免疫组化的基本原理修改版
免疫组化的原理及应用
免疫组化的原理及应用原理免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过特异性抗体与相应抗原的特异性结合，利用染色反应显示出有关蛋白质在组织或细胞中的位置与数量的技术。
简单来说，免疫组化是通过酶标法或荧光法等方法，利用特异性抗体标记目标蛋白质，从而在组织或细胞中检测和定位目标蛋白质的方法。
免疫组化的原理主要包括以下几个步骤：1.抗原修复：免疫组化一般需要在标本切片前对组织进行抗原修复处理，以恢复和增强抗原的免疫活性。
2.阻断非特异性结合：在免疫组化过程中，为了防止非特异性结合的出现，需要使用非特异性抗体或蛋白质进行阻断。
3.抗体结合：将特异性抗体与标本中的目标抗原进行结合，可采用直接法或间接法。
4.信号显示：对于直接法，特异性抗体上已标记有荧光染料或酶标标记，可直接显示信号；对于间接法，再添加与特异性抗体免疫结合的二抗，二抗上标记有荧光染料或酶标标记，用于显示信号。
5.结果观察与分析：利用显微镜观察标本中信号的形态、分布和强度，进行结果判读和分析。
应用免疫组化在生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域都有广泛的应用。
以下列举一些主要的应用：1.细胞定位：通过使用特异性抗体和荧光染料标记目标蛋白质，可以在细胞水平上观察和定位目标蛋白质的分布和表达情况。
2.组织检测：通过在组织切片上应用免疫组化技术，可以检测和定位特定蛋白质在组织中的表达情况，并用于研究组织的结构和功能。
3.癌症诊断：免疫组化在肿瘤诊断中有重要的应用价值。
通过检测肿瘤标志物的表达情况，可以帮助医生判断肿瘤类型、分级和预后，并指导相应的治疗方案。
4.药物研发：免疫组化可以用于评估新药对蛋白质表达的影响，了解新药的作用机制，以及筛选适合的治疗靶点。
5.神经科学研究：免疫组化在神经科学领域的研究中也有广泛的应用。
通过免疫组化技术，可以观察和定位神经元、神经递质和突触相关蛋白质，帮助研究神经系统的结构和功能。
总的来说，免疫组化技术广泛应用于生命科学研究和临床实践中，为我们研究细胞和组织的结构与功能、研究疾病机制、辅助临床诊断等提供了有力的工具和方法。
免疫组化的原理
免疫组化的原理
免疫组化是一种利用抗体与其特异性抗原结合的反应来检测或定位特定分子的方法。
它主要基于抗体的高度特异性与高亲和力，能够识别并结合到抗原上。
免疫组化的过程一般包括固定组织、抗原还原、孵育抗体、洗涤、孵育二次抗体和检测。
具体步骤如下：
1. 固定组织：将待检测的生物组织固定在载玻片上，通常使用形式固定剂或冷冻剂进行固定。
2. 抗原还原：对固定组织进行抗原还原处理，以破坏抗原与抗体结合时的形态学阻滞并使抗原更易于与抗体结合。
3. 孵育抗体：将含有特异性抗体的抗体溶液加到载玻片上的组织切片上，允许其与目标抗原结合。
此时，如果组织中存在目标抗原，抗体就会与其结合形成免疫复合物。
4. 洗涤：通过洗涤步骤去除未结合的抗体，减少干扰性信号的产生。
洗涤通常使用磷缓冲盐溶液或其他缓冲溶液进行多次冲洗。
5. 孵育二次抗体：加入标记有酶、荧光物质或放射性同位素等的二抗溶液，使其与已结合的抗原-一抗复合物发生反应。
二次抗体通常是对多种一抗的特异性抗体。
6. 检测：使用相应的技术，如酶标记法、荧光标记法或放射性
探测等，检测二次抗体与抗原-一抗复合物的结合情况。
通过信号的产生和可视化，可以确定抗原的存在位置以及其表达程度。
总的来说，免疫组化是一种通过利用抗体与抗原间的特异性反应，实现对目标抗原的检测和定位的方法。
其原理主要是通过抗原-抗体的结合来实现对特定分子的识别和鉴定。
免疫组化的作用原理及应用
免疫组化的作用原理及应用一、免疫组化的作用原理免疫组化是利用特异性抗体与待测物相结合的方法，在组织或细胞内部检测目标物质的存在和定位。
其原理基于免疫学中的免疫反应原理，主要包括以下几个步骤：1.抗原-抗体结合：免疫组化的第一步是将特异性抗体与待测物中的抗原结合。
抗原可以是病原体的蛋白质、肿瘤标志物、细胞内的特定蛋白等。
抗体是针对特定抗原产生的高度特异性的蛋白质。
2.抗原-抗体复合物形成：当抗体与抗原结合后，形成抗原-抗体复合物。
这种复合物可以通过非共价键或共价键相互结合。
3.抗原-抗体复合物与报告试剂复合：报告试剂是用来检测抗原-抗体复合物存在的试剂。
可以是酶标记的二抗、荧光素或放射性同位素标记的抗体等。
4.反应物质的检测：通过酶、荧光或放射性同位素等反应物质的检测手段，可以检测到报告试剂与抗原-抗体复合物的存在。
二、免疫组化的应用免疫组化技术在医学和生物学研究中有着广泛的应用，主要体现在以下几个方面：1.癌症诊断：免疫组化技术可以用于癌细胞的鉴定和分型。
通过对癌细胞标记特定抗原的表达情况进行检测，可以帮助确定癌症的类型和分级，指导临床治疗方案的选择。
2.免疫相关疾病的诊断：免疫组化技术可以用于多种免疫相关疾病的诊断，如自身免疫性疾病和过敏性疾病等。
通过检测特定抗体或细胞因子的表达情况，可以辅助临床医生判断疾病的发生和发展。
3.药物研发：免疫组化技术在药物研发领域有着重要的应用。
可以通过检测药物在动物体内的分布情况以及对特定分子的影响，评估药物的有效性和安全性。
4.细胞生物学研究：免疫组化技术可以用于细胞膜、细胞器的定位以及分子间的相互作用等的研究。
