生物通专注生命科学研究进展

牛传染性鼻气管炎病毒重组gE蛋白

间接ELISA诊断方法的建立*

中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(12):29～33

王海燕1，2朱远茂1薛飞1**童光志1赵立平1相文华1韩文瑜3

（1 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所哈尔滨150001)

(2 哈尔滨医科大学动物学部哈尔滨1500863 吉林大学农学部长春130062）

摘要以重组牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白，经纯化后作为诊断抗原建立了检测牛血清特异性gE抗体的间接酶联免疫吸附试验，确定其最佳包被量为每孔1.075μg。样品稀释度为1:40，兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶5 000。判定标准为样品OD值大于0.582为阳性，小于0.472为阴性,在0.472与0.582之间为可疑。经抗特异性试验和重复性试验证明该方法特异性高、重复性好。在403份血清样品中，进口试剂盒检出234份阳性样品，该诊断方法检出248阳性样品，与进口试剂盒的符合率为94.3％，但该诊断方法检出率更高。在43份血清样品中，中和试验检出24份阳性样品，该诊断方法检出28份阳性样品，与中和试验的符合率为85.7％。应用该诊断方法调查了我国部分地区IBRV的感染率，发现这些地区的IBRV感染率为68.7％。

关键词牛传染性鼻气管炎牛疱疹病毒I型糖蛋白gE酶联免疫吸附试验

收稿日期：20050712修回日期：20050929

*国家“863”计划资助项目（2003AA241110），黑龙江省科技攻关计划资助项目

（GA02B501）

** 通讯作者，电子信箱：xuefeicnh@牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)属疱疹病毒科(herpesviridae)、α疱疹病毒亚科(Alpha herpesvirinae),在生物型上属于牛疱疹病毒Ⅰ型(bovine herpesvirus1,BHV 1)。IBRV是牛的一种重要的病原,可引起牛严重的呼吸道感染﹑结膜炎、脑炎、产奶下降、子宫炎、肠炎、传染性脓疱性外阴阴道炎(IPV)和流产［1］，该病还可引起继发细菌感染。一旦感染IBRV，病毒可潜伏三叉神经节或荐神经节造成潜伏感染或散毒，病牛可终身带毒，给本病的防制带来很大的困难［2］。牛传染性鼻气管炎（IBR）20世纪50年代首次在美国报道，70年代已经广泛流行于欧洲［3］。随着IBR在全球范围的广泛流行,各国也采取了不同的防制手段,包括屠宰阳性感染牛,使用修饰活疫苗﹑灭活疫苗或基因缺失标记疫苗等。尤其是gE缺失标记疫苗和gE/TK双基因缺失标记疫苗及其配套鉴别诊断方法在控制或消灭该病的根除计划中得到广泛的应用［4］。糖蛋白E（glycoprotein E, gE）是IBR病毒粒子的主要成分之一，它能够在病毒粒子表面及病毒感染细胞表面高水平表达，以细胞特异的方式影响病毒从感染细胞的释放，而且是中和抗体的主要作用靶位，因此gE是牛传染性鼻气管炎鉴别诊断的可靠标记［5］。gE基因对病毒复制是非必需的，但是gE基因缺失可影响病毒的复制及在细胞间的传播。Lehmann等［6］利用噬菌体展示技术并用4株gE特异性单克隆抗体鉴定了gE C端1个表位（氨基酸561~569），其它3株单抗没有显示特异性gE序列表位，但在gE富含脯氨酸区和N端与模拟表位具有显著的相关性。

牛传染性鼻气管炎的诊断主要包括病原鉴定和抗体检测。不同国家采取不同的诊断方法，如在丹麦阻断ELISA作为基础试验用于检测IBR抗体，其灵敏度是病毒中和试验的2倍。间接ELISA的灵敏度要比病毒中和试验高4~8倍。Florent等应用IgM抗体捕获ELISA法进行IBRV的早期感染检测，以针对牛IgM的第一单克隆抗体作为捕获抗体，而第二单克隆

抗体用来测定特异性抗病毒抗体。经检测感染和自然感染牛的血清样品证明在临床症状出现后5~10d即可检测到IBRV。Ackermann等［7］建立了双抗夹心ELISA法，Kramps等［8］报道了ELISA是敏感、特异的检测方法Wellenberg等［9］制备了两种单克隆抗体，用ELISA法检测了IBRV。

