分子生物学常用技术在中医药研究中的应用实验课09RTPCR
分子生物学在检验医学中的应用课件
A-81 GAC-AAC Asp-Asn 外显子2丢失
A-220 AAA-GAA Lys-Glu 电荷变化
A-314 CGT-TGT Arg-Cys 电荷变化
A-20 插入C
移码突变
A-128 TGTTGT-TGT ValVal-Val 辅酶结合
A-213 丢失2 bp (CT)
移码突变
A-251 丢失20 bp
移码突变
—————————————————————————
分子生物学在检验医学中的应用
LDH-B基因变异类型
变异位置 DNA
氨基酸置换
B-6
AAA-GAA
Lys-Gly
B-35
GCC-GAG
Ala-Glu
B-103 变
8bp重复
B-131
AGT-CGT
Ser-Arg
B-139
丢失2 bp (TC)
分子生物学在检验医学中的应用
1）
2、 2、电泳异常带的分子性质研究
分子生物学在检验医学中的应用
1） LDH异常电泳酶谱
M4 H1M3 H2M2 H3M1 H4 LD-5 LD-4 LD-3 LD-2 LD-1
︱︱ ︱ ︱ ︱ ︱
︱ ︱ ︱︳ ︱︳ ︱︳ ︱︳ ︱ ︱︳ ︱︳ ︱︳ ︱︳
(+)
正常 H 缺失 M 缺失 H 变异 (slow) H 变异 (fast)
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
分子生物学在检验医学中的应用
BNIoutS/BNoutAs: sense ATGAAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC antisense CAT AAC CAG TCG GTA CAG CTA C FraGment lenGth 195 bp
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告RT-PCR实验报告一、引言RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA样本中的特定基因表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR技术，对目标基因在不同组织或条件下的表达进行定量分析，以进一步了解其功能和调控机制。
二、实验材料与方法1. 材料：- RNA样本：从不同组织或条件下提取的总RNA。
- RT-PCR试剂盒：包括逆转录酶、聚合酶、引物等。
- DNA分子量标记物：用于测定PCR产物的大小。
- 离心管、PCR管、PCR仪等实验器材。
2. 方法：（1）RNA提取：采用某种RNA提取试剂盒，按照说明书提取不同组织或条件下的总RNA。
（2）逆转录反应：将提取的RNA模板与逆转录酶、引物和其他试剂混合，进行逆转录反应，将RNA转录为cDNA。
（3）PCR扩增：将逆转录反应产生的cDNA作为模板，与引物和PCR试剂混合，进行PCR扩增。
（4）电泳分析：将PCR产物与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物的大小判断目标基因的表达水平。
三、实验结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地获得了目标基因在不同组织或条件下的表达数据，并进行了初步的分析和讨论。
1. RT-PCR结果分析我们首先进行了RNA提取和逆转录反应，得到了各组织或条件下的cDNA样本。
然后，我们设计了特异性引物，进行了PCR扩增。
最后，通过琼脂糖凝胶电泳，观察到了PCR产物的带型。
根据PCR产物的带型，我们可以初步判断目标基因在不同组织或条件下的表达水平。
比如，在组织A中，我们观察到了明显的PCR产物带，说明该基因在组织A中高表达；而在组织B中，PCR产物带较弱，说明该基因在组织B中低表达。
2. RT-PCR结果验证为了验证实验结果的准确性，我们进行了重复实验和对照实验。
通过对照实验，我们可以排除PCR扩增的假阳性结果。
通过重复实验，我们可以评估实验的重复性和稳定性。
在重复实验中，我们发现，不同实验之间的PCR产物带型一致，表明实验结果具有较好的重复性。
分子生物学技术在中医药研究中的应用 ppt课件
我们采用动物实验研究中药二仙汤（仙茅、淫羊藿、 巴戟天、当归、知母、黄柏）及其寒温两个拆方的作用机 理时发现，温肾药（仙茅、淫羊藿、巴戟天、当归）对老 年和去势大鼠下丘脑-垂体-性腺（去势动物观察肾上腺） 轴兴奋作用突出，而滋阴泻火药（知母、黄柏）对这些轴 的延缓衰老和保护作用突出，部分揭示出寒、温治法的差 别。联系到临床研究结果，显然，对那些激素、神经递质 水平高、热象明显的老年人，补肾以偏重于滋阴泻火为妥； 而对于那些激素、神经递质水平低、寒象明显的老年人， 补肾以偏重于温肾壮阳为妥。以上中医基础理论研究丰富 了中医学延缓衰老的理论和方法，对临床上延缓衰老的辨 证论治起到了积极的指导作用。
ppt课件 19
那么以上的作用是对细胞产生的直接作用，还是间接 的？ 研究发现来源于不同部位的 GnRH 细胞系，对 GnRH 的 表达数量有着很大的区别，比如 GT1-7（来源于发生在前脑 的肿瘤，接近 GnRH 细胞迁徙的终点）可以高表达 GnRH，而 Gn10（来源于 GnRH 细胞迁徙途中的肿瘤）GnRH 表达甚微— —这些细胞系成为理想的研究工具。 上海第二医科大学进而采用细胞生物学的研究方法， 发现与若干常用经典温肾中药复方相比，二仙汤能使 GnRH 细胞系 GT1-7 的 GnRH 分泌峰提前，并维持时间最长。 这些研究采用了细胞生物学和分子生物学技术加深了 我们对中药复方作用机制的认识。如果不借助分子生物学、 细胞生物学的技术和方法，我们便难以高效、准确、深入 地观察到中药复方作用的分子机制，也就无从开展更进一 步的深入研究，并在此基础上发展和丰富中医药学。
