分子生物学常用技术在中医药研究中的应用实验课09RTPCR
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3
实验准备
4
实验步骤
1．分光光度计检测RNA的浓度与纯度 各 样 品 总 RNA 取 5ul 加 入 1ml 水 中 测 OD 值 ， 当 OD260/OD280≥1.8 时 ， 方 可 使 用 。 根 据 以 下 公 式 计 算 RNA的浓度： 样 品 总 RNA 含 量 （ ug/ul ） =OD260× 稀 释 倍 数 ×40/1000
2．在做2个样品以上的实验时，不管是反转录反 应还是PCR反应都应先配置试剂的共同混合物（共同 混合物包括RNase Free dH2O，Buffer，dNTP，Taq酶 ，MgCl2等），然后分装到每个反应管中，以保证各 试管不同试剂的用量一致，减少实验误差，同时还能 减少试剂的损失。
3．取反转录酶等酶类时，要轻轻混匀，避免起 气泡。分取之前要轻轻地离心收集到反应管底部，因 其粘度高，所以要慢慢地分取。
11
7．反转录反应可选择随机引物（Random mers） 、Oligo dT Primer和目的基因的下游引物三者之中的 任一种。但它们之间有细微的差异，其中随机引物适 合于链比较长或具有发夹结构的RNA，并适合所有种 类 的 RNA （ rRNA 、 mRNA 、 tRNA ） ； Oligo dT Primer只适合于具有poly（A）尾的mRNA，且扩增片 段的位置不能离poly（A）尾太远，其反转录效率很 高；目的基因的下游引物常常是在目的基因RNA的序 列已知情况下使用，其特异性很强。对于那些丰度低 的mRNA，可以同时采用不同的欲扩增基因的下游引 物共同反转录，这样，同一反转录产物可以同时开展 若干PCR，而且由于引物相对单纯，PCR成功的可能 性大。
13
9．鉴于传统RTPCR所固有的限制，在有条件的 实验室，可以采用荧光实时定量RTPCR（RTqPCR） 。
14
POMC荧光实时定量RTqPCR扩增检测 荧光实时定量RTqPCR产物电泳
15
芯片读数计算值
6000 5000 4000 3000 2000 1000
0
正常
邪毒
气虚
阳虚
阴虚
芯片检测结果
5
2．反转录
水
7ul
dNTP（each 10mM）
2ul
5×buffer
4ul
DTT（100mM）
1ul
RNAsin（40U/ul）
1ul
随机引物（100uM）
1ul
组织总RNA（2ug）
2ul
65℃ 5min，快速插入冰水中，冰上加入：
RNAsin（40U/ul）
1ul
M-MLV反转录酶（200U/ul）1ul
12
8．由于反转录酶的工作温度较低（一般为37℃ 或42℃），在反转录反应之前，RNA模板处理不当， 容易形成二级结构，或模板与引物之间有非特异性结 合。所以，先要将RNA模板与引物在没有反转录酶的 反应混合物用65℃，甚至70℃处理5至10分钟。这样 可以充分破坏RNA的二级结构，且引物和RNA模板之 间可以准确配对。同时65℃处理后，样品要迅速置于 冰水中冷却，并在冰上将反转录酶加入反应体系中。
10
4 ． 为 防 止 RNA 分 解 ， 应 避 免 多 次 冻 融 ， 应 将 RNA少量分装后保存于-70℃中。
5．最佳的PCR条件，因PCR扩增仪的不同、试管 不同而有所不同，所以最好先用内参基因作PCR反应 ，以摸索最佳的PCR条件。
6．目的基因PCR引物的选取常常是实验成功与 否的关键。一般来说，引物的长度在18～30个碱基之 间，引物过短会使特异性降低；引物碱基尽可能随机 分布，（G+C）含量在45～55%左右；引物内部不应 形成二级结构，两个引物之间不应有互补链存在；引 物3’末端的末位碱基最好选C、G而不选A、T。
8
实验结果
在紫外透射仪上，琼脂糖凝胶于DNA marker相应 分子量的位置，可见清晰的DNA条带。
通过光密度值与对应内参基因条带的光密度值的 比值，可作为该基因的相对转录量进行半定量分析。
9
注意事项
1．该实验使用的样品为RNA，因此在反转录过 程中，要特别注意防止RNA酶的污染。为此在反转录 过程中除使用RNA酶抑制剂外，所使用的枪头、试管 ，水等均建议用DEPC处理。
2 1.8 1.6 1.4 1.2
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 正常
邪毒
气虚
阳虚
阴虚
荧光实时定量RTqPCR结果
PomcmRNA/βactinmRNA
RT-PCR 结果
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0 正常
邪毒
气虚
阳虚
阴虚
RT-PCR 结果的定量分析
Pomc相对表达量
16
17
37℃ 60min，65℃ 5min（灭活逆转录酶）。 -20℃保存。
