293T细胞培养标准操作规程
293T细胞培养攻略
293T细胞培养攻略1.培养基准备293T细胞通常使用DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）作为培养基，配以10%胎牛血清（FBS），1%青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）。
在培养293T细胞之前，首先将适量的DMEM加热至37°C，并将相应数量的胎牛血清和抗生素加入其中。
2.细胞传代传代细胞是保持293T细胞健康生长和细胞性能的重要步骤。
当细胞达到80-90%的密度时，可以开始细胞传代。
首先，用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养瓶中的培养基洗涤一次，然后用0.25%胰酶/EDTA（乙二胺四乙酸）溶液将细胞溶解5-10分钟。
溶解后，加入与胰酶/EDTA液体相等的培养基，轻轻悬浮细胞，并将其移至新的培养瓶中。
将新的培养基加入新瓶中，以使其达到适当的细胞密度。
3.293T细胞的培养条件4.细胞转染293T细胞被广泛用于转染实验。
细胞转染是将外源DNA转运到293T 细胞中的方法，以研究基因功能或进行蛋白表达。
293T细胞的易于转染性质使其适合于多种转染实验，包括常规的钙磷法和化学法（如聚乙烯亚胺）以及电穿孔法。
在进行转染实验之前，应将细胞培养至80-90%的密度，并在转染之后对其进行恢复。
5.结束实验时的保存和冻存细胞在完成实验后，如果有需要保存细胞的需求，可以将293T细胞冻存。
为此，收集细胞，并用DPBS（无菌磷酸盐缓冲液）洗涤细胞。
然后，用0.25%胰酶/EDTA液解细胞5分钟，并加入相等体积的培养基以停止胰酶的作用。
将细胞离心，并以适当的速度冻存保护液（如10%DMSO和90%FBS）重新悬浮细胞。
将细胞悬浮液分装至冻存管中，并使用液氮保存。
总结：293T细胞是一种常用的细胞系，在生物医学研究中发挥着重要作用。
通过遵循上述培养攻略，可以获得高质量和可靠的293T细胞培养结果。
有针对性的细胞传代、定期更换培养基、温度和CO2的适当控制以及正确的细胞转染和细胞冻存步骤可以确保细胞的生长和稳定性，为细胞实验提供最佳条件。
293T细胞的培养[1]
![293T细胞的培养[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/d6a8872378563c1ec5da50e2524de518964bd36d.png)
293T细胞的培养[1]293T细胞的培养293T细胞是由293细胞派生, 表达SV40大T抗原的人肾上皮细胞系, 被广泛应用于瞬时转染以过表达各种目标蛋白, 或是用以包装病毒。
293T为贴壁细胞, 这种细胞对培养基的营养成分要求并不高。
培养条件为: 完全培养基: 高糖DMEM, 10%胎牛血清; 冻存液: 胎牛血清或完全培养基, 10% DMSO。
传代方法为:1．吸掉293T细胞培养瓶内的培养液;2．吸取适量的无Ca 2+和Mg 2+的PBS, 轻轻把贴壁的细胞洗两遍;3．加少量的0.05%胰蛋白酶-EDTA (一般25 cm2的培养瓶加1 ml, 75 cm 2的培养瓶加2~3 ml), 放到培养箱温育20 s;4．细胞消化完毕, 加适量培养液终止消化, 并吹打细胞, 制成均匀的细胞悬液;5．加足量的培养液, 分装到新的培养瓶中。
值得注意的是, 293T细胞的贴壁性不强, 轻微的干扰就可能使它们脱落。
所以, 在更换新鲜培养液或者用PBS冲洗的时候应该小心地添加新的培液进去, 以液体不冲打到贴壁的细胞为好。
传代的时候, 只需要用0.05%胰蛋白酶-EDTA即可轻松把细胞消化下来, 不需要消化很长时间。
有些同学反映293T细胞容易结团不易被吹打开来。
如果遇到这样的情况可以在加了胰蛋白酶温育一段时间后即拿1 ml移液枪反复轻轻吹打, 直至肉眼看不到大的细胞块为止, 然后加适量的培养液混匀, 这时候在显微镜下观察, 可见大多数细胞都是单个的, 只有少量的2~3个细胞聚在一起。
一般293T细胞可以长在塑料的培养瓶底面上直到90%融合, 再以1∶4~1∶8的比率传代。
合适的传代周期为2~3天。
传代过程中,消化的时间越短越好, 显微镜下观察到80%细胞脱落即可加培养液中止。
完成传代后放入培养箱前,应该把培养瓶或培养皿沿X、Y轴方向水平移动几下, 防止细胞都聚在中间或者四周。
冷冻293T细胞的冻存液可以用95%小牛血清加5%二甲基亚砜, 复苏率很高。
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
利用293T细胞扩增腺病毒操作步骤
利用293T细胞扩增腺病毒CCL22操作步骤（1）在100mm培养皿或75cm2培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106 293T细胞。
（2）取0.5ul首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释应得到的MOI值约为5。