ppt课件
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3．分子生物学的发展历程 1871 年，首次发现 DNA（鲑精 DNA） 。 1943 年，证明 DNA 为遗传分子，而不是蛋白（1944，O T Avery）——敏锐的洞察力、对新现象的捕捉能力。 1953 年，DNA 双螺旋模型提出（J D Watson（美）和 F H C Crick（英） ，1962 年或诺贝尔生理学、医学奖） 。从而 为分子生物学这一学科奠基 ——敏锐的洞察力、多学科知识的综合运用。 1961 年 ， 合 成 mRNA ， 破 译 第 一 个 遗 传 密 码 （ M W Nirenberg（美） ，1968 年获诺贝尔生理学、医学奖） ——基础研究的创新，与推动人类文明的进步。 （以上被称为理论上的三大发现）
分子生物学技术在中医药领域的应用
分子生物学技术在中医药领域的应用
分子生物学技术在中医药领域的应用可以有多个方面，以下是一些常见的应用：
1.药物研发：分子生物学技术可以用于研究中草药中的活性成分、药效物质的作用机制以及其与疾病靶点的相互作用。
通过分析基因表达、蛋白质组学和基因组学数据，可以揭示中药的药效和治疗机制，进而加速新药的开发和筛选。
2.药效评估：分子生物学技术可以用于评估中药的药效和安全性。
例如，通过基因表达分析、代谢组学和蛋白质组学技术，可以研究中药对细胞和生物体内不同基因、蛋白质的表达和代谢的影响，从而评估中药的疗效和副作用。
3.质量控制：分子生物学技术可以用于中药的质量控制和品种鉴定。
例如，通过DNA条形码技术，可以对中药材进行快速、准确的鉴定和检测，确保中药的质量和纯度。
4.中药与基因相互作用研究：分子生物学技术可以帮助研究中药与基因之间的相互作用。
例如，基因多态性研究可以揭示不同个体对中药反应的差异，从而个体化用药和针对性治疗。
5.中药药效物质的合成：通过基因工程和细胞工程技术，可以合成和生产中药中的活性成分和药效物质，提高药物的纯度和稳定性，减少对传统中草药的依赖性。
这些分子生物学技术的应用，能够为中医药领域提供更深入的研究和发展，促进中药的现代化和科学化，进而提高中医药的临床应用水平。
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分子生物学技术在中医药研究中的应用
分子生物学技术在中医药研究中的应用中医在中国历史上始终占据着重要的地位，其临床理论体系更是独具特色。
中医药作为中国特有的药物治疗体系，它既遵循着历代医家积淀的理论，又借鉴了西医的发展规律，以独特的治疗方式与理论体系，有效地解决了疑难杂症，受到了广大病患的认可和社会的肯定。
不过，传统的中医药在疗效的评价过程中因为技术和设备的匮乏而总是存在着可靠性的疑虑。
近年来，分子生物学技术的发展使得中医药研究有了新的思路，它能够促进中医药发展到新的高度。
因此，对于如何在中医药研究中适当采用分子生物学技术，以期取得更好的疗效，具有重要的理论意义和实践意义。
分子生物学技术是一种生物学技术，主要用于检测和分析生物物质的结构和功能。
它可以帮助我们更深入地了解中药成分中的物质结构，以及药物作用机制。
同时，还可以通过结合生物技术进行药物设计，为药物的开发提供有力的技术支持。
例如，通过分子生物学技术可以建立药物成分与生物活性之间的关系，研究药物功能和药效的机制，以及开发新型药物，这些都是传统的方法所不能做到的，因此，分子生物学的应用也引发了中医药的研究工作。
此外，通过分子生物学技术还可以更准确地确定中药成分、中药复方的组分和组成及其含量，研究药物的合成及其调控机制，以及检测药物的性状和作用特性。
其次，分子生物学技术还有助于提高中药制剂的纯度和安全性，以及对药效成分进行评价，这对于研究中药药效和疗效均具有重要作用。
最后，分子生物学技术还可以用于建立中医药绥证制度，从而更好地促进中医药健康护理，并且为科学研究药物活性及其治疗机制提供理论依据。
总之，分子生物学技术用于中医药研究及其开发的应用，对于加深我们对中药的理论认识、改善中药的疗效，以及促进中药的健康护理等方面都具有重要意义，未来中文生物学技术在中医药研究中应用，必将发挥更大的作用。
PCR技术及其在中医药研究中的应用
PCR 技术及其在中医药研究中的应用长春中医学院 徐 莉 潘玉贞 邓明鲁Ξ摘要 通过介绍具有划时代意义的PCR 技术,以及它在中医药中的应用及前景,证明PCR 技术在未来中医药研究中(不论是基础理论还是临床实践),将起到不可估量的作用。
随着PCR 技术在中医药研究的广泛应用,它将极大地促进中医药的发展,为祖国医学走向世界作出贡献。
关键词 PCR 技术 中药鉴定 HBV PCR 技术1985年由美国PE —Cetus 公司的人类遗传研究室Mullis 等人发明的,具有划时代意义的聚合酶链反应(Polymerase chainreaction —PCR ),它使人们能够在体外进行DNA 的体内复制成为可能,只是在试管中给DNA 的体外合成提供一种合适条件———模板DNA 、寡合苷酸引物、DNA 聚合酶、合适的缓冲液系统和DNA 变性、复性及延伸的温度与时间等。
