细菌的革兰氏染色和形态观察
细菌的形态构造和观察--项目实训：革兰氏染色法
脱色：95%乙醇脱色20-30s, 至乙醇液不呈紫色
复染：番红复染1min,用水冲 洗
干燥后镜检
八、项目实训：革兰氏染色法
３ 染色结果
八、项目实训：革兰氏染色法
４ 染色影响因素
➢ 掌握好乙醇脱色程度，若脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时， 阴性菌被误染为阳性菌；
➢ 菌龄也影响染色结果，若细菌培养时间太长，已死亡或自溶，导致细胞壁通透性 的改变而呈现假阴性反应。
Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，因其含脂 量高，乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁， 酒精将细胞脱色，细胞无色，沙黄复染后呈红色。
项目一 细菌的构造和形态观察
八、项目实训：革兰氏染色法
１ 基本原理
八、项目实训：革兰氏染色法
２ 操作步骤
涂片、干燥、固定
初染：草酸铵结晶紫染色 1min,用水冲洗
微生物学基础
原核微生物的构造和形态观察
项目一 细菌菌鉴定的重要方法，可将全部细菌分成革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类； ➢ 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁化学组成和结构不同： G+ 菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，交联度大，当乙醇脱色时，肽聚糖因 脱水而孔径缩小，故结晶紫-碘复合物被阻留在细胞内，细胞不能 被酒精脱色，仍呈紫色。
简述菌株革兰氏染色后的观察结果
简述菌株革兰氏染色后的观察结果
革兰氏染色是一种常用的细菌染色技术，用于区分细菌的死活和细胞壁结构。
革兰氏染色后的观察结果通常包括以下方面:
1. 阴性菌：革兰氏阴性菌的细胞壁结构较为复杂，其中包含多层肽聚糖和脂肪，因此染色后它们会被结晶紫 - 碘复合物染色，呈现出深蓝色或紫色。
在显微镜下观察，革兰氏阴性菌通常呈圆形或卵形，排列紧密，彼此之间不容易区分。
2. 阳性菌：革兰氏阳性菌的细胞壁较为坚韧，含有更多的肽聚糖和少量的脂类，因此染色后它们不会被结晶紫 - 碘复合物染色，而是呈现出无色或浅蓝色。
在显微镜下观察，革兰氏阳性菌通常呈长链或分支状，容易与其他细菌区分。
3. 活菌与死菌：染色后活菌的细胞壁结构完整，不会被染色，而死菌则会被染色。
因此，通过观察菌株的染色结果，可以判断菌株是否为活菌。
4. 不同菌株的染色结果：不同种类的革兰氏菌的染色结果可能会有所不同。
例如，某些革兰氏阴性菌可能会呈现出不同的染色反应，而有些革兰氏阳性菌可能会呈现出不同的无色状态。
综上所述，革兰氏染色后的观察结果可以反映菌株的死活、细胞壁结构、类别以及不同菌株之间的染色反应差异。
细菌单染色及革兰氏染色过程观察
BEIJING SOLARBIO SCIENCE &TECHNOLOGY CO.,LTD细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察1.基本原理（1）简单染色法用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
（2）革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。
碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染BEIJING SOLARBIO SCIENCE &TECHNOLOGY CO.,LTD 液一般是结晶紫。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→ 固定→ 干燥→ 水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
7细菌的革兰氏染色 (1)
微生物实验报告细菌的革兰氏染色及形态观察一、目的要求：1、熟悉光学显微镜的使用方法。
2、掌握革兰氏染色法。
3、掌握大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的染色结果和形态特征二、器材和器皿：1、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌2、革兰氏染色液、香柏油、二甲苯3、显微镜、擦镜纸、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环等三、实验原理：革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram 创立。
未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别很小，在显微镜下极难观察。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
革兰氏染色属复染法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。
