293细胞的大规模培养
293T细胞培养攻略
293T细胞培养攻略1.培养基准备293T细胞通常使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）作为培养基，配以10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）。
在培养293T细胞之前，首先将适量的DMEM加热至37°C，并将相应数量的胎牛血清和抗生素加入其中。
2.细胞传代传代细胞是保持293T细胞健康生长和细胞性能的重要步骤。
当细胞达到80-90%的密度时，可以开始细胞传代。
首先，用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养瓶中的培养基洗涤一次，然后用0.25%胰酶/EDTA（乙二胺四乙酸）溶液将细胞溶解5-10分钟。
溶解后，加入与胰酶/EDTA液体相等的培养基，轻轻悬浮细胞，并将其移至新的培养瓶中。
将新的培养基加入新瓶中，以使其达到适当的细胞密度。
3.293T细胞的培养条件4.细胞转染293T细胞被广泛用于转染实验。
细胞转染是将外源DNA转运到293T 细胞中的方法，以研究基因功能或进行蛋白表达。
293T细胞的易于转染性质使其适合于多种转染实验，包括常规的钙磷法和化学法（如聚乙烯亚胺）以及电穿孔法。
在进行转染实验之前，应将细胞培养至80-90%的密度，并在转染之后对其进行恢复。
5.结束实验时的保存和冻存细胞在完成实验后，如果有需要保存细胞的需求，可以将293T细胞冻存。
为此，收集细胞，并用DPBS（无菌磷酸盐缓冲液）洗涤细胞。
然后，用0.25%胰酶/EDTA液解细胞5分钟，并加入相等体积的培养基以停止胰酶的作用。
将细胞离心，并以适当的速度冻存保护液（如10%DMSO和90%FBS）重新悬浮细胞。
将细胞悬浮液分装至冻存管中，并使用液氮保存。
总结：293T细胞是一种常用的细胞系，在生物医学研究中发挥着重要作用。
通过遵循上述培养攻略，可以获得高质量和可靠的293T细胞培养结果。
有针对性的细胞传代、定期更换培养基、温度和CO2的适当控制以及正确的细胞转染和细胞冻存步骤可以确保细胞的生长和稳定性，为细胞实验提供最佳条件。
293T细胞的培养[1]
![293T细胞的培养[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/d6a8872378563c1ec5da50e2524de518964bd36d.png)
293T细胞的培养[1]293T细胞的培养293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
293T为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。
培养条件为: 完全培养基: 高糖DMEM, 10%胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。
传代方法为:1．吸掉293T细胞培养瓶内的培养液;2．吸取适量的无Ca 2+和Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍;3．加少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2的培养瓶加1 ml, 75 cm 2的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s;4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液;5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。
值得注意的是, 293T细胞的贴壁性不强, 轻微的干扰就可能使它们脱落。
所以, 在更换新鲜培养液或者用PBS冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。
传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可轻松把细胞消化下来, 不需要消化很长时间。
有些同学反映293T细胞容易结团不易被吹打开来。
如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿1 ml移液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 然后加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚在一起。
一般293T细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到90%融合, 再以1∶4~1∶8的比率传代。
合适的传代周期为2~3天。
传代过程中,消化的时间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培养液中止。
完成传代后放入培养箱前,应该把培养瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下, 防止细胞都聚在中间或者四周。
冷冻293T细胞的冻存液可以用95%小牛血清加5%二甲基亚砜, 复苏率很高。
293t细胞冻存步骤
293T细胞是一种广泛应用于细胞生物学和分子生物学研究中的细胞系，冻存293T细胞的 步骤如下：