它的意义在于DNA 是遗传密码的载体,并且具有相对的遗传稳定性,每种生物都有其固定的遗传密码,它由一段段核酸片段组成,它通过复制的形式一代代遗传下去。
如果我们能够得到某种物质的微量细胞(甚至一个细胞),将其细胞内的遗传物质———DNA ———核酸片段提纯出来,再通过PCR 技术将其扩增,就会准确无误地判断该物质。
这项技术将成为中医药研究中重要的检测手段之一,并具有深远的意义。
1 PCR 的原理与操作1.1 基本原理PCR 是一种选择性体外扩增DNA 或RNA 片段的方法。
其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。
引物为待扩增DNA 片段两翼互补的寡核苷酸———ssDNA 片段。
待扩增DNA 模板加热变性后,两引物分别与两条DNA 的两翼序列特异复性。
此时,两引物的3’端相对,5’端相背。
在合适条件下,由Taq (或其它)DNA 聚合酶催化引物引导的DNA 合成,即引物的延伸。
这种在温度控制下的热变性———复性———延伸的过程就是一个PCR 循环,经过30个这样的循环后,就得到一定量的待扩增DNA 。
大学教学大纲_分子生物学技术在中医药研究中的应用
《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教学大纲Teaching Outline of 《Application of Molecular biologicaltechnique in TCM study》第一部分大纲说明课程代码：S0102开课时间：第二学期总学时数：48开课部门：基础医学院授课对象：硕士生考核方式：实验报告占80％；实验态度与动手能力占20％。
预修课程：生化，分子遗传学主讲教师：方肇勤，管冬元教材：方肇勤.分子生物学技术在中医药研究中的应用.上海科技出版社.2008年9月.第二版参考资料：（1）方肇勤主编《分子生物学技术在中医药研究中的应用》，上海科学技术出版社，2002年6月，第1版（2）黄培堂等译《分子克隆实验指南》，科学技术出版社，2002年8月，第3版。
（3）颜子颖等译《精编分子生物学实验指南》，科学技术出版社，1998年6月，第1版（4）李永明等著《实用分子生物学方法手册》，科学技术出版社，1998年6月，第1版第二部分教学内容和教学要求当前，分子生物学技术已经成为医学各个学科的关键技术，发挥着愈来愈重要的作用。
及时开设这一课程，使学员了解并初步掌握分子生物学的最常用、最基本的技术与方法，将有助于学员对医学新进展、新方法、新理论的理解，有助于学员对当前生命学科研究最前沿技术的认识，从而使中医院校培养的学员医、教、研能力得到进一步的加强。
本课程集中在实验技能方面给予培训，属于基本技能培训范畴。
主要内容包括：质粒，重组质粒，质粒转化大肠杆菌，鉴定，阳性克隆扩增，少量质粒制备。
酶切质粒，电泳鉴定，从凝胶中回收DNA。
真核细胞RNA提取。
RTPCR。
以及部分示教和理论课介绍：基因组DNA提取、Southern blot、PCR、点突变PCR、DNA双脱氧链终止法测序；组织总RNA提取、mRNA的分离、Northern blot、RTPCR、原位杂交、cDNA Array 和Micro Array、DDPCR、cDNA库建立、基因全序列cDNA库筛选、RACE PCR；Western blot、ELISA、免疫组织化学、单克隆抗体制备技术、双向等电聚焦凝胶电泳；报道基因、基因功能检测、Footprint、凝胶阻滞分析等。
rtpcr步骤及原理
rtpcr步骤及原理RTPCR步骤及原理摘要：反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测RNA或DNA中特定序列的数量。
本文将介绍RTPCR的步骤和原理，包括反转录、PCR扩增和结果分析等方面。
同时也会讨论RTPCR的优点、限制和在科研和临床中的应用。
引言在生物医学研究和临床实践中，准确测定RNA或DNA中特定基因或序列的表达水平或存在数量是非常重要的。
反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种被广泛应用的技术，能够对目标序列进行定量和扩增。
一、反转录反转录是RTPCR的第一步，也是从RNA到cDNA的转录过程。
这一步骤利用反转录酶将RNA模板转录成互补的cDNA。
反转录的关键是一条RNA模板和逆转录酶的结合，逆转录酶能够将RNA依据其互补碱基配对的原则合成cDNA。
反转录需要一些关键的试剂，如RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs等。
RNA模板是目标序列的来源，逆转录酶则是反转录的关键酶。
引物是用于使逆转录酶能够开始合成cDNA运输链的小片段，而dNTPs则是逆转录酶用来合成cDNA的原料。
二、PCR扩增PCR扩增是RTPCR的第二步，也是从cDNA扩增目标序列的过程。
PCR扩增是利用聚合酶将靶DNA序列经过多次循环扩增成数量可检测的水平。
PCR扩增需要两个引物，一个用于标记出序列的起始点，一个用于标记出序列的终止点。
PCR扩增需要通过一系列的循环反应来不断扩增目标序列。
每个循环有三个关键步骤：变性、退火和延伸。
变性是通过高温来使DNA 的两个链分离，退火是通过低温使引物与靶序列结合，延伸则是通过温度合适的聚合酶来合成新的DNA链。
三、结果分析RTPCR的结果分析可以通过几种不同的方法进行，最常见的是凝胶电泳和实时定量PCR。
