微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色
细菌的简单染色和革兰染色实验报告
实验二：细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法。
2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。
3.巩固显微镜油镜的使用方法。
4.学习无菌操作技术。
二、实验原理1、染色原理：细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。
2、革兰染色法原理：革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。
如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验仪器，材料和用具1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S33、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液四、实验步骤（1）简单染色1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。
2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。
3、干燥：涂片后待其自然干燥。
4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。
5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。
微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色
答：
染色时，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
7、叙述无菌操作时应注意的问题？
答：
1、使用前超净工作台开15分钟紫外线
2、注意开通风
3、使用的器皿注意消毒
4、操作时戴无菌手套或并用75%酒精消毒
5、操作时尽量靠近酒精灯火焰
1．涂片：
取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。
微生实验报告
姓名：
xx
专业年级：2011级生物技术
学号：1032
实验二细菌的简单染色和革兰氏染色
一、实验目的
学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。
二、实验原理
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
(2)革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌无色。
4、你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌是微生物中最常见的一类生物，它们广泛存在于自然界的各个角落，包括土壤、水体、空气等。
为了更好地了解细菌的形态和结构，科学家们开展了许多实验，其中包括细菌的简单染色和革兰氏染色。
一、细菌的简单染色实验细菌的简单染色是一种常用的染色方法，通过给细菌染色，可以使其在显微镜下更加清晰可见。
这种染色方法主要使用了一种叫做甲基蓝的染料。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片。
将一根无菌的钢丝棒蘸取一小滴细菌悬液，然后将其均匀地涂抹在玻璃片上。
待涂片干燥后，将其固定在火焰上加热的玻璃柱上，以使细菌附着在玻璃片上。
接下来，将制备好的涂片放入染色盒中，加入适量的甲基蓝染料，浸泡片刻。
然后，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
最后，用纸巾轻轻吸干涂片上的水分，将其放入显微镜下观察。
在显微镜下观察，我们可以清楚地看到细菌的形态和结构。
不同种类的细菌可能会呈现出不同的形状，例如球状、杆状、螺旋状等。
通过简单染色，我们可以更好地观察和研究细菌的特征。
二、革兰氏染色实验革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
这种染色方法主要使用了紫晶染料和碘酒。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片，方法与简单染色相同。
然后，将涂片放入染色盒中，加入适量的紫晶染料，浸泡片刻。
接着，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
接下来，将碘酒滴在涂片上，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
随后，滴入乙醇或酒精醛溶液，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
最后，滴入蓝色染料，浸泡片刻后用蒸馏水冲洗涂片。
在显微镜下观察，我们可以看到细菌的染色效果。
革兰氏阳性菌会呈现紫色或蓝色，而革兰氏阴性菌则呈现红色或粉色。
这是因为革兰氏阳性菌的细胞壁含有较多的胆固醇，可以吸附紫晶染料和碘酒，而革兰氏阴性菌的细胞壁则较薄，无法吸附这些染料。
微生实验报告2012.10.10实验一细菌的简单染色和革兰氏染色
微生实验报告姓名:王晶晖专业年级：2011级生物技术学号:040312011032实验二细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。
二、实验原理用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷,所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色.酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。
中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C。
Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类,是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的.G-菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质,增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色,再经番红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。