பைடு நூலகம்
6
3．PCR扩增
水
dNTP（each 0.5mM） 10×buffer MgCl2 （25mM） 上游引物（4uM） 下游引物（4uM） 反转录产物
Taq DNA聚合酶（5U/ul） 石腊油 25ul
20ul 4ul 4ul 4ul 2ul 2ul 4ul 0.4ul
实验 20
RT-PCR
1
目的
观察某一特定基因转录量的变化。反转录酶聚合 酶链式反应（RT-PCR）以其灵敏度高，要求样品量 少，实验周期短而倍受青睐。有人将RT-PCR实验结 果与Northern blot结果等进行比较分析，发现两种不 同方法所得到的实验结果相一致。
类 似 的 有 Northern blot 、 原 位 杂 交 ， 甚 至 原 位 PCR等。
PCR反应条件为94℃ 3min； 94℃ 40s，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环； 72℃ 5min→4℃ 保存。
7
4．电泳 取PCR产物20ul与上样缓冲液4ul混匀后，上样于 1.6%的琼脂糖凝胶中，其中一孔加DNA marker，80V 电压，电泳1小时。紫外透射仪下查看，并拍照。 5．图象处理 取电泳凝胶的底片，用KS400型图象分析系统进 行光密度扫描，以目的基因光密度值与对应内参基因 光密度值的比值作为该样品中目的基因的相对转录量 。最后以目的基因的相对转录量为参数进行半定量统 计分析。
2
原理
首先，以目的基因mRNA为模板，利用反转录酶 的活性，合成对应的cDNA。然后在模板cDNA、目的 基因特异引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依 靠Taq DNA聚合酶的酶促反应，通过变性、退火、延 伸的反复循环中，扩增出大量特异的目的DNA产物。 最后，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，显色，并 进行图象分析。
实验准备
4
实验步骤
1．分光光度计检测RNA的浓度与纯度 各 样 品 总 RNA 取 5ul 加 入 1ml 水 中 测 OD 值 ， 当 OD260/OD280≥1.8 时 ， 方 可 使 用 。 根 据 以 下 公 式 计 算 RNA的浓度： 样 品 总 RNA 含 量 （ ug/ul ） =OD260× 稀 释 倍 数 ×40/1000
2．在做2个样品以上的实验时，不管是反转录反 应还是PCR反应都应先配置试剂的共同混合物（共同 混合物包括RNase Free dH2O，Buffer，dNTP，Taq酶 ，MgCl2等），然后分装到每个反应管中，以保证各 试管不同试剂的用量一致，减少实验误差，同时还能 减少试剂的损失。
3．取反转录酶等酶类时，要轻轻混匀，避免起 气泡。分取之前要轻轻地离心收集到反应管底部，因 其粘度高，所以要慢慢地分取。
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7．反转录反应可选择随机引物（Random mers） 、Oligo dT Primer和目的基因的下游引物三者之中的 任一种。但它们之间有细微的差异，其中随机引物适 合于链比较长或具有发夹结构的RNA，并适合所有种 类 的 RNA （ rRNA 、 mRNA 、 tRNA ） ； Oligo dT Primer只适合于具有poly（A）尾的mRNA，且扩增片 段的位置不能离poly（A）尾太远，其反转录效率很 高；目的基因的下游引物常常是在目的基因RNA的序 列已知情况下使用，其特异性很强。对于那些丰度低 的mRNA，可以同时采用不同的欲扩增基因的下游引 物共同反转录，这样，同一反转录产物可以同时开展 若干PCR，而且由于引物相对单纯，PCR成功的可能 性大。
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9．鉴于传统RTPCR所固有的限制，在有条件的 实验室，可以采用荧光实时定量RTPCR（RTqPCR） 。
14
POMC荧光实时定量RTqPCR扩增检测 荧光实时定量RTqPCR产物电泳
15
芯片读数计算值
6000 5000 4000 3000 2000 1000
0
正常
邪毒
气虚
阳虚
阴虚
芯片检测结果
5
2．反转录
水
7ul
dNTP（each 10mM）
2ul
5×buffer
4ul
DTT（100mM）
1ul
RNAsin（40U/ul）
1ul
随机引物（100uM）
1ul
组织总RNA（2ug）
2ul
65℃ 5min，快速插入冰水中，冰上加入：
RNAsin（40U/ul）
1ul
M-MLV反转录酶（200U/ul）1ul