凝胶电泳是一种常见的分离DNA片段的方法，可以将PCR扩增的产物根据大小分离成不同的带状，在凝胶上的迁移速率还可以推测出片段的大小，并对扩增的特定基因进行定性和定量分析。
《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案_百替生物
上海中医药大学《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（4）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数 48专业中医基础和中医临床专业授课教师方肇勤、管冬元、潘志强上海中医药大学《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（5）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数 48专业中医基础和中医临床专业授课教师方肇勤、管冬元、潘志强上海中医药大学《分子生物学技术在中医药研究中的应用》教案（6）课程名称分子生物学技术在中医药研究中的应用总学时数 48专业中医基础和中医临床专业授课教师方肇勤、管冬元、潘志强实验6 组织总RNA提取实验目的1．了解某一特定组织或细胞某一特定mRNA转录量的变化，如RT-PCR、Northern blot等。
2．了解某一特定组织或细胞全部mRNA转录量的变化，如DD-PCR、基因芯片等。
3．获得某一特定组织或细胞全部mRNA，以便建立cDNA库等。
4．获得某一特定组织或细胞全部RNA。
以上工作的前提是制备纯净且完整的RNA。
现代医学研究表明，人类的绝大多数疾病都是由若干基因表达的改变所引起的。
根据生物学“中心法则”原理，基因的表达包括转录与翻译两个阶段。
其中，由DNA到RNA的转录过程受到各种因素的调节，其调节水平反映出某种或某些特定的因素对相关基因表达的调节能力。
已有的研究一再表明，中医药所发挥的治疗与预防作用是直接或间接调整了基因的转录而实现的。
RNA主要由rRNA（占总量的80-85％），tRNA和核内小分子RNA（占总量的10-15％）以及mRNA（占总量的1-5％）所构成。
理论上认为每克组织（或108个培养细胞）可提取5-10mg RNA。
提取总RNA的方法有多种，比如：1）本实验介绍的方法，类似于本实验的Trizol方法（今天我们会介绍这样的方法），均称为一步法，方便而快捷。
缺点是RNA的获得量偏低，质量不够纯净。
2）超离心方法，可以获得丰富且质量高的RNA。
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告标题：rtpcr实验报告摘要：本实验使用了rtpcr技术对特定基因进行检测，通过分析实验结果，得出了基因表达水平的定量数据。
实验结果表明，该基因在不同条件下的表达水平存在显著差异，为进一步研究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
引言：rtpcr（reverse transcription polymerase chain reaction）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测特定基因的表达水平。
通过rtpcr实验，我们可以定量分析基因在不同组织、不同条件下的表达情况，从而深入研究基因在生物学过程中的作用。
材料与方法：1. 样本准备：收集不同组织或细胞系的样本，提取总RNA。
2. 反转录：使用反转录酶将RNA转录成cDNA。
3. pcr扩增：设计引物，进行实时荧光定量pcr扩增。
4. 数据分析：利用实时pcr仪器收集数据，进行定量分析。
结果：通过rtpcr实验，我们得到了不同组织或细胞系中特定基因的表达水平数据。
实验结果显示，在不同条件下，该基因的表达水平存在显著差异。
例如，在刺激条件下，基因的表达水平明显上调；而在抑制条件下，基因的表达水平则显著下调。
这些数据为我们进一步探究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
讨论：rtpcr实验结果表明，特定基因在不同条件下的表达水平存在显著差异。
这表明该基因可能在特定生物学过程中发挥重要作用，或者受到外部环境的调控。
进一步的研究可以探究该基因在细胞信号传导、代谢调控等方面的作用机制，为相关疾病的治疗提供理论依据。
结论：通过rtpcr实验，我们成功地分析了特定基因在不同条件下的表达水平。
实验结果表明，该基因在生物学过程中可能发挥重要作用，为进一步研究该基因的功能和调控机制提供了重要参考。
这项研究为深入探究基因在生物学过程中的作用提供了重要的实验基础。
rtpcr的原理实验步骤及应用
RTPCR的原理实验步骤及应用概述逆转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，简称RT-PCR），是一种常用的分子生物学实验技术，用于检测和定量分析RNA分子在细胞中的表达水平。
本文将介绍RT-PCR的原理、实验步骤及应用。
原理RTPCR利用逆转录酶（Reverse Transcriptase，简称RT）将RNA模板逆转录为cDNA（complementary DNA），然后通过聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）对cDNA进行扩增，最终得到大量的目标DNA片段。
