第四章固定化技术.

甲基丙烯醇共聚物 机械性能好，但有疏水结构 聚苯乙烯
2）偶联方法：
偶联成功与否取决于：
•载体：功能基团：芳香氨基，羟基， 羧甲基等。
•酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯 基，羟基，酚羟基，咪唑基。
制备方法：
由于载体上的功能基团与酶分子上的侧 链基团间不具有直接反应的能力，因此在偶联 反应前，需先进行载体活化，在载体上引进某 种活泼基团，然后此活泼基团再与酶分子上某 一基团反应形成共价结合。
①严格控制反应条件，提高反应的专一性。
例如：使反应局限于α-氨基，保护ε-氨基；
② 应用可逆抑制剂或底物，封闭或牵制酶的活性中心与必需基 团，避免试剂影响酶的活性构型和相应基团。
例如：在进行腺三磷酶(ATPase)固定化时，可先用对羟汞
苯甲酸(PHMB)将酶的活性巯基保护起来，然后通过叠氮反 应将酶偶联于羧甲基纤维素上，在完成固定化以后，再用还 原剂使-SH活化，这样可得到高活性的固定化酶。
常用的偶联反应有：重氮化法、叠氮法、 溴化氰法、烷基化法等。
① 重氮法：
这是带芳香族氨基载体的主要反应，即载体 先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物，然后再在温 和的条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基、 咪唑基或氨基直接进行偶联。
② 叠氮法：
此反应适用于含羟基、羧甲基等的载体，如 CM-纤维素、可先在酸等作用下转变为叠氮衍 生物，这种产物能在低温、pH7.5-8.5的情况 下和酶的氨基直接偶联。但叠氮衍生物也能和 羟基、酚羟基或巯基反应。
优点： (1)可提高稳定性。 (2)能回收，易与产物分离，可反复使用。 缺点： (1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。 (2)酶活性下降。 (3)首次投入成本高。
2、固定化细胞的特点 优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。
一、什么是固定化酶/固定化细胞？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶/细胞 （固定化酶/细胞）
固定化生物技术——
是通过化学或物理的方法，用固体材料将游 离的酶或细胞束缚或限制于一定区域内，但仍 具有催化活性、并可回收及重复利用的一类技 术。
二、固定化酶和固定化细胞的特点
1、固定化酶的特点
对含有羧甲基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载 体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物，最后与酶偶联。
⑴ 酯化 ⑵ 肼解 ⑶ 叠氮化 (4) 偶联
③ 溴化氰法： 带羟基的多糖类载体如纤维素、葡聚糖和琼脂糖等常用
的反应。在碱性条件下载体羟基和溴化氰反应生成极活泼 的亚氨基碳酸酯，它在弱碱中可直接和酶的氨基进行共价 偶联反应。
硅胶、羟基磷灰石、纤维素（有机吸附剂）等。
无机吸附剂的吸附容量一般很低，多在1mg蛋白/g吸附剂。 有机吸附剂的吸附容量一般较高，
2）离子结合法（ion binding）：离子交换剂的吸 附容量一般大于物理吸附剂 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、 CM-
优点：条件温和，操作 简便，酶活力损失少。
缺点：结合力弱，易解 binding or covalent coupling）
借助共价键 将酶的活性非 必需侧链基团 和载体的功能 基团进行偶联。
1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物: 纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺
⑴ 活化
(2) 偶联
异脲键
④ 烷基化法： 含羟基的载体也可在碱性条件下和三氯三嗪(triazinyl)
等多卤代物反应，在引入活泼的卤素后能直接与酶的氨基、 酚羟基或巯基等偶联。 反应产物带正电荷，易于中性或碱 性酶偶联固定。
•优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落， 可连续使用。
•缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间 构象而影响酶的催化活性。
3.交联法（crosslinking）
借助双功能试剂使酶分子之间发生交 联的固定化方法。
双功能试剂：
常用的是戊二醛
O
O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
利用戊二醛两个醛基 都可与酶蛋白分子的 游离氨基反应，形成 Schiff碱，从而使酶或 菌体蛋白交联，制成 固定化酶或固定化菌 体。
Immobilized enzyme and cell
第四章 酶与细胞的固定化
第一节 概述 第二节 固定化酶的制备 第三节 固定化酶的性质及其影响因素 第四节 固定化细胞 第五节 固定化辅酶和原生质体 第六节 固定化酶（细胞）的应用
第一节 概述
游离酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有 机溶剂对其有影响）。 2.酶和底物只能反应一次，难于回收利用， 不仅成本高，而且难于连续化生产。 3.产物中混杂酶蛋白,产物分离纯化困难。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
交联反应既能发生在分子间，也可发生 在分子内。 • 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保 持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为 不溶态。
缺点：
(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团 被交联，酶活力损失大。 (2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用 带来不便。
在没有其它载体参与，仅通过酶分子间交联形 成的固定化酶，颗粒很小，而且机械性能不佳， 为克服这一缺点，一般可先将酶吸附于载体上， 或者包埋于胶内或微囊内，然后再交联制成固定 化酶“网”膜或“网”颗粒。这种方法又称为双 重固定化法。
4. 包埋法（entrapment）
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法 固定化方法
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
物理
离子交
吸附法 换吸附
网格型 微囊型
1.吸附法（adsorption）
依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用， 使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。
根据吸附剂的特点分:
1）物理吸附法（physical adsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、