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8．由于反转录酶的工作温度较低（一般为37℃ 或42℃），在反转录反应之前，RNA模板处理不当， 容易形成二级结构，或模板与引物之间有非特异性结 合。所以，先要将RNA模板与引物在没有反转录酶的 反应混合物用65℃，甚至70℃处理5至10分钟。这样 可以充分破坏RNA的二级结构，且引物和RNA模板之 间可以准确配对。同时65℃处理后，样品要迅速置于 冰水中冷却，并在冰上将反转录酶加入反应体系中。
10
4 ． 为 防 止 RNA 分 解 ， 应 避 免 多 次 冻 融 ， 应 将 RNA少量分装后保存于-70℃中。
5．最佳的PCR条件，因PCR扩增仪的不同、试管 不同而有所不同，所以最好先用内参基因作PCR反应 ，以摸索最佳的PCR条件。
6．目的基因PCR引物的选取常常是实验成功与 否的关键。一般来说，引物的长度在18～30个碱基之 间，引物过短会使特异性降低；引物碱基尽可能随机 分布，（G+C）含量在45～55%左右；引物内部不应 形成二级结构，两个引物之间不应有互补链存在；引 物3’末端的末位碱基最好选C、G而不选A、T。
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实验结果
在紫外透射仪上，琼脂糖凝胶于DNA marker相应 分子量的位置，可见清晰的DNA条带。
通过光密度值与对应内参基因条带的光密度值的 比值，可作为该基因的相对转录量进行半定量分析。
9
注意事项
1．该实验使用的样品为RNA，因此在反转录过 程中，要特别注意防止RNA酶的污染。为此在反转录 过程中除使用RNA酶抑制剂外，所使用的枪头、试管 ，水等均建议用DEPC处理。
2 1.8 1.6 1.4 1.2
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 正常
邪毒
气虚
阳虚
阴虚
荧光实时定量RTqPCR结果
PomcmRNA/βactinmRNA
RT-PCR 结果
1.4
1.2
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0.8
0.6
0.4
0.2
0 正常
邪毒
气虚
阳虚
阴虚
RT-PCR 结果的定量分析
Pomc相对表达量
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37℃ 60min，65℃ 5min（灭活逆转录酶）。 -20℃保存。
பைடு நூலகம்
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3．PCR扩增
水
dNTP（each 0.5mM） 10×buffer MgCl2 （25mM） 上游引物（4uM） 下游引物（4uM） 反转录产物
Taq DNA聚合酶（5U/ul） 石腊油 25ul
20ul 4ul 4ul 4ul 2ul 2ul 4ul 0.4ul
实验 20
RT-PCR
1
目的
观察某一特定基因转录量的变化。反转录酶聚合 酶链式反应（RT-PCR）以其灵敏度高，要求样品量 少，实验周期短而倍受青睐。有人将RT-PCR实验结 果与Northern blot结果等进行比较分析，发现两种不 同方法所得到的实验结果相一致。
类 似 的 有 Northern blot 、 原 位 杂 交 ， 甚 至 原 位 PCR等。
PCR反应条件为94℃ 3min； 94℃ 40s，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环； 72℃ 5min→4℃ 保存。
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4．电泳 取PCR产物20ul与上样缓冲液4ul混匀后，上样于 1.6%的琼脂糖凝胶中，其中一孔加DNA marker，80V 电压，电泳1小时。紫外透射仪下查看，并拍照。 5．图象处理 取电泳凝胶的底片，用KS400型图象分析系统进 行光密度扫描，以目的基因光密度值与对应内参基因 光密度值的比值作为该样品中目的基因的相对转录量 。最后以目的基因的相对转录量为参数进行半定量统 计分析。
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原理
首先，以目的基因mRNA为模板，利用反转录酶 的活性，合成对应的cDNA。然后在模板cDNA、目的 基因特异引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依 靠Taq DNA聚合酶的酶促反应，通过变性、退火、延 伸的反复循环中，扩增出大量特异的目的DNA产物。 最后，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，显色，并 进行图象分析。