通过检测特定抗原在细胞内的位置和分布情况，可以揭示细胞的功能和调控机制。
5.蛋白质组学研究：免疫组化技术在蛋白质组学研究中有着重要的应用。
可以用于检测特定蛋白质的表达水平和修饰情况，揭示蛋白质功能和调控网络。
以上仅是免疫组化技术的一些应用示例，随着技术的发展和创新，免疫组化技术在医学和生物学领域将发挥出更大的作用。
免疫组化染色修改
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。
免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。
间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。
PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。
亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。
ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。
在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。
ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）SP 法与ABC 法相似，其不同于ABC 法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶（图2）。
在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。
与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。
免疫组化实验原理
免疫组化实验原理1 免疫组化实验原理免疫组化实验是一种基于特异性抗体与抗原相互作用的技术。
它可以用来鉴定和定位特定蛋白质或其他生物分子在组织中的位置和表达水平，以及某些疾病的诊断和治疗。
下面我们来了解一下免疫组化实验的原理。
2 免疫反应的基本原理免疫组化实验是基于免疫学原理的。
当人体内出现一种外来的“入侵”物质（抗原），比如细菌、病毒、细胞等，免疫系统就会启动一系列的防御机制来对抗入侵者。
其中，B细胞具有产生特异性抗体的能力，而T细胞则可以识别和清除被感染的细胞。
当免疫系统第一次遇到抗原时，它会产生大量的特异性抗体。
这些特异性抗体可以识别和结合到抗原的特定位点上，从而触发免疫反应。
这个过程被称为抗原抗体反应。
在免疫组化实验中，研究人员利用这种特异性抗原抗体反应原理，将特定的抗体与某种生物分子结合，用以检测该分子的存在和表达情况。
3 免疫组化实验的基本步骤免疫组化实验的基本步骤包括：样品制备、抗原检测、抗体标记、免疫反应、检测结果和数据分析等环节。
首先，需要收集样品组织，制作切片，并进行脱水、脱蜡和再水化等处理。
接下来，使用特定的抗体，即原抗体，来识别和结合某种生物分子。
在原抗体与样品中的分子达成配对后，需要使用二抗或探针标记的抗体，即检测抗体，来识别并结合原抗体。
最后，通过染色、观察等方法来确定特定生物分子在组织中的表达情况和定位。
4 免疫组化实验的应用免疫组化实验广泛应用于医学、生命科学、农业等领域，如疾病诊断、治疗和研究、新药研究与发展、生物工程、食品检测等。
例如，通过检测某些蛋白质在肿瘤组织中的表达，可以确定肿瘤类型和预后，为癌症的诊断和治疗提供信息。
此外，还可以通过对动物组织中蛋白质超表达、突变等问题的分析来改良动物模型、研究基因功能和细胞信号传导等问题。
总之，免疫组化实验原理简单、方法灵活、结果可靠，为生命科学和医学领域提供了一种强有力的分析工具。
免疫组化的原理及操作规程
免疫组化的原理及操作规程免疫组化，即免疫组织化学染色技术，是一种利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（如荧光素、酶、金属离子、同位素等）显色，从而确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质）的定位、定性及相对定量的研究方法。
该技术广泛应用于临床病理诊断、生物医学研究以及药物开发等领域。
本文将详细介绍免疫组化的原理及操作规程。
一、免疫组化的原理免疫组化的基本原理是抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生特异性结合的物质。
抗体是机体的免疫细胞在抗原刺激下产生的具有特异性识别能力的免疫球蛋白。
在免疫组化中，通常将目标抗原（如某种蛋白质或多肽）作为待检测物，通过特定的抗体与之结合，再利用标记技术使抗体可视化，从而实现对目标抗原的定位、定性和定量研究。
免疫组化的标记技术主要有直接法和间接法两种。
直接法是将标记物（如荧光素、酶等）直接标记在抗体上，使其与目标抗原结合后直接显色。
间接法则是利用未标记的抗体（一抗）先与目标抗原结合，然后再通过标记的二抗（与一抗特异性结合的抗体）与一抗结合，最终实现显色。
间接法具有更高的灵敏度和灵活性，因此在实际应用中更为常见。