1. 细胞培养：将293T细胞在含有适当培养基（如DMEM）和10%胎牛血清（FBS）的细 胞培养皿中培养。细胞应保持在37℃、5% CO2的培养箱中，并定期更换培养基。
2. 细胞准备：当293T细胞生长至80%-90%的密度时，准备细胞用于冻存。将细胞从培养 皿中用胰酶或三胰蛋白酶等酶解剂进行胶原酶消化，使细胞分散成单细胞悬浮液。
3. 细胞计数：使用细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数，以确定细胞的浓度。
293t细胞冻存步骤
4. 细胞冻存液的配制：根据细胞密度计算所需的冻存液量。常用的冻存液配方包括含有 10% DMSO（二甲基亚砜）的培养基。将DMSO缓慢加入到培养基中，充分混合。
5. 细胞冻存：将细胞悬浮液冻存液按照适当比例混合，使细胞最终的浓度为1-2×10^6 细胞/mL。将混合液分装到冻存管中，每管约放入1-2 mL的混合液。然后将冻存管放入冷冻 容器中，以-80℃或液氮中的-196℃进行冷冻。
6. 细胞保存：将冻存管转移到液氮罐中进行长期保存。细胞在液氮中保存时可以长期保持 其生物学特性。
293t细胞冻存步骤
需要注意的是，在进行细胞冻存时，应注意细胞的健康状态、冻存液的配制和细胞密度的 控制，以确保冻存后的细胞能够保持其生物学特性和可用性。
细胞培养心得
目录293和293T293T细胞的培养心得293T细胞的培养与传代Jurcat细胞的传代悬浮细胞培养方法Jurcat细胞培养方法293T细胞的培养心得点击次数： 12 发表于：2008-08-24 23:25转载请注明来自丁香园来源：丁香园293T细胞差点被我养死，幸好我又将它起死回生，一点心得。
细胞传代：当细胞在细胞培养瓶内长满达到80％时就要传代，一传二，24小时后再传代。
48小时传就不好了，如果在24小时后细胞没有长到80％，应该换新的培养基，不然，培养基变黄，细胞脱落。
细胞消化：将细胞培养瓶竖立放置，吸走培养基，如果培养基中的脱落细胞较多，说明细胞现在很容易脱落，只要加入1ml的PBS+EDTA(0.02%)，来回轻微晃动培养瓶直到细胞完全脱落，加入10mlMEM(10%杭州四季青胎牛血清），混匀，不能吹打，分装2瓶，如果细胞没长满就脱落，则只需加入5mlMEM，不分装。
如果培养瓶中的细胞贴壁较牢固，培养基上清没有细胞脱落碎片，且细胞长满达到80％以上，吸走培养基，加入5ml 的PBS+EDTA(0.02%)，迅速轻微晃动，竖立培养瓶，吸走，加入1ml0.05%胰酶，37度消化不超过3min，细胞完全消化脱壁，取出加入10ml培养基轻微吸打混匀，分装2瓶。
培养基：MEM(GIBCO)+10%胎牛血清（杭州四季青）＋双抗293T细胞的培养与传代点击次数： 24 发表于：2008-08-25 20:47转载请注明来自丁香园来源：丁香园293细胞是转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。
大家注意293T细胞的一个重要特性：室温下不贴壁，但37度时可以重新贴壁。
我的293T细胞时老板从美国千里迢迢带回来的，当时正是冬天，老板把瓶子放在大衣口袋里在飞机上折腾了两天，等拿到实验室已经看不到贴壁的细胞了。
293e细胞培养方法
293e细胞培养方法
一、细胞株选择
293e细胞株是一种常用于病毒包装和基因表达研究的人肾上皮细胞株。
选择健康、活力好的293e细胞株是培养成功的关键。
二、培养基和添加剂
293e细胞适宜在含有10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和1%谷氨酰胺的DMEM培养基中生长。
根据细胞生长状况，可适当调整血清浓度和谷氨酰胺的用量。
三、传代和扩增
当细胞密度达到80%以上时，可进行传代和扩增。
传代时，将细胞悬液以1:3的比例传至新的培养瓶中。
扩增时，将细胞悬液接种到多孔板或液滴中，以实现细胞的规模化培养。
四、细胞鉴定
通过形态观察、免疫荧光染色等方法对293e细胞进行鉴定，确保细胞的纯度和特性。
五、培养条件控制
保持培养室内温度为37℃，湿度为5% CO2。
定期更换培养基，并根据细胞生长状况调整培养条件，如温度、湿度、CO2浓度等。
六、细胞冻存与复苏
为保证细胞的长期保存和快速复苏，可以采用细胞冻存技术。
将细胞悬液与冷冻保护剂混合后，迅速冷冻并保存在-80℃冰箱中。
复苏时，将细胞悬液快速融化并接种到新的培养瓶中。
七、细胞污染防控
为防止细胞污染，需严格控制培养环境，定期对培养基、添加剂和细胞进行无菌检测。
如发现污染，应立即停止培养并采取相应措施。
八、细胞凋亡检测
采用流式细胞术、荧光染色等方法对293e细胞的凋亡情况进行检测，以了解细胞的生长状况和死亡情况。
HEK293T细胞培养ppt课件
基因诊断
培养细胞 能做什么
治病机理
试管婴儿
组织工程
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细胞的培养具体方法与步骤
细胞培养细胞培养(cell culture) 的含义，简单地说即是把来 自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境 中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁 殖、衰老等生命现象。细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、 病毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用
.
