 色测定。
Folin-酚试剂配制比较复杂。 4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二 喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。
到达最高值。
蛋白质的分离纯化和表征
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三、蛋白质分离纯化普通标准
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采取盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采取凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
westernblot详解PPT课件
蛋白质Marker
➢主要目的是确定靶蛋白的分子量大小； 使用预染的Marker还可以实时检测电泳 分离情况，并可以转移到膜上。
Fermentas
Prestained protein ladders Unstained protein ladders
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上样缓冲液 Loading buffer
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一 配分离胶
准备物品： 玻璃板 洗衣粉 灌胶架 移液枪 两个烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（ PH=8.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度 ） ，SDS（常温） 1 清洗玻璃板： 一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗衣粉轻轻擦 洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用ddH2O冲洗干净后立在 通风处或烘箱中 2 配制分离胶： 玻璃板对齐后放入夹中加紧，注意使两玻璃板对齐。然后垂直卡 在架子上准备灌胶。 先配制分离胶。配方如下：
1.将200mg组织块剪碎，置于1ml裂解液中（
5ml离心管）。
2.匀浆器进行匀浆，注意冰上操作，匀浆后置于
冰上。
3.10，000g ,4℃,10min,（5ml管）离心
4.取上清至1.5ml管，12，000g ,4℃,60min,
离心
5.取上清至新1.5ml管,-80℃储存
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3·1·2 蛋白样品浓度的测定方法
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3·1 固定
①用ddH2O水冲洗一下玻璃板，将其放入电 泳槽中。注意，小玻璃板面向内，大玻璃板 面向外。
②向电泳槽中加入1x电泳液
• 5X电泳液缓冲液 ③Tr拔is（掉M梳W子1，2注1.1意4动）作轻柔。
凝胶过滤层析法
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Sephadex经改性后比其母体具有更广泛的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素及其他小分子的分级分离。
10
15-20
72
5
150
5000-400000
1000-150000
15
20-30
72
5
200
5000-800000
1000-200000
20
30-40
72
5
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Sephadex的型号及性能
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3、主要用途：孔径较小的凝胶主要用于脱盐、肽与其他小分子的分离；孔径较大的凝胶用于蛋白质与其他大分子的分离。DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核苷酸的分离。
峰宽：峰的基线宽度，通过层析峰两侧拐点作切线交于基线上的距离。
标准差：样品组分被带出层析柱的分散度，用σ表示。两侧拐点之间的距离为2个标准差。
Wb=4 σ=1.699W1/2
W1/2=2.354 σ
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保留值：表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的大小。
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第27页/共82页
Sephacryl系列产品性能
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(五)、Superdex系列产品 是最新的凝胶过滤介质，属BioProcess介质中的一种。是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身的具有优良选择性和高分辨率的产品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40℃处理400小时而分辨率保持不变。
蛋白质计算问题归
• A. 1条
B. 2条
• C. 3条
D. 4条
第十二页，共32页。
• 解析：据脱水量，可求出脱水数＝
1908÷18＝106，形成某蛋白质的 氨基酸的分子质量之和＝11935＋ 1908＝13843，则氨基酸总数＝ 13843÷127＝109，所以肽链数＝ 氨基酸数−脱水数=109−106＝3， 答案为C。
第二十六页，共32页。
1、根据下面图解，回答问题：
（1）该图示_____肽化合物；含_____个肽键。（2）填写 虚线框内结构的名称：A．_____ B．_____ C．_____
（3）生成此化合物的反应叫________。
第二十七页，共32页。
2、下列物质中，有的是氨基酸，有的不是。请找