（3）移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3次，37℃ CO2孵箱中培养90分钟。
（4）加入9ml DMEM5%。
（5）再培养72小时，这时在10ml溶液中大约有5×109~5×1010个病毒颗粒，进行MOI测定以估计病毒颗粒。
注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。
收集细胞，600×g离心5分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积（一般为原始体积的1/10即1ml）病毒保存溶液重悬细胞。
-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。
（6）-20℃/37℃冻融3次。
（7）转入15ml无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10分钟，收集上清冻存于-20℃或-80℃。
（8）3个175cm2培养瓶中各加入107 293T细胞进行培养。
（9）将3ml细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混匀。
移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混匀3次，37℃CO2孵箱中培养90分钟。
此时MOI值约为25。
（10）加入DMEM5%至30ml。
（11）再培养48~72小时。
此时10ml培养液病毒量约为3×1010~3×1011。
若需要，进行MOI测定以估计病毒滴度。
注：此时如果病毒量已足够，则可立即进入病毒滴定步骤。
600×g离心5分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。
-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。
（12）移入50ml离心管中，台式离心机上最大速率离心10分钟，取出上清保存。
细胞培养(hela, 293,239T等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
293T 细胞培养
精心整理293T细胞培养1.培养基:DMEM=丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
也不易打散。
悬浮的293T细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长,换液293T时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
12小时-24小时90%以上细胞贴壁。
293细胞传代时机为达80-90%汇合，传代比其它的经验：1、用大瓶培养较小瓶要好，可能是更有利于293均匀的分布，利于营养的摄取2、培养液要新鲜，每次只配1000ml，分为2-4瓶，不用的培养液，冻存在-20度，3、要及时传代，最好是细胞基本铺满培养瓶底部，但是细胞之间还没有完全贴紧，总是多少有空隙的时候最好。
4、如果细胞贴壁不好，可能是消化过久，或是培养瓶不够干净，当然要除外细胞污染。
细胞的复苏：快速取出冻存的低代次293细胞，将其安放在底端1／2浸于37℃水浴中，轻轻晃动以加速融解。
在超净工作台中，以70％乙醇对细胞培养皿表面消毒，将细胞转移至75cm的细胞培养瓶中，加入10mL低代次293细胞培养基置于细胞培养箱内培养。
6～8h后待细胞贴壁更换培养基。
(1)利用低代次293细胞贴壁的特性，在复苏和传代时不离心，而是加入10mL培养基中和细胞消化液，培养6～8h，细胞贴壁后更换新鲜培养基，从而避免了离心剪切力对细胞造成的机械损伤；(2)在消化细胞时，振荡培养瓶，避免直接反复剧烈吹打细胞。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。
倒掉旧的培养基，加入10ml新鲜培养基。
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定1. 所用病毒检测引物为WPRE特异引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems，cat. no. 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems，cat. no. 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystems，cat. no. 4316844)用于包装的293T细胞的培养用于包装的293T细胞(ATCC No. CRL-11268)必需选择处于生长旺盛期，细胞状态较佳，存活率90%以上，细胞边缘清晰，传代次数较低。
293T细胞培养准则操作规程
293T细胞培养准则操作规程
百利药业⽣物药研发部
标准操作规程
题⽬：293T细胞传代培养操作规程
编号：SOP-M-e-003-
制定者：（签名）⽇期：年⽉⽇