二、免疫组化的操作规程免疫组化的操作规程主要包括以下几个步骤：1. 标本处理：根据实验需求选择合适的组织标本，并进行固定、脱水、包埋等处理，制备成组织切片或细胞涂片。
固定是为了保持组织或细胞的形态结构，防止抗原丢失；脱水则是为了去除组织中的水分，便于后续操作；包埋则是将组织块包裹在支持物（如石蜡）中，便于切片。
2. 抗原修复：由于固定和脱水等处理过程可能导致抗原表位的遮蔽或改变，因此在进行免疫组化染色前，需要对抗原进行修复。
常用的修复方法包括热修复、酶修复和酸修复等。
具体方法应根据实验需求和抗原性质进行选择。
3. 阻断内源性酶活性：为了避免组织内源性酶对后续显色反应的干扰，需要使用相应的阻断剂（如过氧化氢）对内源性酶活性进行阻断。
免疫组化法原理
免疫组化法原理一、免疫组化法概述免疫组化法（immunohistochemistry，IHC）是一种将抗体与组织中的特定抗原结合并可视化的技术。
它是一种常用的诊断和研究工具，可用于检测肿瘤、感染和自身免疫性疾病等多种疾病。
二、免疫组化法的基本原理1. 抗原-抗体反应IHC技术基于抗原-抗体反应，即将特异性的抗体与组织中的特定抗原结合。
在IHC技术中，主要使用单克隆或多克隆抗体。
单克隆抗体来源于同一B细胞，具有高度特异性和亲和力；多克隆抗体则由多个B 细胞产生，具有较广泛的特异性。
2. 报告物质为了可视化抗原-抗体反应结果，在IHC技术中需要使用报告物质。
常见的报告物质包括酶标记物和荧光标记物。
酶标记物包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等，荧光标记物则包括荧光素、罗丹明和荧光素异硫氰酸酯等。
3. 反应步骤IHC技术一般包括以下几个步骤：（1）取材：首先需要取得组织样本，如肿瘤组织或正常组织。
（2）制片：将组织样本切片，并固定在载玻片上。
（3）抗体处理：将特异性抗体加入载玻片上的组织切片中，与目标抗原结合。
（4）洗涤：去除未结合的抗体。
（5）报告物质处理：加入报告物质，可视化抗原-抗体反应结果。
（6）染色：使用适当的染色剂对载玻片进行染色，以增强可视化效果。
（7）观察和分析：使用显微镜观察载玻片，并进行结果分析。
三、免疫组化法的优缺点1. 优点（1）高度特异性：IHC技术可使用特异性抗体对目标抗原进行检测，具有较高的特异性。
（2）定量分析：通过计算染色强度或阳性细胞比例等参数，可进行定量分析。
（3）组织结构信息：IHC技术可同时检测抗原和组织结构信息，有助于了解病理过程。
（4）广泛应用：IHC技术可用于检测多种疾病，如肿瘤、感染和自身免疫性疾病等。
2. 缺点（1）假阳性结果：IHC技术可能会出现假阳性结果，即抗体与非目标抗原结合。
（2）标本制备困难：标本制备需要严格控制多个因素，如取材方式、切片厚度和固定时间等。
高级病理学：免疫组化技术原理与应用
乳腺良性肿瘤肌上皮完整， Actin＋ 乳腺癌浸润性，缺乏肌上皮， Actin－ 晚期乳腺癌，肌上皮萎缩或完全破坏消失
（三）神经源性肿瘤标记物
１、胶质纤维酸性蛋白（ Glial fibrillary acide protein ，GFAP）
Eng在1971年首先从人脑胶质细胞中分离出 来的一种酸性蛋白
①植物凝集素与糖 ②葡萄球菌A蛋白与IgG ③生物素Biotin与卵白素Avidin ④受体与配体 ⑤阴阳离子
ABC法(Avidin biotin-peroxidase complex)
染色原理与流程：
ABC：①Biotin+HRP Biotin-HRP
②1分子Avidin+3分子Biotin-HRP
２、与肿瘤生长相关的抗原 ①肿瘤胚胎抗原 ②肿瘤相关抗原 ③细胞机能抗原 ④某些酶与激素 ⑤病毒基因
其中，在肿瘤鉴别诊断中，具有代 表性的是５种中间丝蛋白：
①上皮细胞的角蛋白（Keratin） ②间胚叶细胞的波纹蛋白（Vimentin） ③肌细胞的结蛋白（Desmin） ④神经元的神经细丝
⑤神经胶质细胞的胶质细丝酸性蛋白
或4%胃蛋白酶消化30-60min，37°C 4，PBS 3X3min 5，0.3%H2O2甲醇液，室温10-30min 6，5%-10%正常血清，室温20 min 7，不洗，滴加适当浓度的特异性抗体，
如1：100的McAbDesmin，37°C60min，或4°C过夜 8，PBS 3X3min 9，生物素化羊抗鼠二抗，1：200，37°C，40min 10，PBS 3X3min 11，ABC1：100-1：150，37°C，40-50min
免疫组化原理和步骤
免疫组化原理和步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于组织学和细胞学研究中的实验方法，主要用于检测和定位蛋白质在组织或细胞中的分布和表达水平。
它结合了免疫学原理和组织学技术，通过使用特异性的抗体和染色剂来实现对目标蛋白质的检测和可视化。
免疫组化的原理主要是利用抗体的高度特异性与抗原相结合，然后使用染色技术来显示抗原的位置。
该技术的基本原理可分为抗原-抗体反应、信号放大和信号显示三个步骤。
第一步：抗原-抗体反应免疫组化的第一步是选择合适的抗体，通过与目标蛋白质的特异性结合来形成抗原-抗体复合物。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
单克隆抗体具有高度特异性，只能结合到特定的抗原上。