三、实验器材1、菌种:金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。
2、染色剂和试剂：草酸铵结晶紫染液,卢哥氏碘液,95%酒精，番红复染液，复红染液,吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液(乙醚:乙醇=7：3）,香柏油.3、器材：废液缸,洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。
四、实验方法（一）简单染色1．涂片：取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水,按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。
微生物的革兰氏染色实验报告doc
微生物的革兰氏染色实验报告.doc 微生物的革兰氏染色实验报告一、实验目的和要求本次实验的目的是学习并掌握革兰氏染色的基本原理和操作方法，了解革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构和染色特性的差异，以及革兰氏染色在微生物学研究和临床诊断中的应用价值。
实验要求学生掌握革兰氏染色的步骤和注意事项，能独立进行革兰氏染色操作，并能对染色结果进行正确分析和解释。
二、实验原理和方法革兰氏染色是一种常用的细菌分类和鉴定方法，其基本原理是通过不同的染色步骤和处理条件，使细菌细胞壁上的化学成分产生不同的反应，从而导致细菌细胞呈现出不同的颜色。
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，主要由肽聚糖和磷壁酸组成，能够抵抗革兰氏染色的脱色剂乙醇的处理，因此能够保留结晶紫的颜色，呈现出紫色。
而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，主要由脂蛋白、磷脂和脂多糖组成，容易被乙醇脱色，再用复染剂番红染色后呈现出红色。
革兰氏染色的具体步骤如下：1.涂片：在干净的载玻片上滴一滴无菌水，用接种环取少量细菌与水滴充分混合，制成薄而均匀的涂片。
2.固定：将涂片在空气中自然干燥或用火焰固定。
3.初染：用结晶紫染色液染色1-2分钟，用水冲洗。
4.媒染：用碘液媒染1分钟，用水冲洗。
5.脱色：用95%乙醇脱色30秒-1分钟，用水冲洗。
6.复染：用番红染色液染色1-2分钟，用水冲洗。
7.镜检：用油镜观察并记录细菌的颜色和形态。
三、实验步骤和结果本次实验选用大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）作为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的代表，按照上述步骤进行革兰氏染色操作。
具体步骤如下：1.在干净的载玻片上滴一滴无菌水，用接种环取少量大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别与水滴充分混合，制成薄而均匀的涂片。
2.将涂片在空气中自然干燥或用火焰固定。
3.用结晶紫染色液染色1-2分钟，用水冲洗。
4.用碘液媒染1分钟，用水冲洗。
5.用95%乙醇脱色30秒-1分钟，用水冲洗。
6.用番红染色液染色1-2分钟，用水冲洗。
实验细菌的简单染色与革兰氏染色
掌握简单染色和革兰氏染色的操作方法
简单染色
将细菌涂片或培养物直接与染料混合 ，然后进行观察。操作简单，适用于 初步观察细菌形态。
革兰氏染色
一种特殊的染色方法，通过结晶紫初 染、碘液媒染、酒精脱色和沙黄复染 等步骤，将细菌分为革兰氏阳性菌和 革兰氏阴性菌两类。
出版年份：XXXX年
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简单染色方法简便，操作相对容易，但只能显示细菌的形态 和结构，不能提供细菌的种类信息。
革兰氏染色原理
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革兰氏染色是一种常用 的细菌鉴别染色法，通 过使用结晶紫、碘液和 酒精等染料对细菌进行 染色，能够将细菌分为 革兰氏阳性菌和革兰氏 阴性菌两大类。
革兰氏染色的原理主要 是基于细菌细胞壁的成 分和结构不同，导致对 染料的吸附和着色能力 。
复染
将涂片浸入稀释后的伊 红或沙黄染色液中，染
色一定时间后取出。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除 染色液。
观察
在显微镜下观察染色结 果，判断细菌是革兰氏
阳性还是阴性。
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实验结果与分析
简单染色结果与分析
染色结果
通过简单染色法，细菌被 染上了不同的颜色，如红 色或紫色。
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涂片制备
将细菌均匀涂在载玻片上，晾 干。
染色
将涂片浸入染色液中，染色一 定时间后取出。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除染色液 。
观察
在显微镜下观察染色结果，判 断细菌类型。
革兰氏染色步骤
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涂片制备
环境中微生物的检测,细菌的简单染色,细菌的革兰氏染色
实验一：环境中微生物的检测，细菌的简单染色，细菌的革兰氏染色作业题：1、为什么在培养过程中要将培养基平板倒置答：倒置的原因为1、防止培养基水汽凝结后流下到培养基上，从而冲散菌落并造成多菌落的污染串染，不利于细菌菌落的计数统计；2、同时培养基倒置后，可以有效防止外部空气进入，防止杂菌污染培养基2、为什么在实验中要留空白对照答：预留空白对照组，可以通过观察空白对照组中菌落生长情况，排除可能的因操作原因造成的无关杂菌、无关变量的污染干扰。
同时可以验证菌落生长长势不因为培养基制备的原因而产生误差。
3、比较测试培养皿和对照培养皿中的菌落数说明什么问题答：测试培养皿和对照培养皿同时进行操作，可以通过观察对照空白培养皿中的菌落数，对照排除测试培养皿中因培养基制作或培养皿自身灭菌等操作误差引起的染菌因素。
便于判定测试培养皿中哪些是来自环境中的微生物，哪些是来自于培养皿本身所携带微生物。
4、通过实验谈谈你对无菌操作的认识答：通过第一次的实验，我们已经认识到环境中的微生物是无处不在的。
在微生物实验中，只要不注意，就很有可能造成杂菌的污染而影响到正常实验。
在实验课上我们学到的是最基本的无菌操作技术，而更重要的是树立无菌操作的意识，比如在操作的时候尽量不说话、不用手去触碰非无菌区域，对菌落进行接种时应该靠近火焰，操作完后再次在火焰上方灼烧消毒等等。
