实验二--显微镜油镜的使用及细菌的简单染色法1
细菌的简单染色和革兰染色实验报告
实验二：细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法。
2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。
3.巩固显微镜油镜的使用方法。
4.学习无菌操作技术。
二、实验原理1、染色原理：细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。
2、革兰染色法原理：革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。
如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验仪器，材料和用具1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S33、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液四、实验步骤（1）简单染色1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。
2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。
3、干燥：涂片后待其自然干燥。
4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。
5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。
微生物学实验教程
微生物学实验内容实验一 . 显微镜的使用及细菌的简单染色实验二 . 细菌的革兰氏染色实验三 . 酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别实验四 . 酵母菌的数量测定实验五 . 酵母菌的大小测定实验六 . 微生物菌落的观察实验实验七 . 霉菌的形态观察实验八 . 培养基的制备与灭菌实验九 . 放线菌的形态及菌落特征的观察实验十 . 微生物的纯种分离培养实验一 . 普通光学显微镜的使用一、目的要求1. 学习并掌握油镜的原理和使用方法。
2. 复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
二 . 显微镜的基本结构及油镜的工作原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。
它们由机械装置和光学系统两大部分组成。
在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。
而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。
与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，这主要有如下二方面的原因：1. 增加照明亮度油镜的放大倍数可达 100Χ，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。
从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。
所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的油镜（通常用香柏游，其折射率 n=1.52）。
2. 增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力 (resolution or resolving power) 是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。
从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：（公式 P16 ）式中λ= 光波波长；NA=物镜的数值孔径值。
光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（ 0.4--0.7μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为： NA=n × sin α式中α为光线最大入射角的半数。
油镜的使用与简单染色法
实验一油镜的使用、简单染色法一、实验目的1、复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。
2、掌握细菌简单染色及无菌操作技术。
二、实验原理（一）普通光学显微镜的构造普通光学显微镜包括机械部分和光学部分两部分。
机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。
光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。
（二）油浸系的原理浸系是在油浸镜与标本之间加1滴香柏油，调整光源检查细菌标本的方法。
油浸镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95x、100x等。
其镜头标记国产镜多用“油”字表示，国外产品则用“Oil”（Oil Immersion）或HI （homogeneous Immersion）表示。
而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一种标志。
其使用原理是：由于香柏油与玻璃的折光率相似（香柏油为1.515，玻璃为1.52）。
镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气（折光率为1.0）而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰（见下图）。
图介质为空气（A）与介质为香柏油（B）时光线通过的比较（三）细菌简单染色细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。
利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
实验二、细菌的简单染色与革兰氏染色
2、掌握好乙醇脱色时间。ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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葡萄球菌
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杆菌