细胞间的操作注意事项
每一个人操作结束后，必须及时清理操净工作台内的物品，不得在工作台面。 每一个操作结束后，必须及使用84消毒液消毒管道，并清理废液瓶，及时弃去
细胞被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改
变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被
支原体污染一般难以察觉。
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细胞污染问题与解决方案
细胞的支原体污染检测
试剂盒检测法： 目前已有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片进行检
测
间接免疫荧光法和免疫印迹：简便、快速、特异性
养基(37℃预热)，润湿底面
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HEK293细胞复苏步骤
根据冻存记录从液氮灌中取出冻存的细胞
迅速投入已经预热至37 ℃的水浴锅中，并快速晃动，在1-2 min内使完全融化 用酒精擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内，有培养基的培养瓶
轻轻混匀，置37℃、5%CO2培养箱中培养
次日换液
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细胞培养的常见问题与解决方案
真菌污染后，霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色 漂浮物。 LOGO
细胞污染问题与解决方案
细胞的真菌污染检测 镜检有丝状物
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293e细胞培养方法
293e细胞培养方法293E细胞是一种常用的哺乳动物细胞系，广泛应用于生物医学研究和重组蛋白表达等领域。
本文将介绍293E细胞的培养方法，包括细胞培养基的配制、细胞的传代和细胞的冻存。
一、细胞培养基的配制293E细胞的培养基配制相对简单，常用的培养基是DMEM （Dulbecco's Modified Eagle Medium）基础上加入适当的补充剂。
1.1 DMEM的配制将DMEM粉末加入无菌的蒸馏水中，并加热至溶解。
待完全溶解后，调节pH值至7.4，并加入适量的无菌纤维素。
1.2 培养基的补充剂将DMEM中加入10%的胎牛血清（FBS），1%的L-谷氨酰胺（L-Gln），100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素。
混匀后滤过以获得无菌的培养基。
二、细胞的传代293E细胞的传代是维持细胞生长和增殖的重要步骤。
下面将介绍293E细胞的传代方法。
2.1 细胞解离用PBS（磷酸盐缓冲液）将培养皿中的细胞洗涤一次，去除培养基。
加入适量的胰酶或胰酶-乳酸酐（Trypsin-EDTA）溶液，并在37°C的恒温培养箱中孵育5-10分钟，直至细胞从培养皿上脱落。
2.2 细胞传代将细胞解离液转移至离心管中，离心300×g，室温下离心3-5分钟。
去除上清，加入适量的培养基悬浮细胞，并用移液器进行混匀。
将细胞悬液装入新的培养皿中。
2.3 细胞的培养条件将新传代的293E细胞放入37°C的恒温培养箱中，培养基的补充和细胞的观察一般每两天进行一次。
当细胞生长至80%-90%的密度时，可以进行下一次的传代。
三、细胞的冻存3.1 冻存液的配制将培养基中的FBS浓度提高至20%，添加相同体积的DMSO（二甲基亚砜），混匀后过滤灭菌得到冻存液。
3.2 细胞冻存将培养皿中的293E细胞加入足够量的培养基，离心300×g，室温下离心3-5分钟。
去除上清，加入冻存液悬浮细胞，并用移液器进行混匀。
293细胞培养
293细胞培养1.培养基DMEM ++丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：（1）37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
3. 传代吸出旧培基，加5mlPBS洗1-2遍，用移液管加1ml胰酶，滚2遍吸出，37度放1min左右计时，看到变圆即加入新培基吹打，几下就好了，分到新瓶里。
我个人认为：293细胞贴壁后形成圆形，可能是细胞本身状态不是很好，细胞不够饱满，细胞的贴壁后的棱角不易显露出来，所以看上去类似圆形，而且细胞较小。
293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。
它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与ey 于1976年用DNA转染技术构建而成。
293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。
293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。
一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
293细胞培养
293 细胞是腺病毒载体的包装细胞。腺病毒是继逆转录病毒后用于基因治疗研究的热门 载体。直接将腺病毒载体导入人体内表达目的基因，治疗恶性肿瘤、心血管疾病或一些遗传 疾病已取得可喜进展；利用腺病毒载体在包装细胞 293 中表达分泌性蛋白质，如蛋白酪氨酸 激酶 1C 等亦成为生产重组蛋白的一条途径。因此完善 293 细胞的大规模培养技术具有越来 越重要的市场意义。哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬 浮培养。这三种方式均可用于 293 细胞的大规模培养。
微载体培养
微载体是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和 贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产蛋白质产品， 如 293 细胞、成肌细胞、Vero 细胞、CHO 细胞。常用商品化微载体有三种：Cytodex?，Cytopore 和 Cytoline。