5、制片时为什么要固定？固定时应该注意什么事项？答：制片时固定的意义在于防止后期在染色和冲洗玻片时细菌会随着流水冲散甚至冲走，造成制片失败。
固定时应注意不应直接将玻片放于酒精灯外焰灼烧，否则会造成细菌因迅速脱水而无法顺利固定在玻片上。
同时不能灼烧过度否则会造成细菌缩水变形。
6、在使用和清理油镜过程中应注意哪些过程？答：油镜属精密仪器，需轻拿轻放并不能将镜子反向放置。
在使用前，需对油镜用擦镜纸的光面蘸取少量松柏油擦拭油镜镜头，同时在样品玻片上样品处滴加少量松柏油。
放置好后调至油镜，先调节粗准焦螺旋待其离样本距离很近时，换用细准焦螺旋调节，待其与样本上松柏油接触形成一条油线。
细菌简单染色及革兰氏染色实验
细菌简单染色一、实验器材1、菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。
2、溶液和试剂：草酸铵结晶紫溶液、齐氏石炭酸复红溶液、吕氏碱性美蓝溶液、革兰氏染色用碘液、乳酸石炭酸棉蓝染液。
3、仪器和其他用品：酒精灯、载玻片、显微镜、双层瓶、擦镜纸、接种环、镊子、平皿、滴管、生理盐水、50%乙醇等。
二、目的要求1、学习病掌握微生物的制片及简单染色的基本技术2、初步了解细菌、酵母菌及霉菌的形态特征和相互区别3、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术三、基本原理利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。
用于染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使染料能够成盐。
常用的微生物细胞染料都是盐，分碱性染料和酸性染料，前者包括美蓝、结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）及孔绿绿等，后者包括选型复红、伊红及刚果红灯。
通常常用碱性染料进行简单染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中通常带负电荷，而染料电离后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色，有利于观察。
对个体较小的细菌进行制片时采取涂片发，通过涂抹使细胞个体在载玻片均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固体使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。
四、操作步骤1、涂片取一块载玻片，用记号笔平均分为两个区域并标记；各滴一小滴生理盐水于两个区域中央；用接种环无菌操作分别挑取少许枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面菌苔于载玻片上的生理盐水中，涂抹菌苔使其成均匀的薄膜。
2、干燥自然干燥或用电吹风干燥。
3、固定涂菌面朝上，通过火焰2-3次。
4、染色将载玻片平放于载玻片支架上，滴加染液覆盖涂菌部位即可，吕氏碱性美蓝1.5min，草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸复红染液1min。
5、水洗用吸水纸吸去多余水分，自然干燥或电吹风吹干。
细菌的简单染色和革兰染色
细菌的简单染色和革兰染色实验三细菌的简单染色和革兰染色一．实验目的1．学习并熟练局部无菌操作2. 学习细菌涂片的制法，掌握细菌简单染色和革兰氏染色的方法3. 进一步熟悉显微镜的使用。
二．实验原理细菌生长时常带负电，所以常用带正电的碱性染料染色。
简单染色就是用一种染料染色的方法。
革兰氏染色可把细菌根据细胞壁成分和结构分为阳性和阴性，阳性菌细胞壁中脂类物质多，染色为紫色；阴性菌细胞壁中脂类物质少，染色为红色。
三．实验材料、仪器与试剂1.菌种：金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌、未知菌，酵母。
2.仪器用品：显微镜、载玻片，盖玻片，擦镜纸，接种环，酒精灯，火柴，镊子，擦镜液，吸水纸，牙签3.试剂：简单染液：草酸铵甲紫染液，蕃红染液革兰氏染液：1) 草酸铵甲紫染液；2) 革氏碘液；3) 脱色液；4) 蕃红染液实验前准备（助教完成）将菌种培育24h。
四．实验步骤（一）简单染色1.取载玻片用纱布擦干，在涂菌面反面画直径2mm左右的小圈，把涂菌部位在火焰上烤一下，除去油脂。
2.涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从EP管中沾取菌液一滴，在洁净无脂的载玻片上涂涂膜。
取菌过程要在酒精灯附近的无菌环境中进行。
3.晾干：让涂片自然晾干。
4.固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
5.染色：将固定过的涂片放吸水纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
6.水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液7.镜检。
（二）革兰染色。
1.制片：取菌液制成涂片：干燥，固定。
2.初染：滴加1滴结晶紫色染液，1min，水洗。
3.媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。
4.脱色：吸去残留水，滴加脱色液至流出液无紫色，立即水洗。
5.复染：滴加蕃红复染3min，水洗。
6.镜检：用吸水纸吸干，盖上盖玻片，从低倍镜到油镜依次观察。
注意细菌形态、大小、排列、颜色。
7.拍照。
（三）选做实验往干净的载波片上滴加半滴水，用无菌牙签取一点牙垢，涂抹在水滴上，制成涂片，革兰染色。
细菌的简单染色与革兰氏染色实验报告（共4篇）
细菌的简单染色与革兰氏染色实验报告(共4篇)细菌的简单染色和革兰氏染色实验细菌的简单染色和革兰氏染色实验实验目的1. 学习微生物涂片，染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。
、2. 巩固显微镜的使用方法。
基本原理1. 简单染色法:用单一染料对细菌进行染色的方法。
此法操作简单，适用于一般形态的观察。
在中性，碱性或酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以用碱性染料进行染色。
碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易于带负电荷的细菌结合而是细菌着色。
带正电的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。
通常的碱性染料除了美蓝外，还有结晶紫，碱性复红，番红等。
细菌体积较小，较透明，如未经染色常不易识别，而经染色后与背景形成鲜明的对比，是易于在显微镜下观察。