RT-PCR的基本原理如下：1.逆转录：反转录酶RT利用RNA模板合成与之互补的cDNA。
在逆转录过程中，需要引入一条逆转录引物（反向互补RNA链）作为反转录的起始点。
2.PCR扩增：将逆转录合成的cDNA作为模板，引入一对特异性引物，通过PCR反应进行DNA扩增。
PCR反应分为三个步骤：变性、退火和扩增。
3.变性：将反应温度升高至95°C，使DNA双链变性为两条单链。
4.退火：将反应温度降低至特异性引物的退火温度，使引物与模板序列互相结合。
5.扩增：将反应温度升高至适合DNA聚合酶的活性温度，使DNA聚合酶逆反应合成DNA。
通过多轮的PCR反应，可以扩增出大量的目标DNA片段，其数量呈指数级增长。
实验步骤1. 样品处理首先需要从待检测的样品中提取总RNA，常用的提取方法有酚氯仿法和柱式纯化法。
提取得到的总RNA需要通过比色法或者用分光光度计进行测量，确保样品的质量和浓度。
2. 逆转录反应逆转录反应是将RNA模板转录为cDNA的过程。
需要准备逆转录试剂盒，主要包括逆转录酶、随机引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液。
按照试剂盒说明书的配方，将总RNA与逆转录试剂混合，进行逆转录反应。
反应结束后，需要进行热灭活，以停止反应。
分子生物学技术在医学检验中的有效应用
分子生物学技术在医学检验中的有效应用近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，其在医学检验中的应用越来越广泛。
分子生物学技术能够准确、快速地检测出人体内的一些疾病或病原体，具有更高的检测准确性和敏感性，在诊断早期疾病、筛查潜在风险等方面具有优势。
以下是分子生物学技术在医学检验中的有效应用。
1. PCR技术聚合酶链式反应（PCR）技术是分子生物学检测中最常用的技术之一。
PCR技术能够在人体样本中放大特定基因区域的DNA序列，从而检测出某些遗传病变、病原体、病毒和肿瘤等。
例如，在肝炎病毒检测中，PCR可以在很低的病毒负载下进行检测，并可以快速确定肝炎病毒基因型。
在医学检验中，PCR的应用已经进一步扩大，例如在DNA鉴定、父权确认、生殖健康评估和临床诊断等方面得到广泛应用。
2. 基因芯片基因芯片是一种用于检测数千种基因变异的计算机芯片。
其利用DNA探针，可以在单个基因芯片上检测出大量想要拓宽的突变；同时，也可用于做基因表达谱检测。
目前，在肿瘤检测中已经广泛应用，它能够检测和分析肿瘤患者的基因组，从而确定癌症的亚型、预后和治疗策略。
其它方面，基因芯片在药物研发、环境监测和食品品质控制等领域中也得到广泛应用。
3. 二代测序技术随着二代测序技术的发展，这种技术已成为很多医学检验中必不可少的手段。
二代测序技术可以在几小时内，对完整基因组进行测序，其速度和效率均远远高于传统的Sanger 测序技术。
在疾病基因组学中，二代测序技术能够寻找并确定与疾病相关的突变或基因组中的异常位点。
这些信息有可能成为生物标志物的，以帮助预测疾病发展和制定个性化的治疗方案。
该技术在人类遗传学、新药开发、检测病毒和节省人力的资源等方面也得到广泛利用。
近年来，融合PCR和二代测序技术已经被广泛应用，并被认为将成为医学检测的标准。
该技术技术遵循了PCR技术的基础框架，结合了二代测序技术的分析能力。
此技术巧妙地结合了两种先进技术，从而拓宽了临床检测的应用领域。
分子生物学RTPCR
琼脂糖凝胶电泳结果分析
DNA分子中含有磷酸基和碱基，在生理条 件下，磷酸基中的羟基发生解离，因此 DNA带负电在电场中向正极移动。
数量分析：条带的宽度、荧光的亮度 质量分析：纯度，分子量
琼脂糖凝胶电泳结果分析
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RT-PCR实验原理
RT(反转录)
PCR
m-RNA
c-DNA
PCR产物
这R里T-修PC改R标实题验原理
RT-PCR实验步骤——提取总RNA
TRIzol法抽提总RNA 1、细胞1×107 或组织100mg,加1mlTRIzol (细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块匀浆要彻底， 后转至EP管）
Taq酶
2.5U/μl
DEPC水
混匀
体积 (5μl_) (0.5μl) (1μl) (1μl) (1-10μl) (1μl) 20μl-4.3μl
28-36循环，4℃保温
RT-PCR实验步骤——琼脂糖凝胶电泳
加1-10μl PCR产物与上样缓冲液（12.5μl）混匀，加样，电泳。 成像系统进行成像分析。
混匀，离心，42℃ 50min。
3、95℃ 10min（破坏MLV,终止反应），4℃保存。
RT-PCR实验步骤——聚合酶链反应(PCR)
PCR反应：
反应体系：总体积20μl(50μl)
试剂
浓度
Taq Buffer 10×
dNTP
10mM
上游引物
10pmol/μl
下游引物
10pmol/实验步骤——反转录（RT）
逆转录反应：
1、 RNA 1-5μg,加入适量的DEPC水至11μl Oligo(dT)15 1μl 混匀，离心，70℃ 10min。
分子生物学与现代中医药学
分子生物学与现代中医药学一．分子生物学技术在中医方面的应用1.应用Rt-PCR 技术发现肾阳虚证和下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素释放激素(CRF) 的mRNA 表达受抑, 从而将肾阳虚证定位在下丘脑。