多克隆抗体具有高度敏感性，可以结合多个位点，从而实现信号放大。
通常，为了提高抗原的可检测性，需要对组织样本进行抗原修复处理。
这可以通过热处理（如蒸汽加热、微波加热）或酶切处理来实现。
修复可以解除组织样本中抗原与蛋白质结构之间的交联，增加抗体的渗透性和可结合性。
当抗原-抗体反应发生时，可通过一系列化学反应来形成抗原-抗体复合物。
例如，可以使用二抗来与抗原-抗体复合物结合，然后使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）标记的二抗来与二抗结合。
该反应可形成稳定的抗体-酶复合物。
第二步：信号放大由于抗原-抗体复合物的信号很弱，通常需要进行信号放大以便更好地检测到目标蛋白质。
放大信号的方法有很多种，其中最常用的是酶免疫标记联合酶放大技术。
酶免疫标记是通过将抗体与酶结合，使其能够催化特定的化学反应来产生荧光、色素或光学信号。
常用的酶免疫标记包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
这些酶能够催化荧光素、二苯基胺、硝基蓝等底物的氧化还原反应，从而产生可视化的信号。
酶放大技术常用的方法包括：免疫酶化学法（如DAB法）、免疫荧光法和免疫酶学荧光混合法等。
这些方法可通过将底物转化为可见的色素或荧光信号来标记抗原-抗体复合物，从而实现目标蛋白质的检测和定位。
免疫组化原理及步骤
免疫组化原理及步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗体与抗原特异性结合的原理来检测组织中特定蛋白质的方法。
它在病理诊断、生物医学研究和药物研发等领域具有广泛的应用价值。
本文将介绍免疫组化的原理及实验步骤，希望能对相关领域的研究者和实验人员有所帮助。
免疫组化的原理主要基于抗体与抗原的特异性结合。
在免疫组化实验中，首先需要选择与目标蛋白特异性结合的一抗和二抗。
一抗与目标蛋白结合后，通过二抗与一抗结合，形成复合物，再通过酶标记或荧光标记的二抗来检测目标蛋白的表达情况。
免疫组化的关键在于选择合适的抗体，确保其对目标蛋白的特异性结合，从而实现对目标蛋白的定位和定量分析。
免疫组化实验的步骤通常包括组织标本的处理、抗原修复、蛋白质阻断、抗体染色、显色反应和显微镜观察等。
首先，组织标本需要进行脱水、蜡包埋和切片等处理，以保证标本的完整性和稳定性。
接下来是抗原修复步骤，通过高温、酶解或酸碱处理等方法，使组织中的蛋白质发生构象变化，从而有利于抗体的结合。
然后进行蛋白质阻断，通过使用牛血清白蛋白（BSA）或牛血清等，阻断非特异性结合位点，减少背景信号的干扰。
随后是抗体染色，将一抗和二抗依次加入标本中，使其与目标蛋白特异性结合。
再进行显色反应，根据酶标记或荧光标记的二抗，观察目标蛋白的表达情况。
最后通过显微镜观察，对标本进行定量分析和图像获取。
在进行免疫组化实验时，需要注意一些关键问题。
首先是抗原修复的选择，不同的抗原修复方法对不同类型的组织标本有不同的影响，需要根据实际情况进行选择。
其次是抗体的选择，需要确保抗体的特异性和敏感性，避免出现假阳性或假阴性结果。
此外，实验过程中需要严格控制各个步骤的时间和温度，避免影响实验结果的准确性。
最后，在观察和分析实验结果时，需要结合相关的对照组进行比较，以确保实验结果的可靠性。
总之，免疫组化作为一种重要的实验方法，在病理诊断和生物医学研究中有着广泛的应用前景。
免疫组化原理、步骤及要注意的事项.
免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
免疫组化的原理
免疫组化的原理免疫组化是一种用来检测组织中特定蛋白质或抗原的方法。
它主要通过特异性抗体与组织中的抗原结合，然后利用染色或其他方法来显示这种结合。
免疫组化在医学诊断、病理学研究、生物医学研究等领域有着广泛的应用。
免疫组化的原理主要包括抗原-抗体反应、信号放大和结果显示三个方面。
首先，抗原-抗体反应是免疫组化的核心原理。
抗原是指能够被免疫系统识别并产生抗体应答的物质，通常是蛋白质或多肽。
而抗体则是免疫系统产生的一种特异性蛋白质，能够与特定抗原结合。
在免疫组化中，我们首先需要选择特异性抗体，使其与我们要检测的抗原发生特异性结合。
这种抗原-抗体反应是免疫组化的基础，也是其能够检测特定蛋白质的关键。
其次，信号放大是免疫组化的重要环节。
由于组织中的抗原含量往往很低，为了能够准确检测到这些抗原，我们通常需要进行信号放大。
常用的信号放大方法包括酶标记、荧光标记等。
通过这些方法，我们可以将抗原-抗体反应产生的信号放大数倍甚至数十倍，从而提高检测的灵敏度和准确性。
最后，结果显示是免疫组化的最终步骤。
在免疫组化中，我们需要将抗原-抗体反应和信号放大的结果显示出来，通常采用染色、荧光显微镜等方法。
通过这些方法，我们可以直观地看到组织中特定蛋白质的位置和分布情况，从而对组织的特定病理变化进行定量和定性的分析。
总的来说，免疫组化的原理主要包括抗原-抗体反应、信号放大和结果显示三个方面。
通过这些步骤，我们可以准确地检测组织中特定蛋白质的存在和分布情况，为医学诊断和病理学研究提供重要的信息和依据。
免疫组化技术的不断发展和完善，将进一步推动医学和生物医学领域的发展，为人类健康事业做出更大的贡献。
免疫组化的基本原理修改版
PAP法 法
PAP复合物