2. 革兰氏染色法:将所有的细菌分成革兰氏阳性菌G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以将细菌分为G+和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙酸溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使染色的结晶紫和碘的复合物易于渗透，结果细菌被脱色，在经复红染色后就成了红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时颜色。
革兰氏染色需要四种不同的溶液，碱性染料初染液，煤染剂，脱色剂和复染液。
碱性染料初染液的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或付着力，即已某种方式帮助染料固定在细胞上，是不易脱落，碘是常用的媒染剂。
脱色剂是被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染剂，复染的目的是使被脱落的细胞染上不同于初染液的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的染色液是复红。
掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法
4、思考题 （1）你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意那些环节？ （2）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果 加热温度过高，时间太长，又会怎么样呢？ （3）你认为那些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其 中最关键的环节是什么？ （4）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染 之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？
3、注意事项 （1）涂片不宜过厚，以免脱色不完全，造成假阳性。 （2）乙醇脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可 被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性 菌也会被染成革兰氏阳性菌。 （3）菌龄，应选择活跃生长期的幼培养物作革兰氏染 色。培养时间过长，或死亡及部分自溶，改变了细菌 CW的通透性，造成阳性菌的假阴性反应。 （4）火焰固定不宜过热。 （5）媒染剂的作用，是增加染料和细胞之间的亲和性 或吸附力，即以某种方式帮助染料固：取菌种培养物常规涂片，干燥，固定。 （2）初染：滴加结晶紫染色1min，水洗。 （3）媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约 1min， 水洗。 （4）脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜， 在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直 至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 （5）复染：用番红复染约2min，水洗。 （6）镜检：干燥后用油镜观察。 （7）混合涂片染色
实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色
辽宁师范大学生物基础实验教学中心
谢鲲鹏
（一）实验目的：
1、学习微生物涂片的基本技术 2、巩固显微镜的使用方法和无菌操作技术 3、掌握细菌的简单染色法和革兰氏染色法。
（二）实验原理：
1、简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的方 法。此法操作简便，适用菌体一般形态和细菌排列 的观察。 2、革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram氏 创立的。而后一些学者在此基础上作了某些改进。 革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
微生物实验报告---普通光学显微镜的使用及简单染色、革兰氏染色
普通光学显微镜的使用及简单染色、革兰氏染色郑小煜201100140069生命科学学院生科3班同组者:赵莉、高瑞、刘梦迪2012年10月10日一、实验目的和要求1、学习显微镜的使用方法。
微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌单染色。
2、学习3、初步认识细菌的显微形态特征。
4、学习并掌握细菌革兰氏染色，了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验原理1、细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对他们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而更能清楚的观察到其形态和结构。
2、油镜:油镜的放大倍数可达100倍，焦距很短，直径很小，但所需的光照度却很大。
为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃折射率相仿的镜油(通常用香柏油)。
且油镜分辨率很高，可达0.2微米左右。
3、通常采用碱性染料进行简单染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及酸性溶液中通常带负电荷，而染料电离后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色;当细胞处于碱性条件下所带正电荷增加时，可采用碱性染料染色。
4、革兰氏染色革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性(G?)和革兰氏阴性(G?)两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的。
首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。
然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。
之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。
革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。
