细胞骨架(cytoskeleton)

核基质概论

细胞核骨架是存在于真核细胞核内的以蛋白成分为主的纤维网架体系。目前对核骨架的概念有两种理解，狭义的核骨架仅指核内基质(inner nuclear matrix，inner nuclearskeleton)，即细胞核内除核膜、核纤层、染色质、核仁和核孔复合体以外的以纤维蛋白成分为主的纤维网架体系；广义的核骨架包括核基质、核纤层和核孔复合体。

长期以来，对细胞核的研究主要集中于染色质，核仁和核膜，尤其是注重对DNA、RNA、组蛋白和核酸酶的研究。核骨架曾长期被人们所忽视，直到70年代中期，Berezney和Coffey等(1974)才首次将核骨架(nuclear matrix)作为细胞核内独立的结构体系进行研究，用非离子去垢剂、核酸酶与高盐缓冲液对大鼠肝细胞进行处理，当核膜、染色质与核仁被抽提后，发现核内仍存留有一个以纤维蛋白成分为主的网架结构。此后，真核细胞中核骨架的客观存在相继为其他实验室所证实，并发现核骨架与DNA复制、RNA转录和加工、染色体组装及病毒复制等一些重要的生命活动有关(图9-26)。

(一)形态结构

近年来，核骨架的研究取得很大进展，成为细胞生物学研究的一个新的生长点。细胞核内物质密度较大，且有大量染色质纤维，直接在原位研究核骨架的形态结构及成分相当困难。在核骨架研究中，一般首先分离核骨架，然后研究其结构成分及功能。最早是Coffey等用非离子去垢剂、核酸酶与高盐缓冲液(2mol／L NaCl)处理细胞核，分离核骨架。值得一提的是Penman等建立的细胞分级抽提方法。先用非离子去垢剂处理细胞，溶解膜结构系统，胞质中可溶性成分随之流失，主要存留细胞骨架体系。再用Tween 40和脱氧胆酸钠处理，胞质中的微管、微丝与一些蛋白结构被溶去，胞质中只有中间纤维网能完好存留。然后用核酸酶与0.25mol／L硫酸铵处理，染色质中DNA、RNA和组蛋白被抽提，最终核内呈现一个精细发达的核骨架网络，结合非树脂包埋-去包埋剂电镜制样方法，可清晰地显示核骨架-核纤层-中间纤维结构体系。此后，又有更接近于生理条件的核骨架制备方法出现，如用3，5-二碘水杨酸锂(LIS)处理细胞核来分离核骨架。

核骨架的形态结构根据不同报道有所差异，Berezney与Coffey(1974)等采用高盐溶液2mol／L NaCl处理，在核内显示一个以纤维蛋白成分为主的核基质(nuclear matrix)；Pen-man等采用比较温和的细胞分级抽提方法，在核内显示出精细发达的核骨架纤维网络，核骨架纤维直径为3～30nm，估计单丝直径约3～4nm，粗纤维可能是单纤维的复合体；也有报道认为核骨架核心纤维(core filament)的直径为9nm。核仁与染色质网络于核骨架纤维网络中，核内骨架与核纤层有丰富的纤维联络，构成统一的核骨架网络(图9－27)。

(二)成分

核骨架的成分比较复杂，主要成分是纤维蛋白，并含有少量RNA。RNA的含量虽然很少，但它对于维持核骨架三维网络结构的完整性是必要的。分离的核骨架中常含有少量DNA，一般认为这是一种功能性结合。核骨架不象胞质骨架，诸如微丝、微管和中间纤维那样，由非常专一的蛋白成分组成，不同类型细胞核骨架成分可能有较大差别，目前已测定的核骨架蛋白有数十种，这些蛋白可以分为两类：一类是各种类型的细胞共有的；另一类则与细胞类型及分化程度相关。目前关于核骨架蛋白的确切组分尚未取得共识，这也是核骨架研究中争议较多之处。分离鉴定功能性的核骨架蛋白是目前核骨架研究一个重要领域，比较确定的成分有：(1)DNA拓扑异构酶Ⅱ：是间期细胞核骨架和分裂期染色体骨架的重要成分之一；(2)nuclearmatrin：有matrinD，E，F，G和4等，定位于核基质，且呈现纤维颗粒样分布，很可能是核基质上DNA-loop的结合蛋白；

(3)Nuc2+蛋白：Nuc2+蛋白是S．pombe(一种酿酒用的酵母)的Nuc2+基因编码的蛋白，分子量为76kD。Nuc2+基因在有丝分裂染色体分离过程中起重要作用，Nuc2+蛋白存在于核基质以及染色体骨架(chromosome scaffold)组分当中，而且与富含AT的DNA序列有特异的亲和性；