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五、实验数据及处理结果
1、根据油镜观察结果，绘出普通变形杆菌和表皮 葡萄球菌的简单染色形态图。 2、列表简述普通变形杆菌和表皮葡萄球菌的革兰 氏染色油镜观察结果（菌的形态、颜色、革兰氏染 色反应）。
G-菌：细胞壁薄，肽聚糖含量低，类脂含量高，肽聚糖 分子交松散，故经乙醇处理后，壁会出现较大的缝隙， 细胞透性增大，结晶紫－碘复合物易被洗脱出来，再经 番红复染后使细胞显红色。
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三、实验器材
1、菌种：普通变形杆菌、表皮葡萄球菌 2、染色剂：简单染色液(吕氏碱性美蓝染液)；革兰氏 染色液（草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、 番红染液） 3、仪器或其他用具：载玻片、生理盐水、酒精灯、接 种环、香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸、滤纸等
细菌产酸使培养基pH下降时，细菌带正电荷增
加，可采用酸性染料。酸性染料有：伊红、酸性复
红、刚果红等。
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2、革兰氏染色
革兰氏染色是采用二种染料对细菌细胞进行染色， 初染采用的是结晶紫，复染采用的是番红。
G＋菌：细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，基本不含类脂， 肽聚糖分子交联度较紧密，故经乙醇处理后，肽聚糖网 孔因脱水而明显收缩，使壁的通透性降低保留着结晶紫 －碘复合物，所以复染液番红不能进入,细胞显紫色。
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四、操作步骤
1、简单染色
涂片
加热干燥固定
染色 1min 水洗
干燥
镜检
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
实验二细菌的观察
细菌一般形态染色观察一、实验目的学习了解微生物染色的基本原理与方法学习掌握细菌的简单染色和革兰氏鉴别染色技术巩固显微镜油镜的使用方法。
二、实验原理细菌的个体极微小，无色透明，必须借助于染色法，使细菌（或背景）着色，与背景（或菌体）形成明显的对比便于在显微镜下观察细菌的形态构造。
染色方法主要有：见下图简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用染料有：碱性染料：结晶紫、碱性复红、龙胆紫、番红、中性红、孔雀绿等。
酸性染料：酸性复红、刚果红、曙红等简单染色一般常用碱性染料进行染色原因：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，带正电荷，因此碱性染料很容易与细菌结合使细菌着色细菌细胞壁含有蛋白质或多肽，也就有等电点已知细菌的等电点pH为2～5。
革兰氏阳性菌为2～3，革兰氏阴性菌为4～5。
当细菌的培养液pH值大于等电点时，细菌带有负电荷；反之，带有正电荷。
一般，细菌的培养、染色、试验过程均在偏碱性（7～7.5）、中性、偏酸性（6～7）条件下，都高于细菌的等电点，故均带有负电荷革兰氏染色革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，根据细菌对这种染色反应的不同，可分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两大类，其机理是由于细菌细胞壁的化学组成及结构不同和通透性不同的缘故。
革兰氏染色对于细菌的分类、鉴定及食品卫生检测都有重要意义。
革兰氏染色原理影响革兰氏染色结果的因素菌龄培养基pH值染色技术：涂片质量、染色时间、脱色时间、染色脱色均匀度等三、实验器材1. 器材：显微镜，擦镜纸，二甲苯，香柏油，载玻片，接种环，酒精灯,火柴，吸水纸，无菌牙签。
2. 染色液及试剂：石碳酸复红染液、碱性美蓝染液、结晶紫染色液，路戈氏碘液，95％的酒精，蕃红染色液，黑色素水溶液，蒸馏水。
3. 菌种：白葡萄球菌、大肠杆菌的新鲜斜面菌种各1支。
四、操作步骤（一）简单染色涂片火焰固定染色水洗干燥镜检（二）革兰氏染色涂片→干燥→火焰固定结晶紫染色→水洗碘液媒染95%酒精脱色→水洗蕃红复染→水洗干燥镜检（三）口腔中微生物观察负染色五、实验报告1、实验结果绘图2、思考题（1）细菌制片过程应注意哪些？（2）试分析菌龄、培养pH、染色技术对革兰氏染色结果的影响。
实验二普通显微镜的使用及细菌的简单染色法
实验二普通显微镜的使用及细菌的简单染色法一、实验目的1.学习并掌握油镜的原理和实使用方法。
2.复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
二、实验原理（一）.普通显微镜普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。
它们由机械装置和光学系统两大部分组成。
在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。
而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大。
使用油镜时，需在载玻片与镜头之间加滴油，原因：1.增加照明亮度。
2.增加显微镜的分辨率。
（二）.简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
它适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带有负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更容易于识别。
常用做染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
三、实验器材1.菌种细菌营养琼脂平板培养物。
2.染色剂结晶紫染液。
3.仪器或其他用具显微镜，酒精灯，接种环，擦镜纸，生理盐水等。
四、操作步骤1.涂片取两块载玻片，各滴一滴生理盐水于玻片中央，用接环以无菌操作从细菌平板上挑取少许菌体于水滴中，混匀并涂成薄膜。
2.干燥室温自然干燥。
3.固定涂面朝上，通过火焰2~3次。
此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
4.染色将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上。
5.水洗倒去染液，用自来水冲洗，直至图片上流下的水无色为止。
6.干燥自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。