2.活血化瘀方药对血管平滑肌细胞增殖的影响,证明化瘀类中药血管通可抑制血管壁血小板衍化生长因子(PDGF) 基因表达,并可使血管壁原癌基因c-myc的mRNA 表达水平下降,表明活血化瘀药能在细胞和基因水平发挥干预作用。
3.衰老这一生命现象的变化,是相互联系的多虚实因素综合作用的结果。
沈少珩等研究发现老年大鼠肝组织超氧化物歧化酶(SOD) 、过氧化氢酶(CAT) 的活性降低与其酶蛋白的mRNA 表达水平减弱相关,经中药二仙汤及其拆方治疗后, SOD和CAT 活性升高,其mRNA 基因表达水平也随之增强有关。
廖柏松等观察了二仙汤对老年前期雌性大鼠下丘脑内阿片肽含量及其mRNA水平的调节作用,发现二仙汤明显提高老年前期大鼠下丘脑EOP 的基因转录水平(mRNA 水平) 和基因表达水平( EOP 含量) ,向青年鼠水平靠拢。
4.吴志奎等〔20〕认为DNA 甲基化水平的提高可维持基因的正常表达,阻止异常基因(癌基因、衰老基因) 的表达,用HPLC 法分析了生理性肾虚老龄大鼠肝细胞DNA 的甲基化水平,发现神方补肾生血药可明显增高其DNA 的甲基化水平。
二.分子生物学技术用于中医临床研究1.运用补肾生血药治疗β-地中海贫血,能明显提高β-地中海贫血患者血红蛋白和抗碱血红蛋白,提高血红蛋白珠蛋白链比,通过Rt-PCR 检测,该药能促进γ-珠蛋白的mRNA 基因转录和表达,诱导HbF合成,从而代偿了γ-珠蛋白基因缺陷。
2.王树庆等，杜元才等使用丹参佐以核糖核酸治疗肝硬化腹水,可能与RNA 优先进入肝细胞,在丹参的协同下较持久保持其信息大分子的完整性,改善肝脏微循环及促进肝细胞正常代谢有关。
张培宇等使用四君子汤配合RNA ,可从不同角度提高晚期化疗患者的免疫功能,改善人体一般生理状态,并可提高化疗完成率。
PCR原理及其在中药领域的应用
PCR原理及其在中药领域的应用1. PCR原理聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）是一种分子生物学技术，它能够在体外扩增DNA片段。
PCR通过逐渐增加DNA片段的数量，从而使微小的DNA样本扩大到足够大的量，以便于进一步研究和应用。
PCR的原理主要包括以下三个步骤： - 变性（Denaturation）：将DNA双链使之解开成两条单链，这一步需要高温来断开氢键，使得DNA的双链变成两条单链。
- 引物结合（Annealing）：通过降低温度，引物与DNA相互结合，使DNA的两条单链上的引物分别与其互补序列结合，形成稳定的引物-DNA复合物。
- 扩增（Extension）：提高温度，使热稳定DNA聚合酶结合到引物-DNA复合物上，并以DNA复制为模板进行DNA的合成。
这一步会将DNA从5’端不断延长，生成新的DNA链。
通过一系列的循环，每个循环都会使DNA数量成倍增加。
PCR可以迅速扩增目标DNA，在短时间内得到大量的目标DNA片段。
2. PCR在中药领域的应用PCR技术在中药领域有着广泛的应用。
以下列举了一些PCR在中药领域的具体应用：2.1 鉴定中药材的真伪中药材虽然具有独特的药用价值，但是由于市场上假冒伪劣产品层出不穷，中药鉴定面临了很大的问题。
PCR技术可以通过扩增目标DNA片段，进一步检测中药材的真实成分。
例如，通过对中药材中的特定基因片段进行PCR扩增和分析，可以准确鉴定中药材的真伪，并防止假冒伪劣产品的流通。
2.2 检测中药材的质量中药材的质量直接影响着药效的稳定性和安全性。
PCR技术可以用来检测中药材中的有毒或有害物质。
通过针对特定基因片段的PCR扩增和分析，可以快速、准确地检测中药材中是否含有对人体有害的成分，从而保证中药材的质量和安全性。
2.3 基因多样性研究中药材中的有效成分来自于天然植物，而不同地理环境和生长条件下的植物基因组存在差异。
rtpcr原理及应用
rtpcr原理及应用RT-PCR原理及应用。
RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种基因分子生物学技术，它结合了逆转录和聚合酶链式反应两种方法，可以在研究中对RNA进行扩增，从而检测和分析特定基因的表达水平。
本文将介绍RT-PCR的原理和应用，以便更好地理解和运用这一技术。
RT-PCR的原理。
RT-PCR的原理主要包括逆转录和聚合酶链式反应两个步骤。
首先是逆转录，即将RNA转录为cDNA（complementary DNA），这是因为在常规的PCR反应中需要DNA作为模板，而RNA不能直接作为PCR的模板。
逆转录过程中，需要逆转录酶和RNA模板，通过逆转录酶的作用，RNA被逆转录为cDNA。
接着是聚合酶链式反应，即利用DNA聚合酶对cDNA进行扩增，通过PCR反应使特定基因的DNA序列得以扩增，从而进行后续的分析和检测。
RT-PCR的应用。
1. 基因表达分析。
RT-PCR可以用于研究特定基因在不同组织、细胞类型或生理状态下的表达水平。
通过逆转录和PCR扩增，可以定量检测特定基因的mRNA水平，从而了解其在生物体内的表达情况。
2. 病原体检测。
RT-PCR可以用于检测病原体，如病毒、细菌等的RNA或DNA，从而进行疾病的诊断和监测。
例如，在流感疫情监测中，RT-PCR可以快速、准确地检测流感病毒的存在，为疫情防控提供重要依据。
3. 肿瘤标志物检测。
RT-PCR可以用于检测肿瘤标志物的表达水平，帮助肿瘤的早期诊断和疗效监测。
通过检测肿瘤相关基因的表达水平，可以及早发现潜在的肿瘤病变，为临床治疗提供参考。
4. 药物研发。
RT-PCR可以用于药物研发中的基因表达分析和药效评价。