而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂染色后又变为复染剂颜色。
细菌的简单染色和革兰氏染色
尹会方 2012.3.12
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1
球菌
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杆菌
2
弧菌
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3
实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色
一、实验目的 1. 学习掌握简单染色的操作技术和无菌操作
技术。 2. 理解革兰氏染色机理，并掌握其操作技术。 3.了解芽孢染色机理，掌握芽孢染色的方法。
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5
二、实验原理---简单染色
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀 死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其 对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定 两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形。
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6
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色 法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
精选ppt课件25源自附：革兰染色液配方1．草酸铵结晶紫染液 A液：结晶紫(crystal violet)2g 95%酒精 20ml B液：草酸铵(ammonium oxalate)0.8g 蒸馏水 80m 混合A、
B二液，静置48小时后使用。 2．卢戈氏(Lugol)碘液 碘片 1．0g 碘化钾 2．0g 蒸馏水 300ml 先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，
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14
2. 革兰氏染色
2、干燥与固定：方法同（一）中2， 3步骤
3、染色： 结晶紫染色1-2分钟--水洗--碘液媒 染1-2分钟--水洗--酒精脱色1520秒--水洗--番红复染色2-3分钟-水洗--干燥--镜检记录。
实验一微生物的简单染色、革兰氏染色和芽胞染色.doc
实验一微生物的简单染色、革兰氏染色和芽胞染色赵奕玲121180169一．实验目的1．掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤；2．掌握革兰氏染色法的步骤和关键点；3．掌握芽胞染色的步骤要点；4．识别细菌的革兰氏染色和芽胞染色的结果；5．学习无菌操作技术。
二．实验原理一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，通常为圆形或椭圆形。
芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。
因此，用着色力强的染色剂（如孔雀石绿）在加热条件下进行染色时，染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染色的染料则难以透出，若再用复染液（如沙黄水溶液）染色后，芽孢仍然保留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的颜色，即菌体和芽孢分别染成红色和绿色易于区分。
三．实验器材载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液；结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液；枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18 小时的液体培养液，酵母菌平板，大肠杆菌平板，牙垢。
四．实验步骤（一）革兰氏染色1. 涂片左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。
若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。
细菌的简单染色法和革兰氏染色法
实验一细菌的简单染色法和革兰氏染色法一、目的要求1.学习微生物涂片、染色的基本技术，并掌握革兰氏染色的方法。
2.初步认识细菌的形态特征，掌握无菌操作技术。
3.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、基本原理1. 简单染色法：用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
2. 革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医生Gram创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液(counterstain) 。
碱性染料的作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。
实训五细菌的简单染色和革兰氏染色试验目的1掌握染色的原理
实训五细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的1. 掌握染色的原理和操作过程2. 掌握简单染色和革兰氏染色方法与规范操作3. 规范正确使用普通光学显微镜二、实验原理由于细菌菌体极小，折光率低，在显微镜下不容易看清，如将其染色，使菌体和背景之间反差增大，折光率增强，就容易看清，简单染色法只用一种染料着色。
革兰氏染色法是细菌染色中一种重要的鉴别染色法。
通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。
其过程是：草酸铵结晶紫初染→路哥氏氏碘液媒染→95%乙醇脱色→蕃红花红复染。
若细胞能保持结晶紫与碘所形成的复合物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性菌，若被乙醇脱色而被蕃红复染成红色，则称革兰氏阴性菌。
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。
