第十章 固定化酶与固定化细胞技术
酶与细胞的固定化
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
酶工程第10章固定化酶催化的动力学特征)
一些酶在溶液中和固定化后的米氏常数值
酶
底物
固定化试剂
肌酸激酶 乳酸脱氢酶 α－糜蛋白酶 无花果蛋白酶 胰蛋白酶
ATP NADH N-乙酰酪氨酸乙酯 N-苯酰精氨酸乙酯 苯酰精氨酰胺
无（溶液酶） 对氨苯基纤维素
当 Da <<1时，酶催化的最大反应速度要大大 慢于底物的传质速率，此时该反应过程由反应动 力学控制；当 Da>>1时，底物的传质速率大大慢 于酶催化的最大反应速度，此时该反应过程由传 质扩散控制。
外扩散限制效应
（2）作图法求[S]i值和Vi值
根据 Vm[S]i
Km [S]i
kLa ([S]0
[S ]0
[S]0 [S]0
外扩散限制效应
引入 [S] [S]i ， K K m ，并定义 Da Vm ，
[S ]0
[S ]0
k L a [S ]0
[S ]i
Vm [S]0 1 [S]i
kLa [S]0 K m [S]i
[S ]0
[S]0 [S]0
Da [S] 1 [S] K [S]
Viห้องสมุดไป่ตู้
Vm [S ]0 Km [S]0
V0
在这种情况下，酶反应速度不受传质速率的 影响，为该酶的本征反应速度，或称在此条件下 可能达到的最大反应速度，用V0表示。
外扩散限制效应
当外扩散传质速率很慢，而酶表面上的反应 速度很快，此时传质速率成为限制步骤。固定化 酶外表面上的底物浓度趋于零，有
Vi k L a[S ]0 Vd max
kLa ([S]0
[S]i )
酶与蛋白质工程固定化酶与固定化细胞演示文稿
酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和 的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行 现已有多种偶联反应能制备固定化酶。这些方法在实际运用中经济意义起着决定作用，必须考
虑到酶的偶联效率，固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素
如，用乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以用
DEAE-纤维素载体有效固定。这种固定几乎是不可逆的吸附
此外，酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及
酶和载体的特性相关
➢ pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(±1-2pH单位)吸附
酶与蛋白质工程固定化酶与固 定化细胞演示文稿
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（优选）酶与蛋白质工程固定 化酶与固定化细胞
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固定化酶
固定化酶与水溶性酶比较具有以下优点：
(1) 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化 了提纯工艺
(2) 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化 (3) 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化 (4) 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性
(5) 较能适应于多酶反应
(6) 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低
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固定化酶
砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基(每一葡萄糖产生两个醛基)高聚物，可 与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶
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例如：用甘蔗渣纤维素衍生物固定化木瓜蛋白酶
高中生物酵母细胞的固定化 (3)
↓ 冲洗：将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗 2～3 次
↓ 发酵：将 150 mL 质量分数为 10%的葡萄糖溶液转移至 200 mL 的锥形瓶中，加入固定好的酵母细胞，25 ℃下发酵 24 h
3．用包埋法固定化细胞是将微生物细胞均匀地包埋于 不溶于水的多孔性载体 中，常用的包埋载体有
明胶 、 琼脂糖 、 海藻酸钠 、 醋酸纤维素 和 聚丙烯酰胺 等。 4．固定化酶的应用实例——高果糖浆的生产 固定化酶技术已经应用于高果糖浆的生产中，生产 高果糖浆所需要的酶是 葡萄糖异构酶 ，所使用的反 应柱上的孔应满足 酶颗粒 不能通过筛板上的小孔， 而 反应溶液却可以自由出入。
(3)影响实验成败的关键步骤是________________。 (4)海藻酸钠溶化过程的注意事项是______________。 (5)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞 数目_____。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形 ，说明 ______。 (6)该实验中CaCl2溶液的作用是__________。
解析 (1)酵母细胞在缺水的状态下休眠。活化是加入水使酵 母菌恢复到生活状态。酵母细胞活化后体积会增大。(2)固定 化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。(3)实验的关键是 配制海藻酸钠溶液，得到凝胶珠。(4)海藻酸钠溶化过程要小 火加热(小火间断加热)不断搅拌，使海藻酸钠完全溶化，又 不会焦糊。(5)海藻酸钠浓度过低，包埋的酵母菌就过少；海 藻酸钠浓度过高，不易与酵母菌混合均匀。(6)氯化钙能使海 藻酸钠形成聚沉。
反应物不易 与酶接近， 尤其是大分 子物质，反 应效率下降
酵母细胞的固定化
酵母细胞的固定化一、固定化酶与固定化细胞及应用实例1、固定化酶（1）含义：将酶固定在不溶于水的载体上。
（2）实例：利用固定化酶技术生产“高果糖浆”。
（3）优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。
（4）缺点：一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应才能得到。