二抗
一抗
抗原
特点
此法解决了酶与抗体的比例难以确定的 问题，PAP复合物中的抗酶抗体必须与 第一抗体为同种动物所产生。第二抗体 必须过量，以保证更好结合。
五、APAAP法 五、APAAP法
碱性磷酸酶（AP）抗碱性磷酸酶抗体复 合物的简称，用AP取代P（过氧化物酶） 而成，原理与PAP相似。 优点：避开了DAB，且显色对比好
一、直接法 原理： 原理：HRP标记在特异性抗体 标记在特异性抗体 （一抗）上，即形成 一抗） 抗原---抗体 复合物” “ 抗原 抗体● HRP复合物” 复合物
直接法原理示意图
酶标一抗
组织抗原 第一抗体
抗原
过氧化物酶
步骤： 步骤：一步完成 特点：方法简便、省时，专一 特点：方法简便、省时， 性强，非特异染色轻， 性强，非特异染色轻， 但敏感性差， 但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。 抗体只能检测于20世纪90年代初以 ABC法的基本原理为基础，以链酶亲和 链酶亲和 素（streptavidin,SA）代替亲和素，创建 ） 了S-P法。与亲和素相比，链酶亲和素是 一种更接近完美的生物素结合蛋白。它 的等电点为中性，故不易与组织的内源 性生物素结合。而S-P法由于应用了链酶 亲和素，其特异性更高。
抗原与抗体的结合是高度特异性的 结合，这种结合是非常牢固的。
抗原抗体结合后，其复和物是不可见的。 为了使得反应复合物可见，必须将抗体加 以标记，并利用标记物同其他物质的反应 将阳性结果转换成可见的发光或 显色。多 年来，免疫组化工作者 经过不断探索，使 得免疫组化的示踪系统和显色系统不断 改进。
组织抗原 第一抗体 过氧化物酶
直接法
附加知识
免疫组织化学方法及原理
免疫组织化学方法及原理免疫组织化学方法及原理免疫组织化学（Immunohistochemistry, 简称IHC）是一种利用抗体识别组织中特定的分子结构或细胞膜分子的方法。
IHC方法具有高度特异性和灵敏度，可用于检测细胞分子的定位、分布和数量等信息，对于肿瘤的诊断和治疗、疾病的预后等方面有重要的应用价值。
下面介绍IHC 方法的原理和常用的技术流程。
1. 原理IHC方法的核心是利用抗体与其特异性抗原之间的反应来检测组织切片中的分子结构。
抗原可是蛋白质、多糖、脂质等生物大分子，而抗体则是人工制备的、具有特异性结构的免疫球蛋白。
IHC方法涉及到两种类型的抗体：第一抗体和第二抗体。
第一抗体通常是一种单克隆或多克隆抗体，可以与组织样本中的目标抗原结合。
第二抗体通常是一种针对第一抗体特定嵌合区的细胞因子，如辣根过氧化酶（horseradish peroxidase, HRP）等，可与第一抗体结合，并使化学物质产生可视化信号。
2. 技术流程IHC技术流程分为切片处理、抗体处理、荧光分析和图像采集等步骤。
首先，组织样本通过常规包埋和切片技术制备成双层组织切片，取出切片后，通过石蜡切片解除脱脂和重水成像等处理，使其透明且能够与抗体反应。
之后，将切片进行称重并放置在载玻片上，并通过特殊的组织学染色方法进行初始染色，以可视化组织结构和细胞类型。
第二个步骤，是将切片与第一抗体接触。
不同的抗体可以结合预期的抗原，包括细胞膜分子、细胞因子、细胞内结构等。
抗体和组织样本的共同定位，和抗体和抗原间的特异性结合是检测过程成功的关键。
第三个步骤，是将切片与第二抗体结合。
第一抗体一旦结合了样本中的特定蛋白质或其他分子，则可以使用携带细胞因子的第二抗体标记，在可见的目标区域发生可视化信号。
第二抗体通常与一种辣根过氧化酶分子结合，可以利用酶联技术受体显色法或荧光标记技术进行检测，并表现在切片表面。
最后，通过镜头和图像分析系统进行图像采集和分析，可以获得被关注的区域、荧光标记的颜色和强度等信息。
免疫组化的原理
免疫组化的原理Immunohistochemistry（IHC）是一种利用免疫系统来检测细胞、组织或者小生物体内分子的实验技术，是一种应用于组织学检测、病理确诊的重要技术。
它的原理是通过病理切片是片上检测需要检测的分子，使用特异性抗体进行识别，最终能够定位和检测表达在目标器官内的分子，它是非常灵敏、无损及特异性检测标记分子的非常好的技术。
IHC的原理:一、抗体-抗原互补结合原理:1、抗体特异性结合抗原。
抗体的特异性是IHC技术的基础。
特异性抗体可以结合抗原，而不能结合其他物质。
抗原多呈正带状，而抗体多带有伞状结构，当抗体的伞状结构分子正好叠合到抗原的正带状结构上，抗体和抗原之间就产生了特殊的互补结合，这种称之为抗体-抗原互补结合原理。
2、亲和力和特异性由结合位点决定。
通过化学技术和免疫技术制备的抗体，其结合抗原的特异性及亲和力皆由抗体-抗原结合位点决定。
抗体的结合位点是抗体的锁义基团，锁义基团是抗佖的非常重要的部分，它是抗体与抗原结合的主要部分，是决定抗体的亲和力和特异性的参数，这既收入抗体的设计和制备中极为重要。
二、夹杂结合原理:1、现有方法标记抗原。
一般情况下，在IHC技术中并不使用天然抗原，而是通过表征技术或者催化技术将抗原与染色剂进行结合，赋予抗原特异性染色能力，使夹杂物无间接具有特异性结合抗原的能力，从而在可见的角度观察抗原的表达。
一般情况下，将夹杂物与抗原结合使用适当的催化剂及表征剂，使夹杂物具有高特异性及高亲和力。
2、夹杂物与抗体结合。