悬浮培养时，由于缺少血清和蛋白的保护作用，293S 对剪切力的敏感度增加，难以达 到高密度培养，导致 293S 产生病毒的数量比贴壁培养低 5-10 倍左右。细胞接种后，灌流培 养 7 天，达到细胞密度 5×106/ml，增殖 5-10 倍。
结论
不管是哪种培养方式，首要的一点是必须操作规范、防止污染；其次根据需要选择合适 的 293 细胞培养方式，对细胞生长状况实行有效的监控，以便获得稳定的蛋白或病毒产物。
无血清悬浮培养
无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养 方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方 向。要实现 293 细胞无血清悬浮培养必须先将贴壁培养 293 改造为悬浮培养 293S 细胞并寻 找适合高密度无血清培养的培养液配方。
293t细胞培养说明书
293T细胞培养说明书一、实验简介293T细胞是由肾脏细胞系统转染外源基因而产生的细胞系，具有较好的培养性和转染性。
因此，293T细胞常用于基因表达研究，尤其是蛋白表达和病毒载体的构建。
二、培养条件1. 培养基：293T细胞培养最常用的培养基是Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)，其次是RPMI-1640培养基。
2. 氧气浓度：293T细胞培养一般需要一个较高的氧气浓度，如5%~10%。
3. 温度：293T细胞的培养温度一般为37℃。
4. 水分：293T细胞的培养液中的水分一般为95%~100%。
5. 添加物：293T细胞的培养液中通常会添加10%的牛血清，以促进细胞生长。
三、细胞培养步骤1. 将293T细胞从细胞库中取出，放入清洗后的培养皿中，以DMEM培养基浸泡；2. 将培养皿放入培养箱，调节温度为37℃，氧气浓度为5%~10%；3. 将添加10%牛血清放入培养液中，搅拌均匀；4. 用细胞活性检测试纸测定细胞活性；5. 根据细胞活性的变化情况，调整培养液中的水分，以维持细胞的生长；6. 将培养液更换，每1~2天更换一次；7. 定期观察细胞形态，记录细胞生长情况。
四、注意事项1. 在培养293T细胞时，需要注意细胞的温度、氧气浓度以及水分，以保证细胞的正常生长；2. 培养液的清洗和更换要及时，以保证细胞的正常生长；3. 在操作293T细胞时，一定要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。
五、总结293T细胞培养是一种常用的培养方法，在培养293T细胞时，要注意培养液的温度、氧气浓度以及水分，并及时更换培养液，以保证细胞的正常生长。
在实验操作中，还要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。
293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达
293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达一、引言在生物制药领域，细胞工程技术被广泛应用于蛋白表达和生物制药制备中。
而293ft细胞悬浮驯化技术的出现，极大地促进了蛋白表达系统的研究和应用。
本文将从悬浮驯化和蛋白表达两个方面，深入探讨293ft细胞在生物制药领域的重要性和应用前景。
二、293ft细胞悬浮驯化1. 293ft细胞293ft细胞是一种人类胚胎肾细胞，是常用的哺乳动物细胞系，在病毒研究和重组蛋白表达中有广泛的应用。
与传统的293细胞相比，293ft 细胞来源于Flp-In™ 293细胞，其核内含有的FLP重组酶能够特异性地识别FRT位点，并介导外源插入DNA的积极定位，从而提高了外源基因的稳定性和准确性。
2. 悬浮驯化技术悬浮驯化技术是指将细胞种植于搅拌培养皿或生物反应器中，通过搅拌或通气等方式使细胞悬浮在培养基中，从而实现细胞的大规模培养。
而293ft细胞的悬浮驯化技术，使其在蛋白表达和生物制药制备中具有了更广阔的应用前景。
三、蛋白表达1. 重组蛋白表达293ft细胞不仅能够高效地表达内源蛋白，还可以作为重组蛋白表达系统，用于表达外源蛋白。
由于其在短时间内能够高效表达大量蛋白的特性，使得293ft细胞在生物制药制备中备受青睐。
2. 应用前景随着生物制药研究的不断深入，对于蛋白表达系统的要求也越来越高。
而293ft细胞具有易于培养和高产量等特点，使得其在生物制药领域有着广泛的应用前景。
未来，随着细胞工程技术的不断发展，相信293ft细胞在蛋白表达系统中将会有更加广泛的应用。
四、结论通过本文的探讨，我们可以看到293ft细胞在生物制药领域的重要性和应用前景。
悬浮驯化技术和蛋白表达系统的不断完善和发展，也为293ft细胞在生物制药领域的应用打开了更加广阔的前景。
个人而言，我对293ft细胞在蛋白表达系统中的作用和意义有了更加深刻的理解，也对其在生物制药制备中的潜力充满期待。
五、个人观点作为一种重要的蛋白表达系统，293ft细胞在生物制药领域的应用前景不容小觑。
HEK293细胞培养心得
HEK293细胞培养心得HEK293细胞是一种来自人类胚胎肾细胞的细胞系，广泛应用于生物医学研究，药物筛选和疫苗生产等领域。
在培养HEK293细胞的过程中，需要注意一些关键因素，如培养基的选择、细胞传代和细胞冻存等。
在我个人的实验室研究中，我积累了一些关于HEK293细胞培养的心得体会，以下是我对HEK293细胞培养的常用操作和一些建议。
首先，关于培养基的选择。
HEK293细胞通常使用DMEM培养基，配合10%胎牛血清（FBS）和1%的抗生素/抗真菌溶液。
在选择FBS时，建议选择FBS批次稳定，比较适合细胞生长的产品，并进行细胞生长曲线的监测。
此外，培养基中的抗生素/抗真菌溶液可以有效地预防细胞培养中的细菌和真菌污染。
其次，细胞传代是保持HEK293细胞健康生长的关键环节之一、一般来说，当细胞达到80%~90%的密度时，可以进行细胞传代。