批准者：（签名）⽇期：年⽉⽇
按照⽣物安全柜的标准操作规程，将⽣物安全柜的紫外开启半⼩时。
3.2将含10%胎⽜⾎清和100U/ml双抗的DMEM及PBS放于37℃⽔浴锅中预热。
3.2.1将已长到80%-90%的293T细胞培养瓶从37℃，5%的CO
培养箱中取出，先⽤75%的酒
2
精喷洒于瓶表⾯，将细胞培养瓶旋转放于⽣物安全柜中，⽤⽆菌的移液管吸净其中的培养基，加5ml的预热的PBS洗涤⼀次，吸净PBS。
3.2.2将含EDTA-0.25%tyption⽤PBS稀释两陪到五倍，向该75cm2的细胞瓶中加⼊3ml稀释好的EDTA-0.25%tyption，让其充分平铺于细胞表⾯。
盖好瓶盖，将细胞瓶放在显微镜下观察，直到细胞变圆，加含10%胎⽜⾎清的DMEM终⽌反应，⽤移液管轻轻将瓶上的细胞吹下，
将细胞液移到15ml⽆菌的离⼼管中，1000rpm离⼼3分钟。
3.2.3将离⼼上清吸弃掉，⽤⼿指轻轻拍打离⼼管底将底部细胞分散开，再加3mlDMEM培养基将分散的细胞重悬稀释开，取⼀定量的细胞液进⾏n倍稀释后计数，按照细胞计数标准操作规程进⾏。
3.2.4计数好之后细胞传代密度按照2~5×104个细胞/cm2进⾏传代培养，每个75cm2的培养瓶中加10mlDMEM培养基，放于37℃，5%的CO
培养箱中培养。
2
3.2.5 24⼩时后观察细胞状态，待细胞长到80%-90%时进⾏下⼀次传代培养。
293t细胞培养说明书
293T细胞培养说明书一、实验简介293T细胞是由肾脏细胞系统转染外源基因而产生的细胞系，具有较好的培养性和转染性。
因此，293T细胞常用于基因表达研究，尤其是蛋白表达和病毒载体的构建。
二、培养条件1. 培养基：293T细胞培养最常用的培养基是Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)，其次是RPMI-1640培养基。
2. 氧气浓度：293T细胞培养一般需要一个较高的氧气浓度，如5%~10%。
3. 温度：293T细胞的培养温度一般为37℃。
4. 水分：293T细胞的培养液中的水分一般为95%~100%。
5. 添加物：293T细胞的培养液中通常会添加10%的牛血清，以促进细胞生长。
三、细胞培养步骤1. 将293T细胞从细胞库中取出，放入清洗后的培养皿中，以DMEM培养基浸泡；2. 将培养皿放入培养箱，调节温度为37℃，氧气浓度为5%~10%；3. 将添加10%牛血清放入培养液中，搅拌均匀；4. 用细胞活性检测试纸测定细胞活性；5. 根据细胞活性的变化情况，调整培养液中的水分，以维持细胞的生长；6. 将培养液更换，每1~2天更换一次；7. 定期观察细胞形态，记录细胞生长情况。
四、注意事项1. 在培养293T细胞时，需要注意细胞的温度、氧气浓度以及水分，以保证细胞的正常生长；2. 培养液的清洗和更换要及时，以保证细胞的正常生长；3. 在操作293T细胞时，一定要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。
五、总结293T细胞培养是一种常用的培养方法，在培养293T细胞时，要注意培养液的温度、氧气浓度以及水分，并及时更换培养液，以保证细胞的正常生长。
在实验操作中，还要注意实验室的清洁卫生，以防止细胞的污染。
293T 细胞培养
293T 细胞培养1.培养基: DMEM =丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37 度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml 离心管，加5ml 培养基，500g 离心5min，弃上清，加1ml 培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml 左右，记得晃匀。
3. 传代:吸出旧培基，加5mlPBS 洗一遍，用移液管加1ml 胰酶，洗一遍吸出，37 度放1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml 新培育基的新瓶里。
293T 细胞是用5 型腺病毒75 株系转化，含有Ad5 E1 区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1 区缺陷互补细胞系。
293T 细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5 和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293T 细胞的大规模培养。
293T 细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM 中能生长很好。
一般来讲，1:10 传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293T 细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T 细胞在传代120 次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293 细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH 值在6.9～7.1 时,可顺利贴壁生长, 换液293T 时动作要轻。