在夹杂物与抗原结合后，抗体可以与夹杂物进行结合，夹杂物与抗体以非互补结合方式结合，结合受夹杂物的电性，静电场等多种因素的影响，夹杂物与抗体的结合也受这些因素的左右。
三、加荧光染色原理:1、荧光物质加入染色浴中。
在进行IHC技术的染色时，可以加入荧光染料，包括紫外线发射荧光染料（如荧光团、磷脂酰磷脂）和近红外发射荧光染料（如荧光团、高分子胺）。
2、抗体和夹杂物结合共同发射荧光。
免疫组化技术的原理及方法
免疫组化技术的原理及方法免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的高灵敏度和高特异性的实验技术。
它通过特异性抗体与目标分子间的特异性结合来检测目标分子的存在和表达水平。
在该技术中，抗体作为探针，能够识别和结合目标分子的特定表位，从而可定量或定性地检测分子的存在或表达水平。
免疫组化技术的原理基于生物体自然产生的免疫应答机制。
当有外来物质（抗原）进入机体时，机体的免疫系统会产生抗体来与其特异性结合。
抗体与抗原结合后会激活一系列免疫反应，包括免疫效应细胞的激活和分泌抗体的B细胞的增殖和分化。
在免疫组化技术中，我们可以利用这一特性，使用高亲和力的特异性抗体来实现对目标分子的检测。
直接法是利用已标记的特异性抗体直接与目标分子结合。
这种方法在实验操作上比较简单，但需要对每种目标分子都有特异性标记的抗体。
直接法适用于目标分子丰度较高（>100 ng/mL）的情况。
间接法是通过两步反应实现对目标分子的检测。
第一步，使用未标记的特异性抗体与目标分子结合；第二步，使用标记抗体与先前结合的抗体结合。
标记抗体可以是酶、荧光染料、放射性同位素等。
这种方法的优势是只需要使用少量的少数几个标记抗体即可覆盖多种目标分子的检测，同时具有更高的灵敏度。
免疫组化技术的方法还包括免疫组化染色、免疫印迹和流式细胞术等。
其中，免疫组化染色是一种常见的方法，它通过对标本中特定目标分子的特异性染色来实现对其定位和定量的研究。
该方法适用于形态学研究和病理诊断。
免疫印迹是一种能够定性和定量地检测蛋白质表达的方法，通过将不同大小的蛋白质分子分离，并使用特异性抗体来检测目标蛋白质。
流式细胞术则是一种通过细胞表面的特异性抗体标记来分析和分离细胞的技术，它可以实现对细胞表型、蛋白质表达水平和细胞数量的检测。
总之，免疫组化技术是一种依赖于特异性抗体与目标分子结合的实验技术。
通过选择合适的检测方法和抗体，免疫组化技术可以应用于各种生物医学领域，如基础研究、临床诊断和药物研发。
免疫组化技术的基本原理
免疫组化技术的基本原理一、引言免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域的分子生物学技术。
它能够通过检测蛋白质的表达水平和位置来帮助研究人员了解细胞生命活动的机制，诊断疾病，并为药物开发提供重要信息。
本文将详细介绍免疫组化技术的基本原理。
二、抗体与抗原1. 抗体抗体是一种由B淋巴细胞产生的蛋白质，它能够识别并结合到体内外多种不同来源的分子，如蛋白质、多肽、碳水化合物等。
抗体通常由两个相同或不同的轻链和两个相同的重链组成，其中重链和轻链都包含一个可变区域和一个恒定区域。
可变区域决定了抗体与特定抗原结合的特异性。
2. 抗原抗原是指能够引起免疫系统产生特异性免疫应答（即产生特异性抗体）的分子。
抗原可以是蛋白质、多肽、碳水化合物、核酸等，也可以是细胞表面的分子。
抗原通常具有一定的复杂性和多样性，因此需要特异性的抗体才能与其结合。
三、免疫组化技术的基本原理1. 抗原检测免疫组化技术通常从样本中检测目标蛋白质或细胞表面分子。
首先需要制备特异性的抗体，这可以通过动物免疫或体外筛选等方法获得。
然后将这些抗体与荧光素、酶等标记物结合，形成标记抗体。
2. 样本制备样本制备是免疫组化技术中至关重要的一步。
样本可以是细胞培养物、组织切片、血液等，但必须经过适当处理才能被用于实验。
例如，在检测细胞表面分子时，需要对细胞进行固定和渗透处理以保持其形态和结构不变，并且使抗体能够进入到细胞内部。
3. 免疫反应在制备好标记抗体和样本后，将它们混合并孵育在一起进行免疫反应。
标记抗体与目标蛋白或细胞表面分子结合形成免疫复合物。
这个过程需要一定的时间和条件，如温度、pH值、离子强度等。
4. 可视化为了观察免疫反应结果，需要对样本进行可视化处理。
这可以通过荧光显微镜、酶标记等方法实现。
例如，在酶标记法中，将底物加入到样本中，底物经过酶的催化作用变色或发光，从而可以观察到目标蛋白或细胞表面分子的位置和表达水平。
四、免疫组化技术的应用1. 细胞生物学研究免疫组化技术广泛应用于细胞生物学领域，可以帮助研究人员了解细胞内蛋白质的表达和定位情况，并揭示细胞信号传导通路、代谢途径等方面的机制。
免疫组化的原理与操作
二、IHC的现状和发展前景
（一）方法学
1.从传统的抗原、抗体反应（免疫反应）→亲和反应。新的亲 和物质对有：生物素与卵白素（biotin&avidin)，葡萄球菌A 蛋白（SPA）与IgG，凝集素与受体，激素与受体。这些亲 和对亲和力强，且可与多种标记物（荧光素、酶、同位素、 胶体金、铁蛋白等）结合，由此产生了亲和组织化学 （affinity histochemistry），这些方法特异性、敏感性、稳 定性高，更方便、适于某些特殊观察（如EM）。 2.从单一显示某种物质（单标记）→显示多种物质（双标记）。 3.从LM→EM（超微结构）：免疫电镜、胶体金法、金银法。 4.从定性→定量，图象分析（IA）、流式细胞术（FCM）。 5.IHC与ISH相结合，可在不同水平检测DNA、mRNA、protein。 6. 原位PCR+IHC可在组织原位通过扩增检测微量目的DNA。 7. 趋于标准化、自动化。