出所有的氨基酸，回答这些氨基酸经缩合反应后形
第三页，共32页。
• 在解答这类问题时，必须明确的
基本关系式是：
•蛋白质的相对分子质量＝氨基
酸数×氨基酸的平均相对分子 质量−脱水数×18（水的相对分 子质量）
第四页，共32页。
• 变式1：组成生物体某蛋白质的20种氨基
酸的平均相对分子质量为128，则由100 个氨基酸构成的含2条多肽链的蛋白质， 其分子量为 （ ）
数目和脱下
• 的水分子数分别是
• A、573和573
B、570和570
• C、572和572
D、571和571
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4、若组成蛋白质的氨基酸的平均分子 量是130，那么，由4条肽链280个氨 基酸组成的蛋白质的相对分子质量是 多少？
5、20种氨基酸的平均相对分子质量为 128，假若有一个多肽化合物，由10 个氨基酸构成一条肽链，那么该多肽 化合物的相对分子质量约是多少？
2015年10月30日昭通市下半年事业单位招聘考试 《职业能力测验》C 预测试题及参考答案解析
2015年10月30日昭通市下半年事业单位招聘考试《职业能力测验》C预测试题及参考答案解析第一部分常识判断（共25题，参考时限10分钟）根据题目要求，在四个选项中选出一个最恰当的答案。
请开始答题：1.关于城镇化，下列说法错误的是：A.当前我国的城镇化水平尚不足50%B.城市群将是未来我国城镇化发展的主体形态C.我国城镇化的核心是实现“以城带镇”的发展模式D.非农产业向城镇聚集市城镇化的本质特征之一2.根据居民身份证法，下列说法正确的是：A.公民丢失居民身份证申请补领，不用登记指纹信息B.小明今年8岁，可自愿申请领取有效期十年的居民身份证C.张大妈是低保户，在其换领居民身份证时，应免收工本费D.某公司非法扣押员工的居民身份证，公安机关可处五百元罚款3.下列四对商品中，在需求方面的相互影响关系明显不同于其他三对的是：A.燃气灶和抽油烟机B.鸡肉和牛肉C.汽车和汽油D.饮水机和桶装水4.关于中国周边岛屿，下列说法错误的是：A.黄岩岛是中沙群岛中唯一露出水面的岛屿B.钓鱼岛群岛是台湾岛的附属岛屿C.黑瞎子岛位于黑龙江与乌苏里江的交汇处D.太平岛是南海诸岛中面积最大的岛屿5.下列说法不正确的是：A.在黑龙江无法看到极昼现象B.贵州有全国最大的瀑布C.全国大陆最低点位于海南D.广西是少数民族人口最多的省级行政区6.关于我国珍惜动物，下列说法错误的是：A.朱鹮喜欢生活在湿地、沼泽和水田地带B.中华鲟是一种古老的脊椎动物C.大鲵的体色可随环境发生变化D.扬子鳄是世界上体型最大的鳄鱼品种7.关于世界战争史中的著名将领，下列说法错误的是：A.麦克阿瑟曾任朝鲜战争中的联合国军总司令B.隆美尔有“沙漠之狐”之称C.戴高乐将军领导了“自由法国”运动D.蒙哥马利曾是苏联陆军元帅8.下列关于颜色的说法正确的是：A.大多数单色光可以分解为红、绿、黄三种基色光B.夏天穿深色衣服觉得热，是因为深色布料透气性差C.红光的波长大于绿光，因而红光的穿透性更强D.“白色污染”是指白色塑料盒废纸对环境的污染9.关于度量单位，下列对应正确的是：A.面积：亩、顷、仞B.容积：斗、石、加仑C.重量：两、升、磅D.长度：丈、里、盎司10.大河文明是对发祥于大河流域的古代文明的统称，下列古代文明不属于大河文明的是：A.玛雅文明B.印度文明C.巴比伦文明D.埃及文明11下列说法不符合常识的是A某超音速飞机的最高时速为800公里B某人能听见频率为50赫兹的声音C某山峰山顶的大气压为0.6个标准大气压D某湖的湖面已有—半结冰，表面温度为零摄氏度12下列哪组气体均为无色无味气体A氢气、—氧化碳、二氧化碳B氧气、二氧化氮、二氧化硫C甲烷、一氧化碳、二氧化硫D甲醛、二氧化碳、一氧化氮13关于蛋白质，下列说法正确的是A 组成蛋白质的基本单位是核苷酸B 蛋白质在被人体消化吸收过程中发生了水解C 蛋白质均含有碳、氧、磷等五种元素D 蛋白质是人体内最直接的能量来源14关于光的传播及其原理，下列说法错误的是A 光在水中的传播速度比在空气中慢B 光在不同介质的交界处会发生折射现象C.3D 眼镜的3D 效果利用了光的散射原理D“坐井观天，所见甚小”是因为光沿直线传播15在大型超市中，商家为提高销售额，通常会把诸如面包和牛奶、牙膏和牙刷等物品摆放在相近的位置．这是运用了数据挖掘中的哪种方法？A 分类B 聚类C 关目规则D 序列分析16下列去污方法与酒精去油污的原理相同的是A 洗涤剂去油污B 面粉去碘酒污C 白醋去红汞污D 汽油去桐油污17关于计算机，下列说法错误的是：A 微型计算机中应用最普遍的字符编码是ASCⅡ码B 微型计算机的发展是以操作系统的发展为标志的C 计算机存储容量的基本单位是字节D 计算机上插U 盘的接口通常是USB 标准接口18下列选项中x 与y 之间的关系，可以用下图表示的是A 当施加给物体的力相同时，x 表示质量．y 表示加速度B 当物体作匀速直线运动时，x 表示时间．y 表示速度C 当电阻两端的电压相等时．x 表示电阻，y 表示电流D 当物体完全浸没在水中时，x 表示体积，y 表示浮力19关于生物的遗传，下列说法错误的是：A 无性生殖过程中可能会出现减数分裂B 哺乳动物雄性个体细胞的性染色体对为XY，雌性则为XXC 人体的一对同源染色体，一个来自父本，—个来自母本D 染色体是细胞遗传信息的主要载体20关于电路下列说法正确的是：xyA升压、降压变压器的区别在于线圈缠绕方向相反B导线长度越长，横截面积越大，其电阻值越大C二极管具有单向导电性D在闭合的电路中，电源内部电流的方向是由正极流向负极第二部分言语理解与表达（共25题，参考时限20分钟）本部分包括表达与理解两方面的内容。
细胞生物学蛋白分选
当前第8页\共有49页\编于星期四\21点
Signal peptide required for import into ER
当前第9页\共有49页\编于星期四\21点
Günter Blobel,
born in 1936,
works at the Laboratory of Cell Biology,
The Rockefeller University, New York
当前第7页\共有49页\编于星期四\21点
Signal hypothesis
How do newly synthesized proteins find their correct destinations within a cell?