（5）应用实例：生产高果糖浆①原料：葡萄糖②原理：葡萄糖果糖③生产过程及示意图：a.反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本。
b.提高了果糖的产量和品质。
2、固定化细胞（1）含义：将细胞固定在一定空间内的技术。
（2）优点：成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收（3）缺点：固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降，由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。
二、固定化酶或固定化细胞技术的常用方法1、固定化酶或固定化细胞：指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
2、方法：①物理吸附法 ：将酶（或细胞）吸附在载体表面上②包埋法：将酶（或细胞）包埋在细微网格里③化学结合法：将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。
葡萄糖异构酶三、固定化酵母细胞的制备与发酵（一）制备固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化：1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。
〖思考〗活化是指什么？在缺水状态下，微生物处于休眠状态。
活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。
2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用3、配制海藻酸钠溶液0.7g海藻酸钠＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。
注：加热时要用小火，或者间断加热，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中注：1、海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。
固定化酶与固定化细胞 ppt课件
• 固定化细胞意义：用完整的细胞作为生物催化剂， 以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶系 统。
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优点
①省去对酶的提取过程，使酶的损失和生产 成本降到最低程度；
②可以利用细胞的多酶系统直接生产有价值 的产物。
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第一节 酶和细胞的固定化
一、固定化酶和细胞的定义及特点 二、固定化方法 三 细胞的固定化方法
缺点：结合力弱，易解吸 附。
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2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
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1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
纤维素
葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差
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戊二醛有两 个醛基，均可与 酶或蛋白质的游 离氨基反应,使酶 蛋白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
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交联反应既能发生在分子间，也可 发生在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶 仍保持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶 变为不溶态。
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优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副
产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制
作用。
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3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
固定化酶与固定化细胞
世界上第一种工业化生产的固定化
酶 乙酰 -DL — Ala
L — Ala +乙酸
乙酰 -D — Ala
.
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化 酶柱子
消
泵
离心机
旋
反
应
器
反应产物
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
.
2.葡萄糖异构酶 世界上生产规模
最大, 应用最为成功 的一种固定化酶。
.
固定化方法
吸附法
包埋法 共价结 交联法
物理吸附法 离子吸附法
合法
制备难易 易
易
较难 难
较难
结合程度 活力回收
弱
中等
高，酶易流失 高
强
强
强
高
低
中等
再生
可能
可能
不能 不能 不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
不变
.
不变 可变 可变
三 细胞的固定化方法
• 1.固定化细胞的分类 • 2.固定化方法
.
1.固定化细胞的分类
.
3.固定化原生质体
意义:
(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩
散障碍，有利于氧的传递，营养成分
的吸收和胞内产物的分泌。
(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定
化后，由于载体的保护作用，稳定性
提高。
.
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法 固定化方法
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
物理
离子交
吸附法 换吸附
酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。 (二) 蛋白总量 1.双辛可宁酸法(BCA法) 2.考马斯亮蓝法 .