7.镜检涂片干燥后镜检。
（1）在低倍镜下观察。
（2）在高倍镜下观察。
（3）在油镜下观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。
油镜的使用及细菌、真菌基本形态观察实验报告
实验二油镜的使用及细菌、真菌基本形态观察[实验目的]1、了解光学显微镜的简单构造原理、使用方法和保护要点。
熟练掌握油镜的使用方法。
2、认识细菌的基本形态和构造。
通过细菌标本片观察，进一步熟悉使用光学显微镜。
3、掌握真菌的分离培养方法，认识真菌的基本形态结构。
[实验原理]一、微生物个体微小，肉眼难以看见，必须借助显微镜才能观察到其个体形态及内部结构。
因此，显微镜是微生物学研究必不可少的工具，正是显微镜的发明使人类揭开了微生物世界的奥秘。
随着科学技术的进步及微生物研究的需要，显微镜从使用可见光源的普通光学显微镜发展到使用紫外线光源的荧光显微镜，进一步发展到用电子流代替照明光源的电子显微镜，使放大率和分辨率大大提高，为微生物学的发展提供了保障。
此外，根据不同的用途还有暗视野、相差显微镜等。
普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成。
机械系统包括有：镜座、载物台、镜臂、镜筒、物镜转换器、调节器；光学部分包括有目镜、物镜、聚光器、反光镜。
有些较好的显微镜自身带有照明装置。
在检查细菌标本，多用油镜进行。
油镜是一种放大倍数较高(95～l00倍)的物镜，一般都刻有放大倍数(如95×、100×等)和特别的标记，以便于认识。
国产镜多用油字表示，国外产品则常用“Oil”(Oil Immersion)或“HI”(Homogeneous Immersion)作记号。
油镜上也常漆有黑环或红环，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一个标志。
二、油镜的原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光量亦较少，其视野较高倍镜暗。
当油镜头与载玻片之间为空气所隔时，因为空气的折光指数与玻璃不同，故有一部分光线被折射而不能进入镜头之内，使视野更暗；若在镜头与载玻片之间放上与玻璃的折光指数相近的油类，如柏木油等，则光线不会因折射而损失太大，可使视野充分照明，能清楚地进行观察和检查。
三、油镜的使用方法：进行油镜检查时，应先对好光线，但不可直对阳光，采取最强亮度(升高集光器，开大光圈，调好反光镜等)。
实验二 显微镜的使用及细菌革兰氏染色
实验二显微镜的使用细菌染色及革兰氏染色一、实验目的1、学习显微镜（油镜）的构造及使用2、学习微生物涂片、染色等基本技术3、认识细菌形态4、了解革兰氏染色的原理，掌握革兰氏染色法二、实验原理1、光学显微镜的基本原理（1）基本原理显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，但减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。
要增加数值口径，可以提高介质折射率，香柏油的折射率为 1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。
显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
（2）油镜是微生物学使用的显微镜的物镜中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与物镜之间隔是一层油脂，称为“油浸系”。
利用油镜的目的是增加显微镜的分辨力。
2、简单染色的原理利用单一染料对菌体进行染色的方法叫做简单染色。
常用碱性染料进行简单染色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
3、革兰氏染色的基本原理经此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；细胞中初染剂被脱色剂洗脱而染上复染剂的颜色（红色）的细菌为革兰氏阴性菌。
1）G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。
呈紫色。
2）Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。
三、实验器材金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，光学显微镜香柏油(cedar oil)，碘液，结晶紫，番红，酒精等四﹑实验内容1、单染色：（1）洗片：用清水和去污粉将载玻片清洗干净。
精华资料实验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色
精华资料实验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色实验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色普通光学显微镜的使用一、实验目的以染色玻片及活菌为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。
二、显微镜油镜使用的原理1 普通光学显微镜的基本构造(1)光学部分: 接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。
它使检视物放大, 造成物象。
(2)机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。
它起着支持、调节、固定等作用。
2 显微镜的放大倍数和分辨率(1)放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数(2)显微镜的分辨率:表示显微镜辨析物体(两端)两点之间距离的能力，可用公式表示为:D=λ/2n?sin(α/2 )式中D:物镜分辨出物体两点间的最短距离。
λ:可见光的波长(平均0.55μm)n: 物镜和被检标本间介质的折射率。
a:镜口角(即入射角)。
3 油镜使用的原理油镜，即油浸接物镜。
当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油(其折射率与玻片的相近)，则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
三、实验材料1 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、盖玻片、接种环、酒精灯等。
2 细菌三种形态的玻片染色标本。
3 培养12-18h的枯草芽孢杆菌。
四、实验方法与步骤1 染色细菌玻片的油镜观查(1)用前检查:零件是否齐全，镜头是否清洁。
(2)调节光亮度。