四、实验步骤：1、取载玻片用纱布擦干，涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。
2、涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。
3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。
4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
5、染色：在菌膜上滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
6、水洗：用蒸馏水轻轻冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。
简单染色结束可观察细胞形态。
细菌形态结构观察——简单染色革兰氏染色
（1） 为什么必须用培养24 h以内的菌体进行革兰氏 染色？
（2） 要得到正确的革兰氏染色结果，必须注意哪些 操作？哪一步是关键步骤？为什么？
（3） 当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操 作正确，结果可靠？
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1、简单染色法原理 这是最基本的染色方法，由于细性燃料如美蓝、碱性 复红、结晶紫、孔雀绿、蕃红等进行染色。这类染料解 离后，染料离子带正电荷，故使细菌着色。
2、革兰氏染色法原理 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色
法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。 革兰氏染色过程所用四种不同溶液的作用：
（5） 复染 蕃红染液复染1 min，水洗。 （6） 吸干并镜检 若研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应 时，则需同时用已知菌进行染色作为对照。
五、实验结果
（1） 绘图：画出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的细胞形 态图。 （2） 记录革兰氏染色结果；分辨出革兰氏阳性菌或革 兰氏阴性菌。如果染色结果不理想，请分析原因。
（1） 碱性染料 草酸铵结晶紫液。 （2） 媒染剂 碘液，其作用是增强染料与菌体的亲和力， 加强染料与细胞的结合。
（3） 脱色剂 乙醇将染料溶解，使被染色的细胞脱色。 利用不同细菌对染料脱色的难易程度不同，而加以区分。
（4） 复染液 蕃红溶液，目的是使经脱色的细菌重新染 上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。
（2） 染色 用草酸铵结晶紫染液染色1 min，用水冲洗。 （3） 媒染 滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖1 min， 用水冲去碘液。
微生物学实验一、细菌的革兰染色、特殊形态观察、细菌分布
革兰阳性菌与阴性菌细胞壁的比较
细胞壁 质地 厚度 肽聚糖层数 肽聚糖含量 糖类含量 脂类含量 磷壁酸 外膜
G+菌 坚韧 20-80nm 15-50 50-80%（干重） 约45% 1-4%
+ —
G-菌 疏松 10-15nm 1-2 5-20%（干重） 15-20% 11-22%
实验结果
（1） 绘图：画出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的细胞 形态图。如果染色结果不理想，请分析原因。 （2） 思考: 进行革兰氏染色的意义?
细菌的基本结构
一、细胞壁 二、细胞膜 三、细胞质 四、核质
细菌的特殊形态结构
• 芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各 种极端环境。
• 荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体 • 鞭毛：运动，菌落形态。
实验一、细菌的革兰染色、特殊形态观察、细菌分布
实验目的
• 学习细菌的革兰氏染色原理和方法
• 了解细菌的特殊形态结构： 荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢
• 了解细菌在环境(空气、污水),人体(皮肤、 口咽腔)中的分布
革兰氏染色法基本原理
• 革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家 C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有 的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏 阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的 鉴别染色法。 G+ -紫色 G- - 红色
细菌荚膜的观察
主要成分是多糖、 多肽或蛋白质， 尤以多糖居多。