酶与细胞固定化的方法
酶与细胞固定化的方法酶呀，就像是细胞世界里的小精灵，它们有着神奇的魔力，可以加速各种化学反应的进行。
那怎么才能把这些小精灵更好地利用起来呢？这就涉及到细胞固定化啦！细胞固定化，简单来说，就是给酶找个安稳的“家”，让它们能老老实实地在那里发挥作用。
那都有哪些方法呢？有一种方法就像是给酶盖房子，这就是吸附法。
就好像磁铁能吸住铁钉一样，一些具有吸附能力的材料可以把酶吸附住。
这些材料就像是酶的小窝，让酶舒舒服服地待在里面。
这种方法简单又方便，不需要太复杂的操作。
还有包埋法，这就好像把酶包在一个小口袋里。
用一些特殊的材料形成一个小网格，把酶困在里面。
酶在这个小口袋里依然可以自由活动，发挥它们的本领。
交联法呢，就像是给酶之间拉起很多“绳子”，让它们彼此连接固定起来。
就像小朋友们手牵手一样，这样酶就不容易乱跑啦。
这些方法各有各的特点和适用情况呢。
比如说吸附法，操作简单，但是可能不太牢固，酶容易跑掉。
包埋法呢，能很好地保护酶，但有时候可能会影响酶的活性。
交联法比较牢固，但操作起来可能稍微麻烦一点。
那我们为什么要费这么大劲去固定化酶呢？这好处可多啦！固定化后的酶可以重复使用呀，就像我们的工具一样，用了一次还能再用，多划算！而且它们的稳定性也提高了，不会轻易被破坏。
这就好比一个娇弱的小公主变成了坚强的女战士。
想象一下，如果没有这些细胞固定化的方法，我们的很多生产过程会变得多么麻烦呀！酶就像一群调皮的小孩子，到处乱跑，不好管理。
但是有了这些方法，它们就变得乖乖的，为我们的生活和生产带来了很多便利。
在实际应用中，我们要根据具体的情况选择合适的方法。
就像我们穿衣服一样，不同的场合要穿不同的衣服。
我们要让酶在最合适的环境中发挥最大的作用。
总之，酶与细胞固定化的方法是非常重要的，它们就像是打开生物技术大门的钥匙。
让我们更好地利用这些神奇的酶，为我们的生活创造更多的美好和可能吧！难道不是吗？。
固定化酶与固定化细胞
生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的, 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的,结构 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径. 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径.
固定化细胞
直接把微生物细胞固定化
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法. 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法.将 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶, 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶, 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶,二和三醋酸纤 胶原,明胶和戊二醛等包埋起来, 维,胶原,明胶和戊二醛等包埋起来,发挥酶 或酶系的作用. 或酶系的作用. 例如: 3m1细胞悬浮液加人到 例如:海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到 2% 溶液中,置冰箱10h 10h, 20ml 2%CaCl2溶液中,置冰箱10h,用 100ml生理盐水洗二次 生理盐水洗二次. 100ml生理盐水洗二次. 注意:如果反复使用固定化细胞,需要避免 注意:如果反复使用固定化细胞, 其他微生物的污染, 其他微生物的污染,在工业生产中细胞的固 定化是在严格无菌条件下进行. 定化是在严格无菌条件下进行.
