细菌染色和涂片观察的方法

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5、 脱色：
脱色：是使被染物脱去已染上的颜色。脱色的目 的是观察细菌与染料结合的稳定程度，故可作为 鉴别染色之用。
凡具有脱色作用的化学试剂称脱色剂。脱色剂或 呈溶媒作用，如醇类、丙酮等；或能影响蛋白质 的电离程度，改变其电荷性质或数量，因而影响 细菌与染料的结合程度，如酸类能减少细菌的负 电荷，故可作碱性染料的脱色剂。
细菌的染色和涂片观察
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第一节 不染色标本检查法
所谓不染色标本检查法是将细菌标本不经 染色直接镜检，从而观察生活状态下细菌 的形态及运动状况的一种检查方法。这种 检查方法虽可看到细菌的大致轮廓，但主 要用于观察细菌的动力。
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一、不染色标本检查法的具体方法
1 、压滴法 2、悬滴法 3、毛细管法
革兰氏阳性葡萄球菌例子 (金黄 色葡萄球菌 x 1000)
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革兰氏阳性链球菌例子
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革兰氏阴性杆菌例子 (大肠杆菌
x 1000)
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革兰氏阴性弧菌例子
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革兰氏阳性产芽孢杆菌例子
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革兰氏阳性短杆菌例子 (李斯特 菌 x 1000)
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革兰氏阴性弯曲菌例子
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3、 媒染：
媒染的目的是增加染料和被染物的亲和力。凡使 染料固定于被染物；或引起细胞膜通透性改变的 物质统称为媒染剂。常用的媒染剂有明矾、苦味 酸、金属盐、碘等。也可用加热法媒染。媒染剂 可用于固定之后，亦可含于固定液或染液中，也 可在初染之后复染之前进行。
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4、 染色：
随目的而选用适宜的染液。染色时，滴加 染液以覆盖涂面为度，染色时间随方法而 定。单染法只用一种染料如吕氏美兰、稀 释石炭酸复红等；而多数染色法需用第二 种染液进行复染。
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6、 复染：
已经脱色处理的细胞或其结构常以复染液作复染 以便于观察。复染液与初染液的颜色不同而成鲜 明对比，所以复染也称为对比染色。复染液不宜 太强，以免掩盖初染的颜色而失去对比作用。
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常用染色法
细菌的常用染色法有：单染色法、复染色 法、特殊结构染色法、负染色法以及荧光 染色法等。
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2、 固定：
染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和 其它细胞结构成分而杀死细菌；使菌体粘附于玻 片上以及改变细菌对染料的通透性（因活菌通常 不易使染料透入细胞内）。
固定的方法一般采用火焰加热法，在特殊目 的时也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化 高汞、重金属盐或氧化剂等进行固定。
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1、 革兰氏染色法（Gram’s Stain）
是最常用的鉴别染色法之一。此染色法是 由丹麦细菌学家 Christian Gram氏于1882 ～1884年发明的，至今已逾百年，仍在广 泛使用，是细菌学中最为经典的染色方法 。
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（1）、革兰氏染色的方法：
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固定—→初染—→媒染—→脱色
②、了解细菌与致病性的关系：大多数GP 菌的致病物质主要为外毒素；而大多数GN 菌的致病物质主要为内毒素。通过革兰氏 染色，可了解细菌的致病物质，从而做出 相应的治疗对策。
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③、选择抗菌药物：GP菌和GN菌在细胞壁等 结构上有很大差别，因而对抗菌药物的敏感 性不同。如大多数GP菌对青霉素、红霉素、 头孢菌素等敏感；而大多数GN菌对这几种抗 生素不敏感，但对链霉素、氯霉素、庆大霉 素、卡那霉素等敏感，故临床上可根据病原 菌的革兰氏染色性，选择有效的药物进行治 疗。
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（一）、单染色法：
单染色法是指用一种染料进行染色的方法 。如用美兰或稀释石炭酸复红等，使各种 细菌均染成同一种单一的颜色。故此法只 能显示细菌的形态及大小，对细菌的鉴别 价值不大。
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（二）、复染色法：
复染色法是用二种以上染料进行染色的方 法。此法除显示细菌的形态、大小外，还 有鉴别细菌种类的价值，因此也称鉴别染 色法。常用的鉴别染色法有革兰氏染色法 及抗酸染色法。
菌龄：菌龄也能影响染色的结果，这和细菌生长 过程中核酸含量的改变有关。例如本是革兰氏阳 性的老龄菌，因核酸减少则常有许多菌细胞变为 革兰氏阴性。
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革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖含量较多，脂类较少， 与95%酒精接触后可迅速导致细胞壁脱水，通透性 降低，使在细菌细胞内着色的染料——结晶紫与碘
的复合物不易透出，所以保留了紫色。而革兰氏阴 性菌细胞壁含肽聚糖较少、脂类较多，与95%酒精
（结晶紫或龙胆紫）
（ 卢戈氏碘液）
（95%酒精）
—→复 染 （稀释复红）
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固定 初染 媒染 脱色 复染
革兰氏阳性菌，用符号“G+”或“GP” （Gram’s Positive）表示。
革兰氏阴性菌，用符号“G¯”或“GN”（ Gram’s Negative）表示。
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第二节 染色标本检查法
所谓染色标本检查法是用特殊的手段对细 菌进行染色，而后再检查其形态、大小、 排列方式、染色反应以及特殊结构的一种 检查方法,有助于细菌的初步识别或诊断。
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细菌染色的一般程序
细菌染色的基本程序是： 涂片 → 固定 → （媒染）→ 染色
→ （脱色）→（复染）
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1、 涂片制备：
随标本的种类而略有不同。一般临床标本大多可 直接涂抹于洁净载玻片上；培养的细菌，若为液 体培养液，亦可直接涂于载玻片上；若为固体培 养基上的细菌，则先取一接种环生理盐水于载玻 片中央，然后从培养基上取菌少许，在盐水中研 磨均匀，使呈轻度乳浊，以接种环扩成1cm2或2 份硬币大小的涂面，在室温下自然干燥或放在火 焰上方的热空气中慢慢烘干。但切忌紧靠火焰烤 干。
接触后肽聚糖脱水不明显，而脂类被酒精溶解后使 细胞壁通透性增加，酒精易透入菌体内溶解染料— —碘复合物并使其透出，因而使紫色被洗脱后又被 染成红色。
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3）、革兰氏染色法的临床意义
①、鉴别细菌：该染色法可将细菌分为GP 菌与GN菌两大类，这样可以初步识别细菌 、缩小范围，便于进一步鉴定。
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革兰氏阳性棒状杆菌例子
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革兰氏染色的结果与培养基成分、培养条件、操 作技术及菌龄等有密切的关系。
培养基成分：在缺乏镁盐的培养基中，革兰氏阳 性菌可变为革兰氏阴性菌。 培养条件：在酸性环境中细菌带正电荷。
操作技术：如涂片太厚影响酒精脱色，革兰氏阴 性菌则可染成革兰氏阳性菌；脱色时倘酒精作用 时间太长，革兰氏阳性菌又会染成革兰氏阴性菌。