2005, 25(12)王海燕等：牛传染性鼻气管炎病毒重组gE蛋白间接ELISA诊断方法的建立中国生物工程杂志China Biotechnology Vol.25 No.12 2005

我国自上世纪70年代从进口种牛中发现了本病，并已分离和鉴定了病毒。1980年从新西兰进口牛中检测到抗体，随后在本地牛群中也查到抗体，并从广西当地牛群中分离到病毒。国内部分省区血清学普查结果表明，北京、广东、广西、河南、河北、新疆、山东、四川等地的黑白花奶牛、本地黄牛和水牛中都有IBRV感染，给养牛业造成一定的经济损失。杨春明［10］应用间接血凝试验,对青海省刚察地区的牛进行了IBR血清学调查显示IBRV感染率为30.6％。为了配合基因缺失标记疫苗的研究，本研究利用重组gE蛋白建立了检测特异性gE抗体的间接ELISA诊断方法。

1材料与方法1．1材料

1.1.1表达gE蛋白的工程菌能够表达IBRV gE蛋白的BL21菌种（具体生物学特性见文献［11］）

1.1.2血清IBR阳性和阴性血清均购自中国兽药监察所。

1.1.3主要试剂兔抗牛IgG辣根过氧化物酶(ＨＲＰ)标记抗体（Sigma 公司）;健康马血清由本室采集；ELx800酶标仪;96孔酶标板为Costar公司产品;其它试剂为上海生物工程有限公司产品。

1．2方法

1.2.1诊断抗原的制备IBRV糖蛋白gE的重组菌BL21在原核表达系统pET32a获得可溶性

表达，纯化后经免疫学鉴定具有良好的抗原性可作为诊断抗原。

1.2.2间接ELISA操作程序将纯化好的重组gE蛋白包被96孔聚苯乙烯微量反应板，4℃过夜，用洗液PBST（含有0.05% Tween20的0.01mol/L,pH7.4 PBS）洗涤3次，3~5min/次。用封闭液（含有10%马血清PBS）每孔200μl封闭1h，洗涤同前。将待检血清样品与pET32a空载体表达蛋白作用一定时间后加入反应板，每孔100μl，同时设标准阴阳性血清对照孔，每个样品重复1孔，37℃湿盒内作用1h，洗涤同前。将兔抗牛IgG辣根过氧化物酶标抗体用样品稀释液作适当稀释后，每孔100μl，37℃湿盒内作用1h后，洗涤同前。每孔加入100μl用磷酸盐柠檬酸缓冲液（pH5.0）配制的邻苯二胺底物溶液（OPD 4mg/10ml含15μl 30%的过氧化氢）。室温避光反应一定时间，用2mol/L硫酸溶液每孔50μl终止反应。用酶标仪测定波长490nm的光密度吸收值（OD值），根据标准判定阴阳性。

1.2.3判定标准的确定随机选取46份经中和试验检测为阴性的血清样品进行ELISA测定,对测定结果进行方差分析，根据以下标准设定临界值：样品ＯＤ值≥阴性样品平均ＯＤ值+3ｓ判为阳性; 样品ＯＤ值≤阴性样品平均ＯＤ值+2ｓ判为阴性；样品ＯＤ值在阴性样品平均ＯＤ值+2ｓ和阴性样品平均ＯＤ值+3ｓ之间判为可疑，对可疑样品应该再次进行试验，仍为可疑值判为阳性，如果条件允许可以根据临床症状进行辅助判断，或进行跟踪监测。(注:ｓ为标准方差)。

1.2.4敏感性试验对403份血清样品进行ELISA试验，并与法国IBRV 抗体间接ELISA试剂盒进行比较；另外随机选择43份血清样品进行ELISA检测，并与中和试验进行比较,同时设IBR阴、阳血清作为对照，分析比较结果以判定其符合率和敏感性。

1.2.5ELISA诊断方法的初步应用以确定的各种最佳条件进行试验。对采自不同地区共611份牛血清样品进行ELISA检测，初步调查IBRV感染率。