通过比较药物处理前后特定基因的表达水平变化，可以评估药物对基因表达的影响，为药物研发提供重要参考。
5. 遗传病检测。
RT-PCR可以用于遗传病的检测和分析，例如常见的遗传性疾病、基因突变等。
深入理解rt pcr原理及应用
深入理解rt pcr原理及应用标题：深入理解RT-PCR原理及应用引言：RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一项重要的实验技术，广泛应用于分子生物学和医学研究领域。
本文将深入探讨RT-PCR的原理、操作步骤以及其在基因表达分析、传染病诊断和生物医学研究中的应用。
通过本文的阐述，读者将能够更好地理解RT-PCR的工作原理，并对其潜在应用有更全面的了解。
一、RT-PCR的基本原理1.1 反转录过程反转录过程是RT-PCR的核心步骤之一，其将RNA模板转录为相应的互补DNA（cDNA）。
该步骤涉及到逆转录酶的使用，它能够将RNA 模板上的核酸序列转录为互补的DNA序列。
1.2 PCR扩增过程PCR扩增是RT-PCR的另一个重要步骤，其能够使得少量的目标DNA 序列在体外迅速扩增至丰富、可检测的数量。
PCR扩增通过反复进行热循环，包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
在合适的条件下，DNA模板将被不断复制，生成指数级增加的扩增产物。
二、RT-PCR的操作步骤2.1 样本和试剂的准备在开始RT-PCR实验之前，首先需要准备好待分析的样本和所需的试剂，包括RNA提取试剂、RT反应试剂盒和PCR扩增试剂盒等。
2.2 反转录反应反转录反应是RT-PCR的第一步，其将RNA转录为cDNA。
该步骤中需要逆转录酶和引物，逆转录酶能够合成互补的DNA链，引物用于定向引导逆转录酶合成。
2.3 PCR扩增反应在完成反转录反应后，接下来是PCR扩增反应。
PCR扩增反应需要合适的引物以及热稳定的DNA聚合酶。
通过合理设计引物和优化反应条件，可以实现特定基因序列的选择性扩增。
三、RT-PCR应用领域3.1 基因表达分析RT-PCR被广泛用于基因表达分析，可以检测和定量目标基因在不同组织和细胞类型中的表达水平。
这项技术能够揭示基因在生物体中的表达模式，并为研究基因功能、生物发育和疾病机制提供重要依据。
分子生物学技术在医学诊断中的应用研究
分子生物学技术在医学诊断中的应用研究随着科学技术的不断进步，分子生物学技术在医学领域的应用逐渐变得广泛起来。
分子生物学技术主要指的是通过研究生物分子（如DNA、RNA、蛋白质等）的结构、功能和相互作用等方面来揭示生命现象的基本规律。
而这些技术在医学诊断中的应用则主要是利用分子生物学技术对疾病的基因、蛋白质等分子进行检测和鉴定，以实现对疾病的准确诊断、预测和治疗。
本文将主要就分子生物学技术在医学诊断中的应用进行探讨和研究。
一、PCR技术在医学诊断中的应用研究聚合酶链式反应（PCR）技术是一种快速、灵敏和特异的分子生物学技术，可以对非常微小的DNA样品进行快速扩增，从而达到对DNA序列的分析和鉴定。
PCR技术在医学诊断中的主要应用是检测病原微生物、基因突变和遗传病等方面。
例如，PCR技术可以用于检测各种病原微生物，如病毒、细菌、真菌等，通过在样品中扩增微生物的DNA序列，从而达到对微生物的鉴定。
PCR 技术还可以用于检测遗传突变，从而对遗传性疾病进行准确诊断和预测。
此外，PCR技术还可以用于分析药物代谢机制，并辅助药物治疗的个体化。
二、蛋白芯片技术在医学诊断中的应用研究蛋白芯片技术是一种利用生物芯片进行蛋白质高通量检测和分析的技术，可使研究人员快速、准确地检测和测定各种蛋白质样品。
蛋白芯片技术在医学诊断中的应用主要是对血液及其它体液样品中蛋白质的检测和鉴定。
通过蛋白芯片技术，可以检测患者血液中各种关键蛋白质的种类、含量和表达水平等，从而辅助医生对疾病的诊断和治疗。
蛋白芯片技术还可以应用于药物筛选和治疗效果监测等方面。
三、基因测序技术在医学诊断中的应用研究基因测序技术是一种利用分子生物学方法对DNA序列进行测定的技术，是分子生物学技术中的重要分支之一。
基因测序技术在医学诊断中的应用主要是对遗传疾病、基因突变等方面进行检测和鉴定。
通过对个体的基因序列进行测定，可以帮助医生判断遗传疾病的发病风险，诊断疾病和制定精准化治疗方案。
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2 1.8 1.6 1.4 1.2
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 正常
邪毒
气虚
阳虚
阴虚
荧光实时定量RTqPCR结果
PomcmRNA/βactinmRNA
RT-PCR 结果
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0 正常
邪毒
气虚
阳虚
阴虚
RT-PCR 结果的定量分析
Pomc相对表达量
16
17
3
实验准备
4
实验步骤
1．分光光度计检测RNA的浓度与纯度 各 样 品 总 RNA 取 5ul 加 入 1ml 水 中 测 OD 值 ， 当 OD260/OD280≥1.8 时 ， 方 可 使 用 。 根 据 以 下 公 式 计 算 RNA的浓度： 样 品 总 RNA 含 量 （ ug/ul ） =OD260× 稀 释 倍 数 ×40/1000
8
实验结果
在紫外透射仪上，琼脂糖凝胶于DNA marker相应 分子量的位置，可见清晰的DNA条带。