细胞传代前，应该先用1X磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，然后使用胰酶或胰酶-EDTA溶解细胞。
胰酶处理时间不宜过长，一般5-10分钟即可。
通过观察细胞的形态变化，判断细胞是否已经完全分离，然后将新的培养基添加到细胞生长板中。
注意，传代时的细胞密度不宜过高，否则容易引起细胞凋亡和细胞质重叠。
此外，为了减少细胞传代带来的细胞突变风险，建议每隔一定的时间重新从冻存的细胞中获得新的细胞，而不是一直使用原始细胞系。
另外，一个常见的问题是细胞冻存和解冻。
细胞冻存是保存和传递细胞的重要方法，在培养HEK293细胞时也是常见的操作。
为了成功地冻存和解冻HEK293细胞，我们使用含10%DMSO的冻存液将细胞冷冻在液氮中。
在解冻细胞时，我们将冻存管迅速放入37°C水浴中，轻轻摇晃管子，直到细胞完全解冻。
然后，将细胞转移至预先装有适量培养基的离心管中，并离心以去除残留的DMSO。
最后，将细胞转移至培养皿中，进行正常的培养。
此外，尽管HEK293细胞生长迅速且易于培养，但仍然需要定期检查细胞的健康状态和污染。
293t
293T细胞的培养关键词：293T细胞慢病毒包装培养 2011-10-28 18:14 来源：丁香园点击次数：5037包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7. 将细胞离心，1000rpm，2min。
8.根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+ 20% FBS + 10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
9. 分装进细胞冻存管，放入泡沫盒中，放入-80℃超低温冰箱。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
11. 复苏检测细胞存活率，细胞状态等，并记录。
二. 293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
5. 放回37℃、3%CO和95%相对湿度的培养箱中培养。
2三. 293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
和95%相对湿度的培养箱中培养。
293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达
293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达序言作为细胞生物学和生物工程领域的一项重要技术，细胞培养和蛋白表达技术在现代医药和生物科学研究中扮演着至关重要的角色。
而在这一领域，293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达技术则是备受关注的焦点之一。
本文将深入探讨293ft细胞悬浮驯化和蛋白表达的相关原理、应用以及未来发展方向，帮助读者全面理解和认识这一重要的生物技术。
一、293ft细胞悬浮驯化1. 293ft细胞的来源和特点293ft细胞是一种常用的哺乳动物细胞系，来源于人类胚胎肾细胞。
与传统的293细胞相比，293ft细胞经过改良和转染后，在悬浮状态下具有更高的表达效率和更好的生长特性。
这使得293ft细胞在蛋白表达和细胞培养领域得到广泛应用。
2. 悬浮驯化技术的原理与方法悬浮驯化是指将细胞从传统的单层培养方式转变为悬浮状态培养的过程。
对于293ft细胞，悬浮驯化技术的关键在于寻找合适的培养基和培养条件，如活性氧含量、温度和pH值等。
适当的培养器皿和搅拌方式也对悬浮培养效果有重要影响。
3. 应用前景和意义悬浮培养的293ft细胞在蛋白表达、病毒制备等方面具有广阔的应用前景。
其悬浮生长形式使得大规模生产成为可能，从而满足了生物药物和蛋白质的临床需求。
而且，悬浮培养还可以降低生产成本、提高生产效率，为生物制药和生物工程行业带来了巨大的发展机遇。
二、蛋白表达技术1. 蛋白表达的基本原理蛋白表达是指在细胞内或体外，通过特定的基因表达系统将目标蛋白大量合成的过程。
在细胞内表达中，常用的系统有原核细胞表达系统和真核细胞表达系统，而体外表达则利用细胞外的重组蛋白合成系统进行蛋白表达。
2. 293ft细胞在蛋白表达中的优势由于其良好的生长特性和高表达效率，293ft细胞在蛋白表达中具有明显的优势。
研究发现，通过适当的基因组成和培养条件调控，293ft细胞在表达重组蛋白和生产病毒颗粒方面表现出较高的稳定性和效率。
3. 蛋白表达技术在生物医药领域中的应用通过蛋白表达技术，可以大规模生产临床所需的生物药物，如重组蛋白、抗体药物等。
HEK-293细胞复苏培养及冻存汇总
HEK－293细胞复苏培养及冻存作者：杨彪作者单位：辽宁医学院附属第一医院骨科【摘要】目的通过对人胚肾293细胞的复苏培养及其冻存的研究，为进一步行干细胞标记实验奠定基础。
方法复苏培养人胚肾293细胞，倒置显微镜观察人胚肾293细胞的生长状况,计算细胞贴壁率，绘制细胞生长曲线，冻存保留细胞。
结果人胚肾293细胞在普通培养条件下生长良好，6h后大部分细胞已经贴壁，8h细胞已完全贴壁。
结论人胚肾293细胞采用改进方法复苏培养及冻存是简便可行的，为进一步行干细胞标记实验奠定了坚实的前期基础。