Immunohistochemistry
免疫组化概述
概念：免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 是 利用抗原抗体反应和组织化学呈色反应来检测组织 和细胞中某种化学成分的一门技术,是传统的免疫学 和组织化学相结合而发展起来的一门新兴学科，也 叫原位免疫学（In situ immunology）。
（三）标记物
1. 必要性：组织细胞内Ag-Ab结合反应一般是不可 见的，若在镜下检测，则必须具有可视性标记物。 2. 常用标记物 ① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（ Fluorescein isothiocyanate ，FITC）---荧光显 微镜下呈绿色荧光; 四乙基罗达明（rho—damine RB200）---荧光显微镜下发橙红色荧光 ② 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。 ③ 生物素：（Biotin） ④ 铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 ⑤ 其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）
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本世纪70年代以后随着免疫组化 的广泛应用，技术方法不断改进， 亲和组织化学引入免疫组化，形成 抗生物素-生物素免疫组化染色系统。
基本原理
很早以前人们就注意到给鸡饲以大量鸡蛋白，会引起 鸡的维生素H缺乏症，这是 什么原因呢？经研究发现， 在鸡蛋白中有一种卵白素（Avidin)卵白素有四个同维 生素（Biotin)又名生物素结合的位点，给鸡饲以鸡蛋 白引起鸡的维生素缺乏就是由于卵白素和维生素大量 结合所致。 维生素和 卵白素之间有很强的亲和力，这种亲和力比 抗原抗体之间的亲和力还要高出100万倍，能够彼此牢 固结合 而不影响彼此的生物学活性。同时卵白素和维 生素都具有和示踪物质如辣根过氧化物酶等结合的能 力。这种反应既不是化学反应又不是免疫学反应，人 们称之为亲和组织化学。
PAP法 法
PAP复合物
二抗
一抗
抗原
特点
此法解决了酶与抗体的比例难以确定的 问题，PAP复合物中的抗酶抗体必须与 第一抗体为同种动物所产生。第二抗体 必须过量，以保证更好结合。
五、APAAP法 五、APAAP法
碱性磷酸酶（AP）抗碱性磷酸酶抗体复 合物的简称，用AP取代P（过氧化物酶） 而成，原理与PAP相似。 优点：避开了DAB，且显色对比好
该技术的主要优点是：特异性强、敏 感性高、速度快。主要缺点是：非特异性 染色问题尚未完全解决，结果判定的客观 性不足，技术程序也还比较复杂。荧光衰 减，标本不易久存，且需价格昂贵的荧光 显微镜
随着电子显微镜的广泛应用，1968年，日 本学者中根一惠等用酶代替荧光素标记 抗体，开辟了免疫酶化学之路。
免疫酶细胞化学
分直接法和间接法。直接法是将酶直接标 记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗 体上，检测细胞内特定抗原物质。间接法所用 的第一抗体是对组织细胞内多种抗原的特异性 抗体，第二抗体则为酶标记的第一抗体的抗体。 所以只要不同的第一抗体均来自同一种属，同 一种酶标记的第二抗体就能用来显示其不同特 异性抗体的存在，这样就避免了直接法中标记 每种第一抗体的麻烦，并且提高方法的敏感度。
五、ABC法 五、ABC法
1981年，上海的许世明博士在上述亲和组织 化学的基础上，改良推出了亲和素-生物素-过氧 化物酶复合物技术（avidin biotin-peroxidase complex technique，简称ABC法)。其特点是利 用抗生物素分别连接生物素标记的二抗和生物素 标记的酶。先制备ABC复合物（ABC复合物是 将过氧化酶结合在生物素上，再将生物素过氧化 酶连接物与过量的抗生素蛋白反应而制备的）。 生物素标记的第二抗体和ABC复合物因生物素抗生素反应而相连接，最后进行显色定位。
免疫反应系统
抗原的概念
抗原是一类在合适条件下能 激发机 体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫 应答产生的效应物质（抗体）在体内和 体外发生特异性结合反应的物质，如蛋 白质，糖。物质所具有的这种特性称为 抗原性.(即免疫原性和免疫反应性)
抗体的概念
抗体是B细胞识别抗原后增殖分化为
浆细胞所产生的一类能与相应抗原发生反 应的球蛋白。主要存在于血清中，也见于 体液和外分泌液中。
免疫组化是免疫学 组织化学 免疫学与组织化学 免疫学 组织化学相结合 的一个新学科。它有三个基本要素：
I. II.
免疫反应系统
示踪系统，示踪剂 示踪系统，示踪剂如辣根过氧化酶，碱 性磷酸酶。
III.