(3)低倍镜观察:先粗调再微调至物象清晰。
(4)转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。
(5)油镜观察:高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。
6)绘出所观察到的细菌形态图像。
((7)、换片:另换新片观察，必须从(3)步开始操作。
油镜的使用与简单染色法
实验一油镜的使用、简单染色法一、实验目的1、复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。
2、掌握细菌简单染色及无菌操作技术。
二、实验原理（一）普通光学显微镜的构造普通光学显微镜包括机械部分和光学部分两部分。
机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。
光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。
（二）油浸系的原理浸系是在油浸镜与标本之间加1滴香柏油，调整光源检查细菌标本的方法。
油浸镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95x、100x等。
其镜头标记国产镜多用“油”字表示，国外产品则用“Oil”（Oil Immersion）或HI （homogeneous Immersion）表示。
而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一种标志。
其使用原理是：由于香柏油与玻璃的折光率相似（香柏油为1.515，玻璃为1.52）。
镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气（折光率为1.0）而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰（见下图）。
图介质为空气（A）与介质为香柏油（B）时光线通过的比较（三）细菌简单染色细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。
利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
显微镜的使用和细菌简单染色
（二）光学显微镜的油镜原理
显微镜的分辨率D：是指显微镜能辨别两点之间 的最小距离的能力，即最小分辨距离。D越小，分 辨率越高。
D=λ/2NA λ为光源光波波长， NA为物镜的数值孔径值
数值孔径值 NA= η sinθ θ为物镜镜口角的半数， η为香柏油的折射率（1.52）
比如：水的折射率1.33， 空气的折射率为1.0 NA香柏油=1.2-1.4， D油镜=0.2μm＞细菌直径0.5μm
光学显微镜的结构示意图
三、实验器材
1、菌种：蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 2、染色液和试剂：美蓝染液、复红染液 3、器材：载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、显微镜
四、方法和步骤
1.涂片：在载玻片中央滴一滴蒸馏水，无菌接种环 挑取少量菌体与水滴混合均匀，涂成薄的 菌膜。
6. 干燥：自然干燥或用吸水纸盖在涂片处吸取多余 水分。
7. 观察：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的 视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏 油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观 察细菌的形态。
五、结果观察
蜡状芽孢杆菌的简单染色
五、结果观察
蜡状芽孢杆菌的简单染色
六、实验完毕后的处理
1.将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净， a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。 b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。 c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。
显微镜的使用和 细菌的简单染色
一、实验目的
1.熟悉光学显微镜使用方法 2.掌握细菌的涂片和简单染色法的 基本方法和步骤
二、基本原理
（一）简单染色基本原理 通常采用碱性染料进行简单染色: 这是因
为细菌在中性、碱性和弱酸性环境中通常带负 电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部 分带正电荷，因此碱性染料（美蓝，结晶紫， 碱性复红等）很容易与细菌结合使其着色。
实验 显微镜使用及简单染色
【实验目的】
1.学习微生物涂片、染色基本技பைடு நூலகம்，掌握细菌的简单染色法。
2.学习显微镜油镜的使用和镜头的维护方法。
3.建立“无菌操作”的概念，掌握无菌操作相关技术。
4.观察细菌的特殊结构。
【实验原理】
细菌小且透明，当把细菌悬浮于水滴内，由于菌体和背景没有显著的明暗差，用光学显微镜难以看清它们的形态结构。故现将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用更能清楚地观察到细菌的形状及细胞结构。
6观察
【注意事项】
1.注意涂片时，滴生理盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不可过于浓厚。
2.火焰固定温度要适宜。注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚至破坏细胞的形态。
3.灯光开到最大（适宜即可），光圈调到最大，聚光灯调到最高，油镜头浸入油中。用完必须用擦镜液擦拭油镜头。
单染色法：仅用一种染料染色，可以观察细菌的大小、形态与排列，但不能鉴别细菌（当有多种细菌一起观察时）。
复染色法：用两种以上的染料染色，可将细菌染成不同的颜色。不仅可以观察细菌大小、形态和排列外，还可以鉴别细菌的染色性。
【材料与试剂】
菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌
染料与试剂：石碳酸复红、生理盐水或无菌水
器材：显微镜、接种环、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、二甲苯等
【实验步骤】
1涂片：在洁净的载玻片中央滴一滴生理盐水，用接种环（需要“无菌操作”，在酒精灯周围10-20cm操作，接种环需要灼烧除杂菌）从大肠杆菌上挑取少许菌苔于生理盐水中，混匀并涂成薄膜，涂布面积约1-1.5cm²。