酶分子被结合到水不溶性 载体上共价结合形成水不 溶性的固定化酶
交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互 交联呈网状结构的固定化方法. 交联呈网状结构的固定化方法. 最常用的双功能试剂有戊二醛, 最常用的双功能试剂有戊二醛,顺丁稀二酸 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基, 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基,酚 咪唑基及巯基均可参与交联反应. 基,咪唑基及巯基均可参与交联反应. 双功能试剂: 双功能试剂: 常用的是戊二醛 常用的是戊二醛 O O
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶及细胞固定化技术是一种常见的生物技术方法，广泛应用于食品工业、医药工业、环境保护等领域。
通过这种技术，酶或细胞被固定在一种固体材料上，从而增强了它们的稳定性和重复使用性，提高了生产效率和产品质量。
本文将介绍酶及细胞固定化技术的原理、优势以及在不同领域的应用情况。
酶及细胞固定化技术的原理主要是通过将酶或细胞固定在一种固定载体上，使其能够稳定地存在于一定的环境中并保持其生物活性。
固定载体一般是多孔性的固体材料，如珠状树脂、活性炭、聚合物材料等。
在固定化过程中，酶或细胞通常会与载体表面发生物理或化学结合，从而实现固定化。
固定化后的酶或细胞能够在一定条件下发挥作用，实现对底物的转化或反应。
二、酶及细胞固定化技术的优势相较于游离态的酶或细胞，在固定化状态下具有以下优势：1.稳定性高：固定化后的酶或细胞能够更好地耐受环境变化，如温度、pH值等变化，从而提高其稳定性和长期使用的能力。
2.重复使用性强：固定化后的酶或细胞能够被多次使用，降低了成本，提高了生产效率。
3.易于分离：固定化后的酶或细胞与反应物之间的分离更加便利，便于后续操作和产品纯化。
4.改善环境适应性：固定化后的酶或细胞对不同环境条件的适应能力更强，可在复杂环境中发挥作用，适用范围更广。
5.抑制酶或细胞的不良反应：在固定化状态下，酶或细胞的不良反应如自身降解被抑制，更加稳定可靠。
酶及细胞固定化技术在食品工业中得到了广泛应用。
一些发酵产品的生产过程中，固定化酶或细胞能够提高发酵效率、缩短发酵周期，并且保证产品的稳定性和质量。
在乳制品工业中，利用固定化乳酸菌进行发酵能够保持产品的风味和质量，并且加速乳酸发酵的速度，提高了生产效率。
固定化酶还可以应用于酶解工艺，如利用固定化酶对淀粉、蛋白质等进行水解，得到高质量的发酵原料。
固定化技术还可以用于改善食品加工过程中的废水处理，通过固定化细胞去除废水中的有机物和重金属离子，净化废水，达到环保的目的。
固定化酶和固定化细胞的制作方法
固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。
是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。
3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。
4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。
5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。
6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。
多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。
（二）、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。
(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。
固定化酶与固定化细胞技术
固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。
作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。
由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。
但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。
由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。
酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。
由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。
如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。
从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。
随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。
对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。
一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。
第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。
固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。
目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。
第十章 固定化酶2010
究，并第一次实现了酶的固定化。
1960年，日本的千畑一郎开始了氨基酰化酶固定化 研究，开始了将固定酶应用在工业上的第一步。 氨基酸的光学分析，实现了酶连续反应的工业化。这 是世界上固定化酶用于工业的开端。
1969年，千畑一郎成功地将氨基酰化酶反应用于DL-
1973年，千畑一郎再次在工业上成功地固定化大肠杆
2、微囊化包埋法（微囊型） 微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体中。 微囊型固定化酶通常是直径为几微米到几百微米的球 状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物和 产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。 胶囊和脂质体主要用于医学治疗。 作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲 基丙烯酸甲酯等。