显示系统， 显示系统，显示剂 如3，3 二氨基联苯 胺（DAB)， 3-胺基-9-乙基卡巴（AEC） 由于它是以免疫学的抗原抗体反应为 理论基础，所以首先必须了解与其有关的 免疫学理论。
示踪系统
1941年COONS等用荧光素标记抗体， 检测肺炎双球菌在肺组织内的分布，开 创了免疫荧光化学的新篇章。
免疫荧光细胞化学
免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活 性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上， 与其相应的抗原（或抗体）结合后，在 荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
组织抗原 第一抗体 荧光素
抗原与抗体的结合是高度特异性的 结合，这种结合是非常牢固的。
抗原抗体结合后，其复和物是不可见的。 为了使得反应复合物可见，必须将抗体加 以标记，并利用标记物同其他物质的反应 将阳性结果转换成可见的发光或 显色。多 年来，免疫组化工作者 经过不断探索，使 得免疫组化的示踪系统和显色系统不断 改进。
S-P法原理示意图 法原理示意图
SABC复合物
生物素化二抗
HRP 生物素 Streptavidin
一抗 抗原 链酶亲和素） （链酶亲和素 链酶亲和素
二步法
1995年一种二步法检测系统（EnVision） 的问世标志着二步法技术的诞生，其原 理是用高分子葡聚糖作为载体将多个二 抗分子和酶结合在一起，代替传统方法 之中的二抗和三抗，使得检测变得异常 简单。同时祛除了因使用生物素而引起 的内源性生物素所造成的背景染色。
S-P法
免疫组化工作者们于20世纪90年代初以 ABC法的基本原理为基础，以链酶亲和 链酶亲和 素（streptavidin,SA）代替亲和素，创建 ） 了S-P法。与亲和素相比，链酶亲和素是 一种更接近完美的生物素结合蛋白。它 的等电点为中性，故不易与组织的内源 性生物素结合。而S-P法由于应接法 原理： 原理：HRP标记在特异性抗体 标记在特异性抗体 （一抗）上，即形成 一抗） 抗原---抗体 复合物” “ 抗原 抗体● HRP复合物” 复合物
直接法原理示意图
酶标一抗
组织抗原 第一抗体
抗原
过氧化物酶
步骤： 步骤：一步完成 特点：方法简便、省时，专一 特点：方法简便、省时， 性强，非特异染色轻， 性强，非特异染色轻， 但敏感性差， 但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。 抗体只能检测一种抗原。
免疫组化的基本原理
概 述
免疫组织化学（简称免疫组化） 免疫组织化学（简称免疫组化）是组织化学的 一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结 一种， 合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗 合的特点， 体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一 体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等， 定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在 定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化， 抗原抗体结合部位确定组织、 抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或 化学性质。 化学性质。
二、间接法 标记在第二抗体上， 原理： 标记在第二抗体上 原理：HRP标记在第二抗体上， 抗原---特异性抗体 第 抗原 特异性抗体---第 特异性抗体 二抗体 HRP复合物 复合物
●
步骤： 步骤：二步法
间接法原理示意图
酶标二抗 一抗 抗原
第二抗体 过氧化物酶 组织抗原 第一抗体
特点：敏感性较直接法高， 特点：敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。 抗体，检测多种抗原。 但较直接法费时， 但较直接法费时，非特 异染色稍重。 异染色稍重。
Avidin（卵白素、亲和素、抗生物素）为 （卵白素、亲和素、抗生物素） 一种碱性糖蛋白， 一种碱性糖蛋白，由四个相同亚基组成 Biotin（生物素）小分子维生素 （生物素） Avidin和Biotin具有较高亲和力 和 具有较高亲和力
酶素化Biotin＋Avidin --- ABC复合物 ＋ 酶素化 复合物 抗原 --- 特异抗体 --- Biotin标记第二抗体 --标记第二抗体 Avidin ● Biotin ● HRP 复合物： 复合物：composition
组织抗原 第一抗体 第二抗体 HRP 生物素 卵白素
ABC法 法
ABC法原理示意图 法原理示意图
ABC复合物 二抗
HRP
一抗 抗原
生物素 亲和素
步骤： 步骤：三步法 特点：敏感性较高，特异性强， 特点：敏感性较高，特异性强， 应用范围广
●
某些脏器存在内源性生物素 干扰
●
Avidin与核酸及细胞膜中磷脂 与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应
酶标抗体技术也还存在一些问题， 最主要的是酶与抗体连接可损害二 者的活性。20 世纪70年代初，发展 了非标记抗体酶法，包括酶桥法 ， PAP法。
三、酶桥法
酶桥法的基本原理是，首先用酶免疫 动物，制备效价高，特异性强的抗酶抗 体，然后利用第二抗体做桥，将抗酶抗 体连接到与组织抗原结合的第一抗体上。 再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示 抗原的分布。
酶桥法
酶 抗酶抗体 组织抗原 二抗 第一抗体 一抗 抗原 第二抗体 第三抗体（抗酶抗体） 第三抗体（抗酶抗体） HRP
特点
优点：提高了敏感性 缺点：游离的酶难以精确的稀释到所需 浓度。非特异性结合的酶也难以洗去， 背景色重。
四、PAP法 四、PAP法
PAP为(peroxidase antiperoxidase)的缩写。 其原理与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连 接在与组织抗原结合的第一抗体上，所不同的 是PAP法是将游离酶和抗酶抗体在使用前先 制 成酶-抗酶抗体复合物（PAP复合物），在染色 过程中将酶桥法的步骤3，4合并为一，用PAP 复合物代替，即用第二抗体作桥，将PAP复合 物连接 在与组织抗原结合的第一抗体上。
组织抗原 第一抗体 过氧化物酶
直接法
附加知识
DAB(Diaminobenzidine)，二氨基联苯胺是辣根过氧化物酶最敏感、 最常用的显色底物，反应产物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉 淀物而被广泛地用于蛋白印迹（Western Blot,WB)、免疫组织化学 (Immunohistochemistry,IHC)和免疫细胞化学 (Immunocytochemistry,ICC)、斑点印迹(Dot blot)和生物芯片 (Biochip)等的染色和显色反应。 注意事项 1． DAB溶液应低温密封保存。如有结晶析出，应确保结晶 完全溶解再行使用； 2． 显色工作液应现用现配，新鲜配制的工作液应为无色或 浅棕色，如颜色过深，请勿使用； 3． DAB在常温下不稳定，每次取用后均应及时加盖密封放 回冰箱，以免因DAB分解影响实验，或因渗漏造成实验环境污染； 4． DAB有潜在致突变作用，操作时应注意穿戴好防护用具。