【关键词】人胚肾293细胞细胞培养冻存Anabiosis and Cultivation of HEK-293 Cells and CryopreservationYANG Biao1, MEI Xi-fan1, LIU Fu-qiang2(1.Department of Orthopaedics ，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University;2.Department of Endocrine，the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000 China)【Abstract】Objective To lay foundation for establishing substructure of stem cells’ labeling and transplantation therapy experimentation through the research on anabiosis and cultivation of HEK-293 cells and cryopreservation. Methods By resuscitating and cultivating HEK-293 cells, observe them with inverted microscope，calculate adherence rate，draw growth curve， cryopreservate and reserve it. Results HEK-293 cells grow well in the common cultivating conditions. Most of the cells have adherenced after 6 hours, and all cells have adherenced after 8 hours. Conclusions It is convenient and feasible to adopted improved ways to resuscitate and cultivate HEK-293 cells. In this way, we have established substantial substructure of stem cells’ labeling.【Key words】 HEK-293 cells;cell culture;cryopreservation干细胞是近年医学研究的热点之一，并显示了良好的应用前景。
HEK293T细胞培养
03
hek293t细胞培养的过程
细胞培养前的准备
细胞培养环境的准备
确保细胞培养实验室的清洁和消毒，准备好所需的培养基、细胞 培养瓶、酶等试剂。
细胞复苏和传代
从液氮或-80℃冰箱中取出细胞，进行复苏和传代，以获得足够的 细胞数量。
05
hek293t细胞培养的挑战与解决方案
细胞培养中的污染问题
污染来源
细胞培养中的污染可能来自培养环境、培养基、细胞本身和操作 过程等。
污染类型
常见的污染类型包括细菌、霉菌、支原体和病毒等。
解决方案
定期检查培养环境、培养基和细胞，使用一次性耗材，严格遵守 无菌操作规程，定期进行支原体检测等。
细胞培养中的生长问题
细胞培养过程中的注意事项
防止污染
维持适宜的pH值
严格控制细胞培养环境，定期对培养基和 细胞进行无菌检测，以防止细菌、霉菌等 污染。
监测培养基的pH值，并适时调整，以确保 细胞的正常生长。
避免细胞交叉污染
注意安全操作
在操作过程中，确保不同种类的细胞分开 存放，避免交叉污染。
操作过程中要穿戴实验室防护服、手套等 防护措施，避免直接接触细胞和培养基， 以防止潜在的生物危害。
选、基因治疗和疫苗研发等。
02
hek293t细胞培养的原理
细胞培养的基本原理
细胞是生命的基本单位，具有自我复 制和分化的能力。在适宜的环境下， 细胞可以生长、繁殖并维持其生物学 特性。
细胞培养技术广泛应用于生物学、医 学、药学等领域，是研究细胞生理、 病理和药理等方面的重要手段。
293细胞培养
293细胞培养293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。
它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与ey 于1976年用DNA转染技术构建而成。
293细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。
293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。
一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、293细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长, 换液时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞变圆,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
12小时-24小时90%以上细胞贴壁。
293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比例为1：3。
3、293细胞在低代时容易贴壁，生长良好，在传到几十代以后，易聚集成团，且贴壁不牢，用PBS冲洗时即可能脱落，即使消化后也不容易吹打成单细胞悬液，最好购入时先大量冻存。
293f细胞培养说明书
293f细胞培养说明书一、引言293f细胞是一种广泛应用于生物学研究的细胞系。
它是293细胞的改良版本，具有更高的细胞密度和更好的生长性能。
本说明书旨在介绍293f细胞的培养方法及注意事项，帮助研究人员正确并高效地进行293f细胞的培养。
二、培养基与培养条件1. 培养基选择293f细胞适用于常规细胞培养基，如DMEM、RPMI-1640等。
添加10%胎牛血清（FBS）或者5%去胎牛血清（FCS）可提供细胞所需的营养物质和生长因子。
2. 培养条件293f细胞的生长温度为37℃，CO2浓度为5%。
维持适当的温度和CO2浓度有助于细胞的正常生长和增殖。
三、293f细胞的传代与分裂比1. 传代方法当细胞密度达到80%～90%时，可进行细胞传代。
将细胞培养液抽取至离心管中，进行离心，去除上清，用PBS洗涤细胞，加入适量的消化液（如胰蛋白酶/EDTA溶液），在37℃下消化一段时间。
观察细胞的解聚情况，停止消化，并用培养基中和消化液。
离心沉淀，去除上清，用PBS洗涤细胞，将细胞悬浮于新鲜的培养基中，按比例重新分装。
2. 分裂比293f细胞的分裂比一般为1:5至1:10，取决于细胞的生长状态和实验需求。
合理的分裂比有助于维持细胞的正常生长和稳定的细胞株。
四、细胞的凝聚与冻存1. 细胞凝聚293f细胞在培养过程中可能会出现凝聚现象，这可能是由于细胞浓度过高或细胞培养条件不合适所致。