通过光密度值与对应内参基因条带的光密度值的 比值，可作为该基因的相对转录量进行半定量分析。
9
注意事项
1．该实验使用的样品为RNA，因此在反转录过 程中，要特别注意防止RNA酶的污染。为此在反转录 过程中除使用RNA酶抑制剂外，所使用的枪头、试管 ，水等均建议用DEPC处理。
实验 20
RT-PCR
1
目的
观察某一特定基因转录量的变化。反转录酶聚合 酶链式反应（RT-PCR）以其灵敏度高，要求样品量 少，实验周期短而倍受青睐。有人将RT-PCR实验结 果与Northern blot结果等进行比较分析，发现两种不 同方法所得到的实验结果相一致。
类 似 的 有 Northern blot 、 原 位 杂 交 ， 甚 至 原的限制，在有条件的 实验室，可以采用荧光实时定量RTPCR（RTqPCR） 。
14
POMC荧光实时定量RTqPCR扩增检测 荧光实时定量RTqPCR产物电泳
15
芯片读数计算值
6000 5000 4000 3000 2000 1000
0
正常
邪毒
气虚
阳虚
阴虚
芯片检测结果
10
4 ． 为 防 止 RNA 分 解 ， 应 避 免 多 次 冻 融 ， 应 将 RNA少量分装后保存于-70℃中。
5．最佳的PCR条件，因PCR扩增仪的不同、试管 不同而有所不同，所以最好先用内参基因作PCR反应 ，以摸索最佳的PCR条件。
6．目的基因PCR引物的选取常常是实验成功与 否的关键。一般来说，引物的长度在18～30个碱基之 间，引物过短会使特异性降低；引物碱基尽可能随机 分布，（G+C）含量在45～55%左右；引物内部不应 形成二级结构，两个引物之间不应有互补链存在；引 物3’末端的末位碱基最好选C、G而不选A、T。
11
7．反转录反应可选择随机引物（Random mers） 、Oligo dT Primer和目的基因的下游引物三者之中的 任一种。但它们之间有细微的差异，其中随机引物适 合于链比较长或具有发夹结构的RNA，并适合所有种 类 的 RNA （ rRNA 、 mRNA 、 tRNA ） ； Oligo dT Primer只适合于具有poly（A）尾的mRNA，且扩增片 段的位置不能离poly（A）尾太远，其反转录效率很 高；目的基因的下游引物常常是在目的基因RNA的序 列已知情况下使用，其特异性很强。对于那些丰度低 的mRNA，可以同时采用不同的欲扩增基因的下游引 物共同反转录，这样，同一反转录产物可以同时开展 若干PCR，而且由于引物相对单纯，PCR成功的可能 性大。
5
2．反转录
水
7ul
dNTP（each 10mM）
2ul
5×buffer
4ul
DTT（100mM）
1ul
RNAsin（40U/ul）
1ul
随机引物（100uM）
1ul
组织总RNA（2ug）
2ul
65℃ 5min，快速插入冰水中，冰上加入：
RNAsin（40U/ul）
1ul
M-MLV反转录酶（200U/ul）1ul
2．在做2个样品以上的实验时，不管是反转录反 应还是PCR反应都应先配置试剂的共同混合物（共同 混合物包括RNase Free dH2O，Buffer，dNTP，Taq酶 ，MgCl2等），然后分装到每个反应管中，以保证各 试管不同试剂的用量一致，减少实验误差，同时还能 减少试剂的损失。
3．取反转录酶等酶类时，要轻轻混匀，避免起 气泡。分取之前要轻轻地离心收集到反应管底部，因 其粘度高，所以要慢慢地分取。
37℃ 60min，65℃ 5min（灭活逆转录酶）。 -20℃保存。
6
3．PCR扩增
水
dNTP（each 0.5mM） 10×buffer MgCl2 （25mM） 上游引物（4uM） 下游引物（4uM） 反转录产物
Taq DNA聚合酶（5U/ul） 石腊油 25ul
20ul 4ul 4ul 4ul 2ul 2ul 4ul 0.4ul
2
原理
首先，以目的基因mRNA为模板，利用反转录酶 的活性，合成对应的cDNA。然后在模板cDNA、目的 基因特异引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依 靠Taq DNA聚合酶的酶促反应，通过变性、退火、延 伸的反复循环中，扩增出大量特异的目的DNA产物。 最后，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，显色，并 进行图象分析。
12
8．由于反转录酶的工作温度较低（一般为37℃ 或42℃），在反转录反应之前，RNA模板处理不当， 容易形成二级结构，或模板与引物之间有非特异性结 合。所以，先要将RNA模板与引物在没有反转录酶的 反应混合物用65℃，甚至70℃处理5至10分钟。这样 可以充分破坏RNA的二级结构，且引物和RNA模板之 间可以准确配对。同时65℃处理后，样品要迅速置于 冰水中冷却，并在冰上将反转录酶加入反应体系中。
PCR反应条件为94℃ 3min； 94℃ 40s，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环； 72℃ 5min→4℃ 保存。
7
4．电泳 取PCR产物20ul与上样缓冲液4ul混匀后，上样于 1.6%的琼脂糖凝胶中，其中一孔加DNA marker，80V 电压，电泳1小时。紫外透射仪下查看，并拍照。 5．图象处理 取电泳凝胶的底片，用KS400型图象分析系统进 行光密度扫描，以目的基因光密度值与对应内参基因 光密度值的比值作为该样品中目的基因的相对转录量 。最后以目的基因的相对转录量为参数进行半定量统 计分析。