三、包埋法
1、凝胶包埋法（胶格包埋法）（网格型） 将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。 聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法 ： 先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液 中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合， 结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的 机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的 同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。 K-角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶可与二、三价金属 离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固 定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。 海藻酸钠、胶原和明胶也是常用的包埋载体。
（二）固定化酶性质的改变 1.活力变化 固定化酶的活力在大多数情况下比天然酶下降，其专 一性也会受到影响发生改变。 活力下降的原因： 酶分子在固定化过程中，酶的空间构像发生了变 化，甚至活性中心的氨基酸也会参加反应。 固定化后的空间障碍效应的影响。 内扩散阻力的影响使底物分子与活性中心的接近 受阻。
（2）界面聚合法：是利用亲水性单体和疏水性单体在 界面发生聚合的原理包埋酶。 它所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包 埋过程中发生化学反应而失活。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶及细胞固定化技术是一种将酶或细胞固定在载体上的技术，以使其具有更好的稳定性和重复使用性。
固定化技术已被广泛应用于生物医学、工业、环境等领域。
下面将对酶及细胞固定化技术进行详细介绍。
酶是生物催化剂，广泛应用于食品、医药、化工等领域。
传统的酶工程主要基于游离酶，但是游离酶不具有稳定性和重复使用性弱的缺点，这就限制了其在工业生产方面的应用。
而酶固定化技术可以通过化学或物理方法将酶固定在载体上，使其具有更好的稳定性和重复使用性。
1. 化学固定法化学固定法是一种通过共价键连接酶和载体的方法。
该方法基于酶和载体之间的化学交互作用，通过改变酶的分子结构，以使其固定在载体上。
化学固定法适用于固定生物分子化学性质类似的酶，并产生最小的影响，请酶的活性。
物理固定法是一种通过物理作用将酶固定在载体上的方法。
该方法基于酶和载体之间的物理交互作用，如静电吸附、离子交换、锁链和凝胶气相沉积等。
物理固定法适用于固定易溶胶的酶，以保持酶活性和稳定性。
细胞固定化技术是将细胞固定在载体上的方法。
固定细胞后，其活性和稳定性得到提高，使得其在工业生产中得到广泛应用。
细胞固定化技术分为两类：静态和动态。
静态细胞固定化技术通过静止相来实现细胞固定化。
最常用的静态细胞固定化技术包括：微囊化、凝胶微囊化和包埋。
微囊化是将细胞封装在聚合物或蛋白质材料中，以形成筛网结构，使细胞能够在载体上安全地生长。
凝胶微囊化是将细胞悬浮在凝胶中，以形成凝胶微囊。
包埋是将细胞置于凝胶、聚合物或其他材料中，以固定细胞并形成细胞团块。
动态细胞固定化技术使用特定装置来保持细胞与载体的稳定性。
最常用的动态细胞固定化技术包括：滤池、旋转生物反应器、循环床反应器。
滤池是将细胞置于纤维滤袋中，以滤分离细胞并悬浮于培养液中。
旋转生物反应器是将细胞与载荷一起旋转，并同时提供氧气和培养液以促进细胞的生长。
循环床反应器是将细胞与载体在床中循环，以提供一定的氧气和培养液。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶及细胞固定化技术是一种将酶或细胞固定在某种材料上，以便进行特定反应的技术。
这种技术可以有效地提高反应速率、稳定性和重复使用性，广泛应用于生物技术、食品工业、环境保护和医药领域。
本文将介绍酶及细胞固定化技术的原理、应用和未来发展方向。
酶及细胞固定化技术的关键在于将酶或细胞固定在一种载体上，以便进行特定反应。
常用的载体材料包括天然材料如海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇等，以及合成材料如聚丙烯酸酯、氧化硅、氨基硅烷等。
通过交联、吸附、包埋等方法，将酶或细胞与载体结合在一起，形成固定化的酶或细胞系统。
固定化技术的主要优点在于可以提高酶或细胞的稳定性和重复使用性。
通过固定在载体上，酶或细胞可以更好地抵抗外界因素的影响，如温度、pH值、离子强度等。
固定化的酶或细胞可以通过简单的分离和回收，实现反应产物的纯化和酶的再利用。
二、酶及细胞固定化技术的应用酶及细胞固定化技术在生物技术、食品工业、环境保护和医药领域有着广泛的应用。
1. 生物技术领域在生物技术领域，酶及细胞固定化技术被用于生产化学品、药物和生物燃料。
以葡萄糖氧化酶为例，固定化的葡萄糖氧化酶可以用于葡萄糖检测、生物传感器以及生物燃料电池中。
固定化的工程酶也被用于合成生物材料、精细化学品和医药中间体，以实现高效、环保的生产过程。
2. 食品工业领域在食品工业领域，酶及细胞固定化技术被用于食品加工、酿造和酶制剂制备。
在酿造过程中，固定化的酵母细胞可以实现连续发酵，提高酒精产率和控制发酵过程。
而在食品加工中，固定化的酶可以用于降解醣类、蛋白质和脂肪，改善食品的口感和营养价值。
3. 环境保护领域在环境保护领域，酶及细胞固定化技术被用于废水处理、土壤修复和污染物降解。
固定化的微生物可以被用于处理含有重金属、有机物和氮、磷等污染物的废水，减少对环境的影响。
固定化的酶也可以用于土壤修复，去除油污和有机污染，改善土壤的质量。
4. 医药领域在医药领域，酶及细胞固定化技术被用于药物的制备、生物传感器和组织工程。
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? 固定化酶技术从20世纪60年代发展的，被广泛应用于 酿造、食品、医药领域。
? 广义的固定化酶包括：
?