一般用高糖的DMEM 培养基。
2、传代：倒去废液，PBS 洗一次（轻），用0.02%EDTA 与0.25%Trypsin 消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin 作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM 终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
细胞培养(hela,293,239t等细胞的培养)
Hela细胞传代培养操作步骤1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。
观察时拧紧盖子。
2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。
3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。
不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。
取小离心管一个，置于架子上。
4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。
放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。
5．取待传代的细胞。
打开versene，用酒精灯外焰烧。
烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。
把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。
6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。
（加versene主要是为了将旧培养基洗去）。
在离心管中间部分将液体加入。
吸液体和加液体时都不要对着细胞。
7．打开胰酶，然后将versene弃掉。
换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。
加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。
8．将细胞放入37度孵箱。
放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。
使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。
别忘了用旧培养基中和。
9．取细胞，镜下观察消化情况。
消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。
用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。
然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。
10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。
11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。
换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。
12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。
不要把枪伸到离心管内。
13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。
利用293T细胞扩增腺病毒操作步骤
利用293T细胞扩增腺病毒CCL22操作步骤（1）在100mm培养皿或75cm2培养瓶中加入10ml DMEM5%培养5×106 293T细胞。
（2）取0.5ul首次扩增的病毒保存液，加入DMEM5%至1ml，混匀，这样稀释应得到的MOI值约为5。
（3）移去培养液，小心加入病毒混合液，切勿破坏细胞单层，十字形慢慢晃动3次，37℃ CO2孵箱中培养90分钟。
（4）加入9ml DMEM5%。
（5）再培养72小时，这时在10ml溶液中大约有5×109~5×1010个病毒颗粒，进行MOI测定以估计病毒颗粒。
注：如果此时得到的病毒量已足够，可立即进行病毒滴度测定。
收集细胞，600×g离心5分钟沉淀细胞，去上清后加入最小体积（一般为原始体积的1/10即1ml）病毒保存溶液重悬细胞。
-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率离心去除细胞碎片，收集上清，然后进行病毒滴定。