可通过调节培养基的成分或细胞密度，以及增加培养器具的表面涂层等方式来减少细胞的凝聚。
2. 细胞冻存为了长期保存293f细胞，可以进行细胞的冻存。
首先，将细胞培养至80%～90%的密度，用PBS洗涤细胞，加入适量的冻存液（如10% DMSO和90% FBS混合液），将细胞悬浮于冻存液中，分装至冻存管中，迅速放入液氮中保存。
五、细胞培养中的注意事项1. 无菌操作在细胞培养过程中，保持无菌操作是非常重要的。
使用无菌器具、培养基和试剂，并在洁净的操作台上进行操作，以防止细胞受到污染。
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293细胞的大规模培养293细胞是腺病毒载体的包装细胞。
腺病毒是继逆转录病毒后用于基因治疗研究的热门载体。
直接将腺病毒载体导入人体内表达目的基因，治疗恶性肿瘤、心血管疾病或一些遗传疾病已取得可喜进展；利用腺病毒载体在包装细胞293中表达分泌性蛋白质，如蛋白酪氨酸激酶1C等亦成为生产重组蛋白的一条途径。
因此完善293细胞的大规模培养技术具有越来越重要的市场意义。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。
293细胞特性293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾细胞。
它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与ey于1976年用DNA转染技术构建而成。
293细胞是贴壁依赖型成上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
293细胞为人亚三倍体细胞系。
293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
转瓶培养转瓶培养一般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段，或作为生物反应器接种细胞准备的一条途径。
与传统静止单层培养相比，转瓶具有三大优点：为细胞提供较大的生长表面；轻微的转动可以防止培养液中形成的某些成分对细胞生长可能产生的影响；细胞大部分时间仅覆盖一薄层培养液，有利于气体交换。
我们已成功实现293细胞的转瓶培养。
由于293细胞对生长环境的改变较为敏感，细胞容易成团，因此维持稳定的温度、酸碱度和转动速度对细胞正常均匀生长至关重要。
现在使用的转瓶培养系统包括二氧化碳培养箱和转瓶机两部分。
293细胞接种后，维持适当的转速培养。
不同的细胞转速略有不同。
细胞的均匀分散贴壁情况与培养液温度、瓶子的转动速度和细胞特性有关。
在5-6天的培养周期中，细胞量可增殖20倍。
反应器贴壁培养此种培养方式中，细胞贴附于固定的表面生长，不因为搅拌而跟随培养液一起流动，因此比较容易更换培养液，不需要特殊的分离细胞和培养液的设备，可以采用灌流培养获得高细胞密度，能有效地获得一种产品；但扩大规模较难，不能直接监控细胞的生长情况，故多用于制备用量较小、价值高的生物药品。
CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器是常用的贴壁培养式生物反应器，用于细胞的贴壁培养时可使用篮式搅拌系统和圆盘状载体。
此载体是直径6毫米的无纺聚酯纤维圆片，具有很高的表面积与体积比（1200cm2/g），有利于获得高细胞密度。
篮式搅拌系统和载体培养是目前贴壁细胞培养使用最多的方式，除用于293细胞的培养外，还用于杂交瘤细胞培养、Hela细胞培养、CHO细胞培养及其它细胞培养。
此种方式培养293细胞，细胞接种后贴壁快，接种1小时后细胞贴壁率可达98%以上，采用灌流培养。
整个培养周期约7-10天，细胞增殖25-50倍。
微载体培养微载体是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。
目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产蛋白质产品，如293细胞、成肌细胞、Vero细胞、CHO细胞。
常用商品化微载体有三种：Cytodex?，Cytopore和Cytoline。
使用较多的反应器有两种：贝朗公司的BIOSTAT?B反应器，使用双桨叶无气泡通气搅拌系统；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift 双筛网搅拌系统。
两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。
微载体培养293细胞，首先要选择合适的微载体类型和搅拌速度。
接种细胞可用1L spinner微载体培养系统或是其它贴壁培养方式准备，采用灌流培养，培养周期10-15天，能达到的细胞密度为5-10×106/ml。
无血清悬浮培养无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方向。
要实现293细胞无血清悬浮培养必须先将贴壁培养293改造为悬浮培养293S细胞并寻找适合高密度无血清培养的培养液配方。
悬浮培养时，由于缺少血清和蛋白的保护作用，293S对剪切力的敏感度增加，难以达到高密度培养，导致293S产生病毒的数量比贴壁培养低5-10倍左右。
细胞接种后，灌流培养7天，达到细胞密度5×106/ml，增殖5-10倍。
结论不管是哪种培养方式，首要的一点是必须操作规范、防止污染；其次根据需要选择合适的293细胞培养方式，对细胞生长状况实行有效的监控，以便获得稳定的蛋白或病毒产物。
人胚肾细胞株293细胞(由中科院上海生化研究所许德华教授惠赠)在含10%胎牛血清，100 u/ml青霉素和100 u/ml链霉素的DMEM培养液(GIBCO/BRL公司产品)，37℃,5%CO2的环境中生长。
第四节细胞培养与细胞杂交一、细胞培养高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内（in vivo）的功能活动是十分困难的。
但是如果把活细胞拿到体外（in vitro）培养进行观察和研究，则要方便得多。