固定化辅酶
?
固定化细胞
?
固定化细胞器
? 一般来说，对于一步活两步转化过程用固定化酶较合 适；对多步转化，用整细胞。
第一节固定化酶
固定化酶是指在一定空间内呈闭锁状态存 在的酶，能连续进行反应，反应后的酶可 以回收重复使用。
(四) 交联法
? 是用多功能试剂进行酶蛋白分子之间的 交联形成共价键,得到交联网架结构的方 法。
? 最常用的交联试剂是戊二醛，还有双重 氮联苯胺等。
以戊二醛为例说明如下 ：
（五）非共价结合法
? 对于在水不溶的有机相中进行的反应。 ? 包括： ? 1.结晶法—使酶结晶而实现固定化的方
法。 ? 2.分散法—将酶分散于水不溶相中实现
（二）最适pH的变化
影响固定化酶最适 pH因素主要有两个： 1.载体的带电性质 ；
负电的载体固定化酶，最适pH比游离酶高； 正电的载体固定化酶，最适pH比游离酶低； 电中性的载体固定化酶，最适pH一般不改变。
2.酶催化反应的产物性质。
产物为酸性时，固定化酶的最适pH比游离酶高； 产物为碱性时，固定化酶的最适pH比游离酶低； 产物为中性时，最适pH一般不改变。
一、固定化酶制备的方法
? 固定化酶的制备方法大致可分为4类： ①吸附法；
? ②共价结合法； ? ②交联法； ? ④包埋法。
（一）包埋法
? 它是一种用物理方法将酶包埋在高聚物 内，反应条件温和．并且不改变酶结构 的固定化方法。
? 包埋法又可分为 ? （1）网格型； ? （2）微囊型；
? 1．网格型：材料有聚丙烯酰胺、三醋 酸纤维、淀粉、硅胶、血纤维和胶原等。
固定化细胞
将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为 细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的 细胞称为固定化细胞。
特点： 1. 无需进行酶的分离和纯化。 2. 细胞本身含有多酶体系，可催化一系列反应。 3. 酶的辅助因子可以再生，稳定性高。 4. 保持酶的原始状态，酶的回收率高。 5. 抗污染能力强。
胶、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、白土、 羧基磷灰石等； ? 有机载体：淀粉、离子交换树脂、琼脂 糖的烷基衍生物等；
（2）离子吸附法
? 酶通过离子键吸附于有离子交换基的载 体的固定化方法。
? 阴离子交换剂： DEAE-纤维素， DEAE- 葡萄糖凝胶等
? 阳离子交换剂： 羧甲基纤维素等
离子吸附法
? 优点： ? 1.操作简单； ? 2.条件温和； ? 3.回收率高； ? 缺点： ? 酶易脱落；
（三）最适温度变化
1.固定化酶的最适作用温度一般与游离 酶差不多，活化能也变化不大。
2.由于固定化后，酶的热稳定性提高， 所以最适温度也随之提高。
（四）固定化酶稳定性
? 固定化酶对热、各种变性剂的耐受性增 强，稳定性提高。
固定化酶稳定性提高的原因： ? 1. 酶分子与载体多点连接，可防止酶变
形； ? 2. 酶活力的缓慢释放； ? 3. 抑制酶的自降解；