荚膜
细菌鞭毛的观察
菌毛
芽胞
肉毒梭菌
破伤风芽孢杆菌
了解细菌在环境中的分布 空 气: 每组一个琼脂培养皿 污 水: 每组一个琼脂培养皿
了解细菌在人体中的分布 皮 肤: 2人一个琼脂培养皿红 1min——水洗
实验一油镜的使用细菌的革兰氏染色和细菌形态的观察
实验一油镜的使用细菌的革兰氏染色和细菌形态的观察实验目的：本实验旨在通过油镜的使用，观察细菌的革兰氏染色和形态，以掌握细菌鉴定的基础方法。
实验原理：革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，用于分辨细菌的结构和形态。
该染色方法将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏阳性菌在革兰氏染色中染成紫色，革兰氏阴性菌染成红色。
实验步骤：1.准备培养细菌的平皿和无菌的玻璃，使用酒精灯对玻璃杯进行灭菌处理。
2.取一根无菌的铂丝，沾取扩展细菌后在培养基平皿上划线接种。
3.将接种的培养基平皿在37°C恒温箱中培养12小时。
4.取出培养基平皿，使用吹泡沫取一点接种，放到滴眼瓶中，加入适量的生理盐水。
使用吹泡沫轻轻吹散细菌。
5.取一个无菌玻璃片，将油镜放在玻璃片上，使其与玻璃片连接。
6.使用无菌的锡夹夹取一小滴被吹散细菌的生理盐水，滴在油镜上。
7.将另一个无菌玻璃片放在油镜上，用力按压，使细菌均匀散布在油镜上。
8.将油镜取下，并将其放在培养基平皿上。
将油镜根据标记分为两部分，每部分放置一个培养基平皿。
9.将培养基平皿放入37°C恒温箱中，培养12小时。
10.将培养基平皿取出，观察细菌在油镜上的生长情况。
11.取一个干净的玻璃片，将油镜放在玻璃片上。
12.使用吸水纸轻轻将油镜上的细菌液吸干，并用培养基液洗净。
13.将玻璃片放在烘箱中烤干。
14.使用革兰氏染色方法对油镜上的细菌进行染色处理。
15.将革兰氏染色后的油镜进行形态观察，使用显微镜进行放大观察细菌结构。
实验结果分析：观察油镜后，革兰氏染色能够将细菌染成紫色或红色。
紫色堆状或链状的细菌属于革兰氏阳性菌，红色的细菌属于革兰氏阴性菌。
通过观察细菌形态，可以判断细菌的形状、大小、胞内结构等特征。
实验注意事项：1.实验过程中无菌操作非常重要，要使用无菌工具，注意无菌条件。
2.实验后要及时消毒处理，避免细菌污染。
3.实验中需要按照实验室的安全操作规范进行操作，避免危险发生。
实验三 细菌形态观察和革兰氏染色技术
⑥ 复染：
已经脱色处理的细胞或其结构常以复染液作复染 以便于观察。 复染液与初染液的颜色不同而成鲜明对比，所以 复染也称为对比染色。 复染液不宜太强，以免掩盖初染的颜色而失去对 比作用。
用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。 媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，
即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。
不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不
能，脱色剂常用95％的酒精。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染 的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未 被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，常用的复染液是番红。
三、结果:
② 固定：
染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和 其它细胞结构成分而杀死细菌；使菌体粘附于玻 片上以及改变细菌对染料的通透性（因活菌通常 不易使染料透入细胞内）。
固定的方法一般采用火焰加热法，在特殊目的时 也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化高汞 、重金属盐或氧化剂等进行固定。
③ 媒染：
① 涂片制备：
随标本的种类而略有不同。
• 若为液体培养液，亦可直接涂于载玻片上；
• 若为固体培养基上的细菌，则先取一接种环生理盐水于载玻片中 央，然后从培养基上取菌少许，在盐水中研磨均匀，使呈轻度乳 浊，以接种环扩成1cm2或2份硬币大小的涂面。
在室温下自然干燥或放在火焰上方的热空气中慢 慢烘干。但切忌紧靠火焰烤干。
⑤ 脱色：
脱色：是使被染物脱去已染上的颜色。脱色的目 的是观察细菌与染料结合的稳定程度，故可作为 鉴别染色之用。
凡具有脱色作用的化学试剂称脱色剂。脱色剂或 呈溶媒作用，如醇类、丙酮等；或能影响蛋白质 的电离程度，改变其电荷性质或数量，因而影响 细菌与染料的结合程度，如酸类能减少细菌的负 电荷，故可作碱性染料的脱色剂。
实验二细菌的染色及形态观察
实验二细菌的染色及形态观察一、目的要求1、了解细菌染色的基本原理。
2、掌握细菌的简单染、革兰氏染色及其他染色方法。
3、观察和识别细菌的形态及细菌细胞的特殊结构。
二、实验说明细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下特别是在油浸物镜下几乎与背景无反差，很难看清楚，如将其染色，使折光率增大，便容易观察。