实际上，当用结晶紫初染后，象简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。
革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
三、实验器材显微镜、载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、吸水纸、接种环、镊子、草酸铵结晶紫色液、路哥氏碘液、95%乙醇、蕃红花红染色液、菌落培养物（培养18～24小时）、二甲苯、香柏油四、操作步骤（一）简单染色法1．涂片取洁净载玻片，在中央滴一滴生理盐水（或无菌水），用接种环以无菌操作挑取欲观察菌体，和水充分混匀，涂成极薄的菌膜。
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微生实验报告
姓名：王晶晖
专业年级：2011级生物技术
学号：************
实验二细菌的简单染色和革兰氏染色
一、实验目的
学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。
二、实验原理
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。
中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。
三、实验器材
1、菌种：金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。
2、染色剂和试剂：草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚：乙醇=7:3），香柏油。
3、器材：废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。
四、实验方法
（一）简单染色
1．涂片：取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。
再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。
亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。
2．晾干：让涂片自然晾干。
3．固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰（通常2~3次）固定（具体温度以不烫手为宜）。
4．染色：将固定过的涂片加复红染色1~2min
5．水洗：用水洗去涂片上的染色液。
6．干燥：将吸过地涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。
7．镜检：先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上滴加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌形态。
（二）革兰氏染色
1.涂片：涂片方法与简单染色法涂片相同。
2.晾干：与简单染色法相同。
3.固定：与简单染色法相同。
4.结晶紫染色：将玻片加适量（盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1min。
5.水洗：倾去染色液，用自来水小心地冲洗至流出的水无色为止。
6.媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。
7.水洗：用自来水洗去碘液。
8.脱色：将玻片倾斜，连续点滴95%乙醇通过涂面脱色20~25s至流出液无色，立即水洗。
9.复染：滴加番红复染1~3min。
10.水洗：用自来水洗去涂片上的番红染色液。
11.晾干：将染好的涂片方空气中晾干或者用吸水纸吸干。
12.镜检：镜检时先用低倍物镜，再用高倍物镜，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
13.实验完毕的处理：将浸过油的镜头按下述步骤擦拭干净。
先用擦镜纸将油镜上的油擦去。
再用擦镜纸沾少许显微镜镜头擦拭液将镜头擦2~3次。
最后用干净的擦镜纸将镜头擦2~3次。
注意：擦镜头时向一个方向擦拭。
五、实验报告
绘出金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。
六、实验分析
第一次做微生物的实验，总体来说还可以，但对革兰氏染色的方法还是不是很熟悉，实验结果感觉一般，效果不是十分明显，应该是制片做的不是很成功，还有第一次接触油镜，用起来不是很顺手，望以后能实验顺利。
七、思考题
1、对未知菌进行革兰氏染色时，怎样确保你的染色正确、结果可靠？
答：找事先已知的且和未知菌形态明显不同的G+和G-分别做混合涂片，当和G+做时G+正确显紫色和当和G-做时G-正确显红色，看这个未知菌分别显什么色，若一致，则可确定此菌为G+或G-。
再回过头单做此未知菌的革兰氏染色，显现正确那就证明此染色技术操作正确。
也可在开始做已知的与此菌形态明显不同的G+和G-三者混合涂片，一下知晓此未知菌的阴阳性，再回过头来染色。
2、做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？
答：1、如果过于浓厚，菌体会很难吸附到载玻片上，染色冲洗过程中很容易被冲下来
2、表层被染色，但是内层菌体很难染色。
3、显微镜观察时很难看清，细胞重叠。
3、革兰氏染色时，处染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌
应分别是什么颜色？
答：(1)不能，初染之前加的话，就会先和染料结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞壁进入细菌的质膜，达不到初染的效果。
(2)革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌无色。
4、你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？
答：当菌体为革兰氏阳性菌时，可以省去复染这个步骤。
5、用油镜观察时为什么要完全晾干？
答：因为用油镜观察时,镜头离玻片会很近.如果未完全干燥,载玻片上的液体会污染油镜镜头.镜头非常精密,被污染后不利于下次观察.正常情况下,观察前要用擦镜纸擦拭干净.另外,一
般作细菌装片不用盖盖玻片,所以待干燥后才能观察.如果盖上盖玻片后就不用考虑需要干燥的问题.
6、革兰氏染色成败的关键是什么？
答：染色时，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。
7、叙述无菌操作时应注意的问题？
答：1、使用前超净工作台开15分钟紫外线
2、注意开通风
3、使用的器皿注意消毒
4、操作时戴无菌手套或并用75%酒精消毒
5、操作时尽量靠近酒精灯火焰。