? 2．微囊型：悬浮液被包裹在膜内，使 酶存于类似细胞的环境中，阻止了酶的 脱落。小分子底物则能迅速通过膜与酶 作用，产物扩散出来。
（二）吸附法
含酶水溶液和吸附剂接触，经洗涤除去 不吸附的酶便能制得固定化酶。 吸附法包括： ? （1）物理吸附法； ? （2）离子吸附法；
（1）物理吸附法
常用吸附剂： ? 无机载体：高岭土、膨润土、磷酸钙凝
蛋白质在载体上的吸附和解吸与下列因素有关。
? 1．pH ：PH 能影响载体蛋白质的电荷，
从而影响菌在载体上的吸附。一般情况 下，在蛋白质的等电点可以达到最大吸 附。 ? 2．盐：一般认为盐阻止吸附，盐也被 用来洗脱从低盐溶液中吸附的酶。 盐可以促进蛋白质吸附在惰性支持物上， 即称“盐析”吸附。
? 3. 酶浓度：一般在一定量载体上的吸附，总 是随酶浓度的增加而增加，直到饱和。
固定化的方法。
二、固定化酶的性质
（一）固定化酶的活性 ? 固定化酶的活性较水溶性酶有所下降。 ? 原因： ? 1.酶分子空间结构的变化，影响活性中心氨基酸。 ? 2.空间位阻影响底物与酶的定位作用。 ? 3.内扩散阻力影响底物与酶的接触。 注： ? 个别固定化酶活力增强可能是酶得到化学修饰或稳定
性增加。
? 4．温度：通常随 温度升高而增加酶的吸附 ， 但温度升高会造成酶失活的加速。
? 5．吸附速度： 酶在固体支持物上吸附速度 比较缓慢, 是由于酶的扩散速度较低所致。
? 6．载体：影响酶活力的重要因素是载体 表 面积、多孔度及载体的预处理 。
（三）共价结合法
? 酶蛋白分子上功能团和固相支持物上的 反应基团之间形成化学共价键的方法。
三、影响固定化酶的因素
酶本节 辅酶和辅基的固定化
原因 ? 辅酶固定化 方法
形式
辅酶固定化原因
载体的性质对固定化酶有很大影响：
? 1.载体应是亲水的，疏水载体与有机溶剂相同 的变性影响。
? 2. 载体也要求有一定的机械强度和稳定性。 ? 3.载体须具备能在温和条件下与酶结合的功能
团。 ? 常用的载体包括 : ? 1)天然高分子 (纤维素、琼脂糖、淀粉、葡聚
糖凝胶、胶原及其衍生物等 )， ? 2)合成高聚物 (尼龙、多聚氨基酸等 ) ? 3)无机支持物 (多孔玻璃、金属氧化物 )。
功能团: ? 酶分子N端:α-氨基，ε-氨基． ? 酶分子C端: 羧基、疏基、羟基、苯环
等。
? 优点：
? 酶和载体之间的连接很牢固，不会发生酶的 脱落，稳定性较好 。
? 缺点:
? 1.载体的活化或固定化 操作比较复杂，反应条 件也比较剧烈。
? 2. 若共价结合包含酶活性中心有关的基团， 会导致酶的活力损失 。
酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固 定化酶的过程。
固定化酶的形状： 颗粒---工业发酵 线条----工业发酵 薄膜---酶电极 酶管---工业生产（机械强度大）
固定化酶的特点
优点：1.可多次使用，且酶的稳定性提高。 2.反应后，酶易与底物和产物分开。 3.反应条件易于控制 。
缺点：1.费用太高。 2. 大分子的底物不易使用。