➢ 输入线粒体 +H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-
Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-
➢ 输入质体 +H3N-Met-Val-Ala-Met-Ala-Met-Ala-Ser-Leu-Gln-Ser-Ser-Met-Ser-
细胞质基质中的蛋白质转运
三、膜泡运输 vesicular transport
43
5
6
当前第37页\共有49页\编于星期四\21点
7 2
1
vesicular transport
当前第38页\共有49页\编于星期四\21点
三、vesicular transport
酶的提取和分离纯化.pptx
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11.2.1 机械破碎法 • 指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：
• 1.机械捣碎法
• 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。 10000r/min
• 此法在实验室和生产规模均可采用。
• 2.研磨法
• 突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压 容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几 分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降， 使细胞破碎。
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压力差破碎法
• （3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。 • 应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖
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球蛋白溶解度-溶液离子强度关系
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盐析
• 中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因： • 1).中和蛋白质分子表面电荷 • 2).与蛋白质颗粒竞争水分子 • 不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不
同，因而可以分级沉淀。 • 盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋
• 性质
方法
• 分子大小
离心，超离心法、凝胶过滤，
膜分离技术（超滤，反渗透，
微孔过滤，透析，电渗析等）
• 溶解度
法，
盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀
选择性沉淀法，结晶
• 电荷或基团
离子交换色谱，电泳，等电聚焦，
吸附 色谱，疏水色谱，聚焦色 谱
• 稳定性
选择性变性法（热，酸碱，
表面活性剂）
• 特殊（专一性结合）第30亲页/共和13色9页谱，亲和洗脱，亲和电
10.反胶束萃取
反胶团的溶解作用
反胶团内存在微水池，可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生 物分子，为生物分子提供易于生存的亲水微环境。
四种模型 :
(a)水壳模型，蛋白质位于水池的中心，周围存在的水层将其与反胶团壁(表
面活性剂)隔开；
(b)蛋白质分子表面存在强烈疏水区域，该疏水区域直接与有机相接触； (c)蛋白质吸附于反胶团内壁； (d)蛋白质的疏水区与几个反胶团的表面活性剂疏水尾发生相互作用，被几个
第8页，共36页。
反胶束形成过程
表面活性剂分 子自聚集
表面活性剂（临界胶束浓度）
加入
水
有机溶剂
正常胶束
反胶束
极性核心
非极性核心
溶解非极性物质
水池
蛋白质水池
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蛋白质保持天然构型
胶束和反胶束结构示意图
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反胶束的形状与大小
反胶团的大小与溶剂和表面活性剂的种类 与浓度、温度、离子强度等因素有关，一 般为5－20nm，其内水池的直径d用下式计 算
DDAB CTAB (didodecyldimethyl ammonium bromide)溴化十二烷基二甲铵；
(cetyl-
methyl-ammonium bromide溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴）
第5页，共36页。
AOT
特点：容易获得，具有双链，极性基团较小、形成反胶束时不需加助 表面活性剂，并且所形成的反胶束较大，半径为170nm，有利于大分子 蛋白质进入。
概述
1 反胶束溶液形成的条件和特性
2 反胶束萃取蛋白质的基本原理 3 影响反胶束萃取蛋白质的主要因素
第1页，共36页。
传统溶剂萃取技术缺点:
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46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
蛋白质的分离提取方法
41、实际上，我们想要的不是针对犯 罪的法 律，而 是针对 疯狂的 法律。 ——马 克·吐温 42、法律的力量应当跟随着公民，就 像影子 跟随着 身体一 样。— —贝卡 利亚 43、法律和制度必须跟上人类思想进 步。— —杰弗 逊 44、人类受制于法律，法律受制于情 理。— —托·富 勒