（6）-20℃/37℃冻融3次。
（7）转入15ml无菌离心管中，台式离心机上以最大速率离心10分钟，收集上清冻存于-20℃或-80℃。
（8）3个175cm2培养瓶中各加入107 293T细胞进行培养。
（9）将3ml细胞裂解液上清加入12ml DMEM5%中，混匀。
移去细胞培养液，每瓶小心加入5ml混合液，十字形慢慢晃动混匀3次，37℃CO2孵箱中培养90分钟。
此时MOI值约为25。
（10）加入DMEM5%至30ml。
（11）再培养48~72小时。
此时10ml培养液病毒量约为3×1010~3×1011。
若需要，进行MOI测定以估计病毒滴度。
注：此时如果病毒量已足够，则可立即进入病毒滴定步骤。
600×g离心5分钟收集细胞，弃上清，加入1/10原始体积的溶液重悬细胞。
-20℃/37℃冻融3次，台式离心机上以最大速率沉淀细胞碎片，收集上清，进行病毒滴定。
（12）移入50ml离心管中，台式离心机上最大速率离心10分钟，取出上清保存。
293T 细胞说明书
人胚肾细胞293T说明书中国科学院干细胞库编号：SCSP-502细胞名称：293T细胞描述：人胚肾细胞（293细胞株插入SV40 T-抗原基因后产生的高转染效率的衍生株称为293T）。
该细胞最初的名字是293tsA1609neo，携带SV40复制序列，被广泛用于逆转录病毒生产、基因表达和蛋白表达。
物种：人细胞来源：2015年新引进ATCC numbe r：CRL-3216™生物安全等级：BSL-2完全培养液配方：见下方备注批次/冻存日期：详见冻存管/培养瓶标识参考传代周期：3-4天参考传代比例：1:3-1:4参考换液频率：2-3天冻存液配方：培养液95%，DMSO 5%细胞状态：上皮样，贴壁生长。
细胞贴壁能力较弱。
支原体检测结果：阴性STR鉴定结果：D5S818: 8,9；D13S317: 12；D7S820: 11；D16S539: 9,13；vWA: 16,19,20；THO1: 7,9.3；Amelogenin: X；TPOX: 11；CSF1PO: 11,12293T细胞照片备注：1. 人胚肾细胞293T完全培养液配方（100 ml）：DMEM (Invitrogen, 12430054) 87 mlFBS (Gibco) 10 ml Glutamax (Invitrogen, 35050061) 1 mlNon-essential Amino Acids, 100⨯ (Invitrogen, 11140050) 1 ml Sodium Pyruvate 100 mM Solution（invitrogen 11360070） 1 ml2. 我库冻存时，每支冻存管约含1⨯106细胞量，体积为500 μl，预期存活率70%，建议复苏至1个T25培养瓶中。
3. 注意事项：该细胞贴壁能力较弱，培养时可酌情使用预铺明胶的培养瓶/培养皿。
详情访问中科院干细胞库/干细胞技术平台/index.asp；电话：************感谢您选择我们的服务！中国科学院干细胞库/干细胞技术平台。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
293Tcellculture将所用培养基,血清,胰酶转移至室温,放置30min
293T cell culture1.将所用培养基，血清，胰酶转移至室温，放置30min，紫外灭菌需用物品。
2.细胞汇合度80%-90%，进行传代（高倍镜下观察细胞与细胞之间的空隙）。
3.用5 ml 或10 ml的移液管吸出培养液，沿培养皿壁轻轻加入2-3 ml DMEM，“十”字形上下左右轻轻摇晃2次，洗去残留的血清，弃尽液体。
4.沿培养皿壁轻轻加入2-3 ml 0.25%的胰酶，让液体自左至右缓缓铺平。
转移培养皿至显微镜下，在高倍镜下观察细胞。
5.当细胞触角全部收回（约2 min）后，将培养皿放回超净台内，加入4-6 ml 完全培养基（DMEM + 10% FBS）终止反应。
环形吹下皿底的细胞，转移至15 ml 的离心管中，20 ℃，800 rpm离心5 min。
6.弃去上清，加入4 ml新鲜完全培养基（DMEM + 10% FBS），吹打混匀，转移细胞悬液至4个新培养皿中，每皿1 ml（1：4分），补加9 ml 新鲜完全培养基（DMEM + 10% FBS）。
7.在超净台内“十”字形上下左右混匀8-10 次，转移至培养箱内，“十”字形上下左右混匀5 次，细胞培养皿放在停下的地方，不再转移。
8.37 ℃，5% CO2，培养。
TRANSFECTION WITH FUGENE 61.转染前24h传代293T cells，共2皿，当细胞50%~80%融合时，开始转染。
2.配制DMEM+10%FBS 100ml，置于37℃预热。
3.配制质粒-OptiMEM（10cm/皿）：plasmids Weight of plasmids Volume of optiMEM6 (pMD2.G) 1.1μgpsPAX2 1.1μg11μl Target gene vector/ctrl vector 1.65μg4.配制Fugene-6-OptiMEM混合液（10cm/ 皿）：Fugene-6 OptiMEM19.8μl220μl注：Fugene-6和Opti-MEM混合后，静置5min；DNA-Opti-MEM和Fugene-6-Opti-MEM混合混合后，静置15min。
