实验细菌的简单染色和革兰氏染色
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2020/9/20
（二）革兰氏染色基 本原理
革兰氏染色是用于细菌鉴别的一种重要染色方法。它是 根据革兰氏阳性细菌、阴性细菌细胞壁结构、组成的不同而 使用一系列的染色处理使之差别显色。其染色方法是先将细 菌分别用结晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脱色，再经复染剂 复染。最终被染成红色的是革兰氏阴性细菌；被染成紫色的 是革兰氏阳性细菌。
七 思考题
1 细菌简单染色操作过程中应注意哪些事项？ 2 如果对一未知菌进行革兰氏染色，如何能确证染色 结果正确可靠？ 3 为什么说95%酒精脱色是革兰氏染色的关键步骤？
下次实验内容：
实验四 微生物细胞大小的测定及显微镜下直接计数
2020/9/20
1 涂片：方法同单染色，然后干燥、固定。
2 初染：滴加结晶紫染色1min，后用水冲洗。 3 媒染：滴加碘液染色1---2min，后用水冲洗，甩尽残余水 4 脱色：用95%乙醇冲洗30秒（需要严格控制时间和浓度），
然后立即用水冲洗。 5 复染：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行复染，蕃红染
2---3min，如果石炭酸复红染1min。水洗，晾干。 6 镜检：先用低倍镜观察，后用油镜观察
细胞的结构
一 般 结 构 ： 一 般 细 菌 都 有 的 构 造2020/9/20
一特 般殊 细结 菌构 在： 特部 殊分 环细 境菌 下具 才有 有的 的或
革兰氏染色 C.Gram（革兰）于1884 年发明的一种鉴别不同类 型细菌的染色方法。
2020/9/20
◆用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染
◆用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。
◆用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后 仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细 菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细 胞呈无色。
◆用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对 涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的 革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革 兰氏阳性细菌继续保持深紫色
作步骤
1 涂片：载玻片、无菌水、斜面菌种、无菌操作、均匀的薄层 2 干燥： 3 固定：加热固定 4 染色：结晶紫染1min或蕃红染2-3min或石炭酸复红染1min。 5 水洗： 6 干燥： 7 镜检：低倍镜观察以确定目标和范围，再换用油镜观察绘图。
2020/9/20
2020/9/20
（二）革兰氏染色操作 步骤
2020/9/20
1
2
？
3
4
2020/9/20
三 实验材 料
大肠杆菌（24 h 培养）斜面菌种 枯草杆菌（16 h 培养）斜面菌种
2020/9/20
四 无菌操作过 程
无菌操作：不让除我们接种的微生物以外
其它微生物侵入的技术。
2020/9/20
2020/9/20
五 操作步 （一） 简骤单染色操
2 学习并掌握无菌操作的技术。 3 掌握简单染色\革兰氏染色的方法，并能正确染色 4 巩固显微镜油镜的使用方法。
2020/9/20
2020/9/20
（一）细菌的简单染色原理
细菌细胞微小，且含水量较多，在普通光镜下表现为无色透明，不易观察， 所以必须进行染色处理，使细胞着色，便于观察。 简单染色是使用单一染料染色，可用于观察细菌形态、大小、及排列方式. 染色前一般要将细胞固定，其目的是杀死菌体并使之粘附于玻片上，还可 以增强菌体的着色能力。固定有加热法和化学法两种，无论采用何种方法均 应维持细胞原有形态。
2020/9/20
2020/9/20
1
阳性菌
2
3
阴性菌
4
六 实验报 告
1 写出实验目的 2 写出简单染色、革兰氏染色的基本原理 3 根据实验结果绘出简单染色和革兰氏染色的结果图。
2020/9/20
菌名： 放大倍数： 细菌简单染色结果图
2020/9/20
放大倍数： 细菌革兰氏染色结果图 要求： 标出菌名、颜色、阳性或阴性菌
革 兰 氏 阴 性 细 菌
含 量 很 高 （ 50~90）
含 量 很 低 （ ~10）
含 量 较 高 （ ＜ 50）
无
一 般 无 （ ＜ 2）
含 量 较 高 （ ~20）
无
含 量 较 高
2020/9/20
❖革兰氏染色原理：
第一步：结晶紫使菌体着上紫色 第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻 留在细胞内。 第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。 G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时， 肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内， 细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因 其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细 胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。
2020/9/20
占细胞壁的90%Leabharlann Baidu
占细胞壁的10%
2020/9/20
2020/9/20
革兰氏阳性细菌的细胞壁
1、细胞壁
2020/9/20
成 分
肽 聚 糖 磷 壁 酸 类 脂 质 蛋 白 质
革兰氏阳革性兰\氏阴染性色细与菌细的胞细壁胞：壁对比
占 细 胞 壁 干 重 的 %
革 兰 氏 阳 性 细 菌
2020/9/20
2020/9/20
实验三 细菌的简单染色和 革兰氏染色
2020/9/20
细菌的简单染色和革兰氏染色