(4)ARBP(attachment region binding protein)能够特异地与MA R序列结合，而且在各种组织中广泛

存在，不具有组织特异性；(5)核内肌动蛋白(actin)，肌动蛋白不仅存在于核基质组分中，而且很可能在mRNA的合成过程中起重要的作用。

(三)核基质结合蛋白

核基质的功能不仅仅依靠核基质本身的蛋白质完成，更重要的是要通过多种核基质结合蛋白的共同参与，完成核基质复杂多样的生物学功能。长期以来人们对此进行了大量的研究并证实一些与DNA、RNA代谢合成密切相关的酶类，细胞信号识别和细胞周期的调控因子以及病毒特异的调控蛋白等能够紧密结合在核骨架结构上。近年来已证实的核基质结合蛋白见表9-5。

(四)功能

早在70年代，人们即已能在分子水平上对DNA进行操作，但对如此长的DNA分子在细胞核这样小的空间内如何折叠组装知之甚少。核骨架的研究使人们对细胞核的结构组装有了新的认识。一般认为，核骨架为细胞核内组分提供了一个结构支架，细胞核内许多重要的生命活动与核骨架有关。

1．核骨架与DNA复制

Jacob等(1963)就曾设想真核细胞中DNA复制可能需要一个结构支架(structure frame-work)，原核细胞的DNA复制是结合在细胞膜上进行的。在真核细胞中是否存在类似的支撑结构？DNA的

复制是否结合在核膜上进行？研究表明真核细胞中DNA复制与核膜没有直接的关系，更无专一的结合位点。70年代中期，染色质结构的研究取得了突破性进展，核小体作为染色体基本结构单位的发现具有十分重要的意义，但并没有回答真核细胞中DNA复制和基因表达的空间支架是什么这样一个很重要的问题。

以往研究体外DNA复制时，大多将细胞中不溶性物质去除，在可溶性上清中研究DNA复制，似乎DNA复制是在可溶性反应系统中完成的。最初的DNA复制模式认为，可溶性的DNA多聚酶结合于DNA复制起始点(origin)后沿模板移动合成新DNA。实际上，高度纯化的DNA在进行体外复制时，效率极低，复制错误多。而在粗提物中，如非洲爪蟾卵提取物无细胞系统(Xenopus egg extracts cell free system)中(含骨架组分)，DNA复制效率很高。说明DNA的复制的确需要一个结构支架。

如果DNA多聚酶沿模板移动合成新DNA，则可以设想DNA复制点(replication site)是随机分布于细胞核内的，实验表明DNA合成部位在细胞核内不是随机分布的，而是相对集中于某些部位，如精子核中有100～300个复制灶(replication foci)，每个复制灶中至少有300～1000个复制叉(replication fork)，很难想象非锚定的DNA多聚酶能在时间和空间上如此集中协调一致，说明DNA多聚酶是通过结合于某结构支架上来实现的。

Berezney和Coffey以小鼠再生肝细胞为材料，显示新合成的DNA结合在核内蛋白基质网上。3H-TdR标记30分钟的3T3细胞中，与核骨架结合的DNA中90％是新合成的DNA，并证明这种结合并非提取过程中产生的非专一性结合；电镜放射自显影进一步表明DNA复制位点结合在核骨架上。

研究发现DNA放射环(loop)普遍存在于间期细胞核和分裂期染色体中，放射环的根部结合在骨架纤维上，DNA以放射环的形式与DNA复制的酶及因子锚定于核骨架上形成DNA复制复合体(DNA replication complex)进行DNA复制合成。核骨架可能是DNA复制的空间支架。Berezney 和Buchholtz(1981)推测大鼠肝细胞核内有125000个DNA复制环锚定在核骨架上，每个环的长度为80kb，DNA复制子亚单位的复制具有固定的空间组织序列。

有令人信服的证据表明，真核细胞中的DNA多聚酶结合于核骨架上，DNA聚合酶在核骨架上可能具有特定的结合位点，DNA聚合酶通过结合于核骨架上而被激活；DNA复制时，DNA就象是从一个固定的复制复合体中释放出来的(图9－28)。

2．核骨架与基因表达

核骨架与基因表达的关系大致可分为两类，一是核骨架与基因转录活性的关系；二是核骨架与RNA加工修饰的关系。大量研究工作表明真核细胞中RNA的转录和加工均与核骨架有关。