微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色

微生实验报告

姓名：王晶晖

专业年级：2011级生物技术

学号：************

实验二细菌的简单染色和革兰氏染色

一、实验目的

学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。

二、实验原理

用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。

简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。

三、实验器材

1、菌种：金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。

2、染色剂和试剂：草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚：乙醇=7:3），香柏油。

3、器材：废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。

四、实验方法

（一）简单染色

1．涂片：取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。

2．晾干：让涂片自然晾干。

3．固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰（通常2~3次）固定（具体温度以不烫手为宜）。

4．染色：将固定过的涂片加复红染色1~2min

5．水洗：用水洗去涂片上的染色液。

6．干燥：将吸过地涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。

7．镜检：先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上滴加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌形态。

（二）革兰氏染色

1.涂片：涂片方法与简单染色法涂片相同。

2.晾干：与简单染色法相同。

3.固定：与简单染色法相同。

4.结晶紫染色：将玻片加适量（盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1min。

5.水洗：倾去染色液，用自来水小心地冲洗至流出的水无色为止。

6.媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。

7.水洗：用自来水洗去碘液。

8.脱色：将玻片倾斜，连续点滴95%乙醇通过涂面脱色20~25s至流出液无色，立即水洗。

9.复染：滴加番红复染1~3min。

10.水洗：用自来水洗去涂片上的番红染色液。

11.晾干：将染好的涂片方空气中晾干或者用吸水纸吸干。

12.镜检：镜检时先用低倍物镜，再用高倍物镜，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。

13.实验完毕的处理：将浸过油的镜头按下述步骤擦拭干净。先用擦镜纸将油镜上的油擦去。再用擦镜纸沾少许显微镜镜头擦拭液将镜头擦2~3次。最后用干净的擦镜纸将镜头擦2~3次。注意：擦镜头时向一个方向擦拭。

五、实验报告

绘出金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。

六、实验分析

第一次做微生物的实验，总体来说还可以，但对革兰氏染色的方法还是不是很熟悉，实验结果感觉一般，效果不是十分明显，应该是制片做的不是很成功，还有第一次接触油镜，用起来不是很顺手，望以后能实验顺利。

七、思考题

1、对未知菌进行革兰氏染色时，怎样确保你的染色正确、结果可靠？

答：找事先已知的且和未知菌形态明显不同的G+和G-分别做混合涂片，当和G+做时G+正确显紫色和当和G-做时G-正确显红色，看这个未知菌分别显什么色，若一致，则可确定此菌为G+或G-。再回过头单做此未知菌的革兰氏染色，显现正确那就证明此染色技术操作正确。也可在开始做已知的与此菌形态明显不同的G+和G-三者混合涂片，一下知晓此未知菌的阴阳性，再回过头来染色。

2、做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？

答：1、如果过于浓厚，菌体会很难吸附到载玻片上，染色冲洗过程中很容易被冲下来

2、表层被染色，但是内层菌体很难染色。

3、显微镜观察时很难看清，细胞重叠。

3、革兰氏染色时，处染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌

应分别是什么颜色？

答：(1)不能，初染之前加的话，就会先和染料结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞壁进入细菌的质膜，达不到初染的效果。

(2)革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌无色。

4、你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？

答：当菌体为革兰氏阳性菌时，可以省去复染这个步骤。

5、用油镜观察时为什么要完全晾干？

答：因为用油镜观察时,镜头离玻片会很近.如果未完全干燥,载玻片上的液体会污染油镜镜头.镜头非常精密,被污染后不利于下次观察.正常情况下,观察前要用擦镜纸擦拭干净.另外,一

般作细菌装片不用盖盖玻片,所以待干燥后才能观察.如果盖上盖玻片后就不用考虑需要干燥的问题.

6、革兰氏染色成败的关键是什么？

答：染色时，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。

7、叙述无菌操作时应注意的问题？

答：1、使用前超净工作台开15分钟紫外线

2、注意开通风

3、使用的器皿注意消毒

4、操作时戴无菌手套或并用75%酒精消毒

5、操作时尽量靠近酒精灯火焰