2干燥
3固定
4简单染色
5水洗、吸干
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三 、实验器材
1、活材料： 培养18-24h的金黄色葡萄球菌(S.aureus) 和枯草芽孢杆菌（B.subtilis）。 2、染色液和试剂： 复红、美兰、二甲苯、香柏油。 3、器材： 载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。
四、实验步骤：
1、涂片：
取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏 水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右 边涂芽孢杆菌，做成薄的涂面，注意取菌不要太多。 整个过程中要注意无菌操作。（示范无菌操作技术）
2、干燥：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文 火烘干。 3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上， 通过火焰 2-3次固定（以不烫手为宜）。
4、染色：将固定过的涂片加复红或美兰染色1-2min。
5、水洗：用水洗去涂片上的染色液。
6、干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 7、镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野 后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将 油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。 8、绘图：
五、结果与思考题
1、油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应 注意些什么？
2、按比例绘出你所观察到的细菌的形态，并显 示两菌的排列方式。
六、注意事项
1、油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体 之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，再加上一般 光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸 物 镜时要特别细心，避免由于“调焦”不慎而压碎标本片并 使 物镜受损。
简单染色法:是只用一种染料使细菌着色以 显示其形态的染色法，简单染 色不能辨别细菌细胞的构造。
2、显微镜油镜工作原理：
利用油镜不但能增加照明度，更主要是能增加数值口 径，因为显微镜的放大效能是由其数值口径决定的。所 谓数值口径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜 口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所 得的乘积，可用下列公式表示：
1． 2． 3． 4. 5． 6．
实验项目名称； 实验目的； 实验原理； 实验材料； 实验步骤； 实验结果与讨论。
2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上 的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
实验报告的撰写要求
实验报告必须以实事求是、严肃认真的科学态度，按照指 导书的要求按时完成。实验报告应该简明扼要、叙述准确、数 据完整、绘图清晰且写实，应有讨论、有分析，结论明确。一 般应包括以下一些内容：
实验二 显微镜油镜的使用及 细菌的简单染色法
一、实验目的：
1.学习并掌握普通光学显微镜油镜的使用技术；
2.学习微生物制片、染色的基本技术，掌握细菌的 简单染色法及无菌操作技术； 3.观察细菌的基本形态。
二、实验原理：
1、染色原理：用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性
染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和 带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生 长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通 常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿 等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷 的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细 菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等 酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染 料，如伊红美蓝、伊红天青等。
N•A=n· sinα
N•A:数值孔径 n:介质折射率 α：镜口角的半数
显微镜的分辨率是指显微镜能够辨别 两点之间最小距离的能力。它与接物镜的 数值口径成正比，与光波长度成反比，因 此接物镜的数值口径愈大，光波波长愈短， 则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微 结构也愈能明显地区别出来。
能辨别两点之间最小距离= 1/2光波长度÷数值口径 = 1/2λ ÷N· A
简单染色实验步骤
涂片 干燥 水洗
结果与思考题：
1、油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应注意些什么？ 2、按比例绘出你所观察到的细菌的形态，并显示两菌的排列 方式。
固定 干燥
复红或美蓝 1-2min
染色 镜检
9、实验完毕后的处理：
①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净： a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。 b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。 c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个 方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，再用洗衣粉清洗。