293T 细胞培养
293T细胞培养1.培养基:DMEM=丙酮酸钠++10%血清++青链霉素2.复苏：37度融化后，擦干冻存管酒精擦，细胞加入15ml离心管，加5ml培养基，500g 离心5min，弃上清，加1ml培养基重悬后加入到培养瓶中，5~6ml左右，记得晃匀。
3.传代:吸出旧培基，加5mlPBS洗一遍，用移液管加1ml胰酶，洗一遍吸出，37度放1min 左右计时，看到大片大片脱落了即加入新培基吹打，吹洗充分后，吸1ml加到事先加好10ml新培育基的新瓶里。
293T细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5E1区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1区缺陷互补细胞系。
293T细胞是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。
哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养。
这三种方式均可用于293T细胞的大规模培养。
293T细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
单层培养细胞在5-10％FBS-DMEM中能生长很好。
一般来讲，1:10传代后，一周可以长满。
严禁过度生长，这点很重要。
因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成和转染，传代时也不易打散。
悬浮的293T细胞很容易大规模培养，但不容易长期保持稳定。
293T细胞在传代120次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层的了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引入新传代的细胞。
293细胞培养特性：1、细胞明显适应酸性环境,pH值在6.9～7.1时,可顺利贴壁生长,换液293T时动作要轻。
一般用高糖的DMEM培养基。
2、传代：倒去废液，PBS洗一次（轻），用0.02%EDTA与0.25%Trypsin消化，生长良好细胞，培养瓶中轻摇,使之流遍所有细胞表面,即将其吸除或弃去消化30s，然后吸去，再让剩下的EDTA/Trypsin作用30s,镜下观察细胞脱落,就可加DMEM终止消化，反复吹打至细胞全成单个悬浮细胞即可。
293t细胞滴度和纯度测定方法
293t细胞滴度和纯度测定方法293T细胞是一种广泛应用于生物学研究的人类胚胎肾细胞系，通常用于表达外源蛋白，研究细胞信号转导、基因调控、病毒感染等领域。
在实验中，准确测定293T细胞的细胞滴度和纯度是非常重要的，因为这直接关系到实验结果的准确性和可重复性。
本文将介绍293T细胞的滴度和纯度测定方法，希望能对从事相关研究的科研工作者有所帮助。
一、293T细胞的细胞滴度测定方法1.1传统显微镜计数法传统的细胞滴度测定方法是使用显微镜和计数板进行细胞计数。
具体步骤如下：步骤一：取出培养好的293T细胞液体培养物，用1ml吸头吸取适量的细胞悬液。
步骤二：将适量的细胞悬液加入到计数板的计数室中，用显微镜在计数室内进行细胞计数。
步骤三：根据计数室内的细胞数量和计数室的体积，计算出细胞的浓度。
优点：传统显微镜计数法简单易行，对设备要求不高。
缺点：由于人为误差和计数室的体积测量误差，可能导致测定结果的不精确性。
1.2体积浓度计算法体积浓度计算法是通过测定一定体积内细胞数目来计算细胞的浓度。
具体步骤如下：步骤一：取出适量的细胞悬液，将其转移至离心管中，用离心机进行离心，将上清液倒掉，留下细胞沉淀。
步骤二：用PBS溶解细胞沉淀，使得细胞变成均匀悬液。
步骤三：取出一定体积的细胞悬液，用显微镜计数确定细胞数量，根据所用体积和细胞数量计算出细胞的浓度。
优点：能够减少计数室体积测量误差，提高测定精度。
缺点：需要进行细胞的离心和洗涤等操作，操作相对繁琐。
二、293T细胞的纯度测定方法2.1细胞表型鉴定法细胞表型鉴定法是通过观察细胞的形态特征、生长特性等来评估细胞的纯度。
具体步骤如下：步骤一：观察细胞的形态特征，包括细胞形状、大小、颜色等，正常293T细胞应该呈现规则的长梭形。
步骤二：观察细胞的生长特性，包括细胞的生长速度、聚集性等，正常细胞应该有较快的生长速度。
步骤三：确定细胞的纯度，如果细胞呈现异常形态或者生长速度缓慢，则可能存在杂质细胞。
293T细胞
培养：90％的DMEM＋10％的胎牛血清培养37度培养箱（注：细胞贴壁很疏松，换液时要注意，否则很容易将细胞弄下来）
传代：当细胞在细胞培养瓶内长满达到80%时就要传代，一传几，根据细胞的团块大小及自己想接种的密度而定。
一般24小时后再传代。
48小时传就不好了，如果在24小时后细胞没有长到80%，应该换新的培养基，不然，培养基颜色发生变化，细胞贴壁就不好了。