活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动，特别是高等动植物细胞要求的生存条件极其严格，稍有不适就要死亡。
所以细胞培养技术（cell culture）就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。
动物细胞的生存环境与植物细胞差别很大，因而二者的培养方法很不相同。
（一）、动物细胞培养细胞培养方式大致可分为两种：一种是群体培养（mass culture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层；另一种是克隆培养（clonal culture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中；各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。
一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。
此外，为了制取细胞产品而设计了转鼓培养法，使用大容量的圆培养瓶，在培养过程中不断地转动，使培养的细胞始终处于悬浮状态之中而不贴壁。
目前实验室中常用的几种细胞系3T3 成纤维细胞小鼠HeLa 宫颈癌上皮细胞人BHK21 成纤维细胞叙利亚仓鼠PtKl 上皮细胞袋鼠L6 成肌细胞大鼠PCI2 嗜铬细胞大鼠SP2 浆细胞小鼠SP2／0 骨髓瘤浆细胞小鼠CHO 卵巢细胞中国地鼠正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。
所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。
目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。
此细胞系一直延用至今。
1．原代培养（primary culture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群，。
原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要从更换培养基。
将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。
2．细胞株（cell strain）：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，能够繁殖50代左右，在培养过程中其特征始终保持。
3．细胞系（cell line）：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，在培养条件下可无限繁殖4．克隆（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。
对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。
图2-24 群体培养（左）和克隆培养（右）二、细胞融合真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交（cell hybridization）。
基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。
同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。
诱导细胞融合的方法有三种：生物方法（病毒）、化学方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（电激和激光）。
某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，也可介导细胞与细胞的融合。
因此可以用紫外线灭活的此类病毒诱导细胞融合。
化学和物理方法可造成膜脂分子排列的改变，去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便可诱导相接触的细胞发生融合。
细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。
单克隆抗体技术是细胞杂交技术的成功应用，正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。
于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。
图2-25 单克隆抗体技术第五章细胞培养和细胞工程细胞培养是细胞生物学研究必不可少的实验手段，近年来细胞培养又成为生物技术领域中常用的生产手段。
细胞培养和其他技术方法，如：细胞的显微操作（在显微镜下移去或移入细胞核等），细胞融合，染色体操作等结合在一起，组成了细胞水平的生物技术操作群，是生物技术领域的研究和开发应用中必不可少的部分。
把细胞水平生物技术用于生产称为细胞工程。
细胞培养实验的基本条件是：细胞来源，培养基（各种营养成份，小牛/胎牛血清），培养器械（培养瓶或罐，恒温箱／室等）。
细胞来源：直接从活体组织中分离出细胞，在培养条件下传１至１０代，称为原代培养。
原代培养一般不能传代太多，否则培养细胞会走向衰老死亡。
经过一定处理，细胞适应在体外条件下连续传代培养，称为传代培养。
一般可传４０至５０代的细胞，称细胞株。
有的细胞株转化后可传５０代以上，甚至一直传下去，称为细胞系。
细胞培养技术：除了常规的细胞培养技术外，还发展了多种特殊培养技术，以适应研究和生产的特殊需要。
无血清培养----通常哺乳动物细胞的培养，除了需有各种必要的营养成份外，还需加入 10% 小牛／胎牛血清。
血清提供多种蛋白质生长因子。
在初步弄清血清中生长因子成份后，发展出多种无血清培养技术，即培养基中不加血清，而代之以各种生长因子，以适应特殊研究的需要。
同步培养----一般来说，在培养的细胞群体内，各个细胞处于生长周期的不同阶段。
运用特殊的技术方法，可使各个细胞处于生长周期中相同位置，同步向前发展。