• 一 目的要求 • 二 基本原理 • 三 实验材料 • 四 无菌操作过程 • 五 操作步骤 • 六 实验报告 • 七 思考题
2020/9/20
一 目的要 求
1 学习制染色片技术，学习简单染色\革兰氏染色原理， 理解着色机理。
（二）革兰氏染色基 本原理
革兰氏染色是用于细菌鉴别的一种重要染色方法。它是 根据革兰氏阳性细菌、阴性细菌细胞壁结构、组成的不同而 使用一系列的染色处理使之差别显色。其染色方法是先将细 菌分别用结晶紫和碘液初染媒染后，乙醇脱色，再经复染剂 复染。最终被染成红色的是革兰氏阴性细菌；被染成紫色的 是革兰氏阳性细菌。
七 思考题
1 细菌简单染色操作过程中应注意哪些事项？ 2 如果对一未知菌进行革兰氏染色，如何能确证染色 结果正确可靠？ 3 为什么说95%酒精脱色是革兰氏染色的关键步骤？
下次实验内容：
实验四 微生物细胞大小的测定及显微镜下直接计数
2020/9/20
1 涂片：方法同单染色，然后干燥、固定。
2 初染：滴加结晶紫染色1min，后用水冲洗。 3 媒染：滴加碘液染色1---2min，后用水冲洗，甩尽残余水 4 脱色：用95%乙醇冲洗30秒（需要严格控制时间和浓度），
然后立即用水冲洗。 5 复染：用蕃红或石炭酸复红覆盖涂片进行复染，蕃红染
2---3min，如果石炭酸复红染1min。水洗，晾干。 6 镜检：先用低倍镜观察，后用油镜观察
细胞的结构
一 般 结 构 ： 一 般 细 菌 都 有 的 构 造2020/9/20
一特 般殊 细结 菌构 在： 特部 殊分 环细 境菌 下具 才有 有的 的或
革兰氏染色 C.Gram（革兰）于1884 年发明的一种鉴别不同类 型细菌的染色方法。
2020/9/20
◆用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染
◆用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。
◆用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后 仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细 菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细 胞呈无色。
◆用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对 涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的 革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革 兰氏阳性细菌继续保持深紫色
作步骤
1 涂片：载玻片、无菌水、斜面菌种、无菌操作、均匀的薄层 2 干燥： 3 固定：加热固定 4 染色：结晶紫染1min或蕃红染2-3min或石炭酸复红染1min。 5 水洗： 6 干燥： 7 镜检：低倍镜观察以确定目标和范围，再换用油镜观察绘图。
2020/9/20
2020/9/20
（二）革兰氏染色操作 步骤
2020/9/20
1
2
？
3
4
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三 实验材 料
大肠杆菌（24 h 培养）斜面菌种 枯草杆菌（16 h 培养）斜面菌种
2020/9/20
四 无菌操作过 程
无菌操作：不让除我们接种的微生物以外
其它微生物侵入的技术。
2020/9/20
2020/9/20
五 操作步 （一） 简骤单染色操
2 学习并掌握无菌操作的技术。 3 掌握简单染色\革兰氏染色的方法，并能正确染色 4 巩固显微镜油镜的使用方法。
2020/9/20
2020/9/20
（一）细菌的简单染色原理
细菌细胞微小，且含水量较多，在普通光镜下表现为无色透明，不易观察， 所以必须进行染色处理，使细胞着色，便于观察。 简单染色是使用单一染料染色，可用于观察细菌形态、大小、及排列方式. 染色前一般要将细胞固定，其目的是杀死菌体并使之粘附于玻片上，还可 以增强菌体的着色能力。固定有加热法和化学法两种，无论采用何种方法均 应维持细胞原有形态。
2020/9/20
2020/9/20
1
阳性菌
2
3
阴性菌
4
六 实验报 告
1 写出实验目的 2 写出简单染色、革兰氏染色的基本原理 3 根据实验结果绘出简单染色和革兰氏染色的结果图。
2020/9/20
菌名： 放大倍数： 细菌简单染色结果图
2020/9/20
放大倍数： 细菌革兰氏染色结果图 要求： 标出菌名、颜色、阳性或阴性菌
革 兰 氏 阴 性 细 菌
含 量 很 高 （ 50~90）
含 量 很 低 （ ~10）
含 量 较 高 （ ＜ 50）
无
一 般 无 （ ＜ 2）
含 量 较 高 （ ~20）
无
含 量 较 高
2020/9/20
❖革兰氏染色原理：
第一步：结晶紫使菌体着上紫色 第二步：碘和结晶紫形成大分子复合物，分子大，能被细胞壁阻 留在细胞内。 第三步：酒精脱色，细胞壁成分和构造不同，出现不同的反应。 G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时， 肽聚糖因脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内， 细胞不能被酒精脱色，仍呈紫色。 Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因 其含脂量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细 胞壁，酒精将细胞脱色，细胞无色，蕃红复染后呈红色。
2020/9/20
占细胞壁的90%Leabharlann Baidu
占细胞壁的10%
2020/9/20
2020/9/20
革兰氏阳性细菌的细胞壁
1、细胞壁
2020/9/20
成 分
肽 聚 糖 磷 壁 酸 类 脂 质 蛋 白 质
革兰氏阳革性兰\氏阴染性色细与菌细的胞细壁胞：壁对比
占 细 胞 壁 干 重 的 %
革 兰 氏 阳 性 细 菌
2020/9/20
2020/9/20
实验三 细菌的简单染色和 革兰氏染色
2020/9/20
细菌的简单染色和革兰氏染色
• 一 目的要求 • 二 基本原理 • 三 实验材料 • 四 无菌操作过程 • 五 操作步骤 • 六 实验报告 • 七 思考题
2020/9/20
一 目的要 求
1 学习制染色片技术，学习简单染色\革兰氏染色原理， 理解着色机理。