消化：293细胞比较脆弱，所以避免用胰酶/EDTA类消化
有人用CS消化液：5 g KCl 2.2 g Na Citrate准确称量后，定容500ml dH2O，高压蒸汽灭菌，4度保存。
使用方法：将293细胞培养基倒掉后，加1-2ml CS液洗一遍细胞，留约1ml CS消化液覆盖细胞，37度或室温，根据不同实验室293细胞的状态，可自己调整消化时间，使用该CS消化液的优点之一就是，消化操作简便，因为可消化后直接接种到新鲜的培养瓶中，而不用洗掉CS消化液。
Qualityard 293T 人胚肾细胞说明书及注意事项
293T人胚肾细胞说明书及注意事项1.简介：SV40 T-抗原的温度敏感基因后产生的高转染效率的衍生株，表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。
在本库通过支原体检测。
在本库通过STR检测。
所有肿瘤细胞和病毒转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，操作者需注意自身防护。
基本培养条件:培养基：90％DMEM+10％胎牛血清温度：37℃气相：95％空气，5%二氧化碳2.细胞运输：本细胞为贴壁细胞，常规运输方式是将细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满新鲜的完全培养液并封好瓶口进行运输。
根据气温的高低及运输距离的远近，我们可能采取以下两种方式运输。
活细胞胰酶消化离心后血清发货；冻存管发货。
3.客户收到细胞后请严格按照以下要求进行操作。
3.1培养前的注意事项：A. 细胞出库前都是生长良好,我们会对出库细胞进行拍照留档(建议用户在收到细胞时拍照片,细胞拍照时请用100X 、200X倍数各拍上2~3张照片留存,可用作细胞状态的对比,拍摄的照片应当清晰)。
B. 用户在收到细胞后,先观察培养瓶是否完好,培养液是否外渗,培养液是否浑浊。
3.2新购细胞的初步培养：客户收到细胞后在未开封前,先用75％酒精将培养瓶外表擦拭干净,镜检细胞贴壁情况。
将细胞置于培养箱中进行1-2小时的缓冲，待细胞恢复基本生长状态后，进行后续细胞实验。
细胞恢复基本生长状态后，倒置显微镜下观察整个细胞生长情况：A. 细胞密度未达85％时，用75％酒精喷洒培养瓶后放在生物操作台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸取剩余培养液，只留6~8ml培养液继续培养。
B.细胞长满（达85-95％），即可进行传代。
3.3细胞培养：A.细胞密度未达85％时，5~8ml培养液继续培养。
B.培养基营养耗尽时，需及时换新鲜培养基；C.细胞长满（达85-95％），即可进行传代。
传代参考步骤如下：a.弃去培养液，用无钙镁D-PBS洗涤1-2次b.对于T25培养瓶来说，加入2-3ml 0.25%的胰酶-EDTA消化液，置37℃消化，并不时用显微镜观察细胞消化情况，如细胞回锁变圆、透亮、轻拍瓶壁呈流沙样脱落，则迅速回操作台，加入6-8ml含10％血清的完全培养液，终止消化并轻轻吹打细胞，使其变成单细胞悬液。
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百利药业生物药研发部
标准操作规程
题目：293T细胞传代培养操作规程
编号：SOP-M-e-003-
制定者：（签名）日期：年月日
批准者：（签名）日期：年月日
生效日期：年月日
题目：293T细胞培养操作规程
1目的293T细胞是常用于包装和扩增病毒载体的工具细胞，因此做好293T细胞的培养，为保证相关实验的正常进行提供必要条件。
2适用范围本部门293T细胞培养
3操作方法
将移液器和移液枪、15ml离心管、离心管架、75cm2新的细胞培养瓶放于生物安全柜中，按照生物安全柜的标准操作规程，将生物安全柜的紫外开启半小时。
将含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM及PBS放于37℃水浴锅中预热。
3.2.1将已长到80%-90%的293T细胞培养瓶从37℃，5%的CO2培养箱中取出，先用75%的酒精喷洒于瓶表面，将细胞培养瓶旋转放于生物安全柜中，用无菌的移液管吸净其中的培养基，加5ml的预热的PBS洗涤一次，吸净PBS。
3.2.2将含%tyption用PBS稀释两陪到五倍，向该75cm2的细胞瓶中加入3ml稀释好的%tyption，让其充分平铺于细胞表面。
盖好瓶盖，将细胞瓶放在显微镜下观察，直到细胞变圆，加含10%胎牛血清的DMEM终止反应，用移液管轻轻将瓶上的细胞吹下，将细胞液移到15ml无菌的离心管中，1000rpm离心3分钟。
3.2.3将离心上清吸弃掉，用手指轻轻拍打离心管底将底部细胞分散开，再加3mlDMEM 培养基将分散的细胞重悬稀释开，取一定量的细胞液进行n倍稀释后计数，按照细胞计数标准操作规程进行。
3.2.4计数好之后细胞传代密度按照2~5×104个细胞/cm2进行传代培养，每个75cm2的培养瓶中加10mlDMEM培养基，放于37℃，5%的CO2培养箱中培养。
3.2.524小时后观察细胞状态，待细胞长到80%-90%时进行下一次传代培养。