由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不同，因此可以利用不同的染色方法来区别不同的细菌及其结构。
用于细菌染色的染色剂是苯环上含有发色基团和助色基团的化合物。
发色基团使化合物本身具有染色之能力，助色基团有电离特性，可以于被染物结合，使被染物着色。
染色剂有三种：酸性染色剂（电离后分子带负电荷）；碱性染色剂（电离后分子带电荷）；复合染色剂（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色剂）。
酸性染色剂主要用于染细胞质；碱性染色剂主要用于染核和异染颗粒等细胞结构；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次氏体。
三、实验材料1、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸。
2、酒精灯、接种环、载玻片。
3、石炭酸复红染色液、革兰氏染色液、荚膜染色液、鞭毛染色液（配方见附录）。
四、方法步骤（一）简单染色法步骤：涂片干燥固定染色水洗干燥镜检。
1、涂片在干净的载玻片中央加一滴蒸馏水，以无菌操作法，从斜面上挑取少量菌种，在载玻片上和水混合后，涂成一均匀薄层。
2、干燥固定涂片让其在空气中自然干燥，有时为使其干燥得快点，也可在酒精灯上加温，但勿贤紧靠火焰。
3、固定待涂片干燥徨，手持载玻片一端，有菌膜的一面向上，在酒精灯火焰上通过几次（用手背触载玻片背面，以不烫手为宜），待冷却后，再加染料。
4、染色玻片置于水平位置。
加石炭酸复红液于菌膜部位。
染1-2min。
5、水洗倾去染液，斜置玻片，用很细水流的自来水冲洗（切勿使水流直接冲刷在菌膜处），直至洗下水呈无色为止。
6、干燥自然干燥或用吸水纸吸干。
7、镜检。
（二）革兰氏染色法步骤：涂片干燥固定结晶紫染色水洗吸干 95%酒精脱色水洗吸干蕃红复染水洗干燥镜检。
实验一油镜的使用细菌的革兰氏染色和细菌形态的观察
三.自选材料：用牙签挑取牙垢观察
注意事项
一.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色？？如 脱色过度!!革兰氏阳性菌也可被脱色而染成 阴性菌!!如脱色时间过短!!革兰氏阴性菌也会 被染成革兰氏阳性菌？？脱色时间的长短还 受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响!! 难以严格规定？？
显微镜油镜的使用
• 油镜头的识别和重要参数 • 油镜物镜的工作原理 • 油镜的使用方法和注意事项
油镜头的识别和重要参数
➢放大倍数 ➢数值口径 ➢工作距离
油镜物镜的工作原理
• 使用油质作为玻片与接物镜 之间的介质——油浸系
• 可以增加显微镜的放大倍数 • 可以增加视野的照明度 • 可以增大显微镜的分辨率
【六】脱色：将玻片倾斜!!连续滴加九五%乙 醇脱色一五—二0s至流出液无色!!立即水 洗？？
【七】复染：滴加复红复染一min!!水洗：用 水洗去涂片上的复红染色液？？
【八】晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干？？
【九】镜检：镜检时先用低倍!!再用高倍!!最 后用油镜观察!!并判断菌体的中含有较多易被乙醇溶解的类脂质!!而且 肽聚糖层较薄、交联度低!!故用乙醇脱色时溶解了类脂 质!!增加了细胞壁的通透性!!使初染的结晶紫和碘的复 合物易于渗出!!结果细菌就被脱色!!再经复红复染后就 成红色？？
❖ G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高!!类脂质含量少!! 经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小!!通透性降 低!!因此细菌仍保留初染时的颜色？？
一碱性染料—带正电染料？？其阳离子部分为发色基团!!
可与细胞中带负电的组分结合？？如结晶紫沙黄!! 甲基 蓝!!碱性复红等？？
二酸性染料—带负电染料？？其阴离子部分为发色基团!!
细菌的革兰氏染色法及形态观察
细菌的革兰氏染色法及形态观察一、实验目的1．了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
2．学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。
二、基本原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
革兰氏染色属于最重要的鉴别染色。
一般认为革兰氏染色结果的主要原因是由于这两类细菌的细胞壁的结构和化学组成不同。
革兰氏阳性菌细胞壁较厚（20-80nm)，主要成分为肽聚糖，网状结构紧密。
而革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖层较薄（2-3nm)，主要成分是脂蛋白和脂多糖。
细菌经过初染和媒染，在细胞内形成深紫色的结晶紫-碘复合物，当用酒精脱色时细胞壁脱水，阳性细菌细胞壁的肽聚糖层网状结构孔径收缩以至关闭，阻止不溶性复合物结晶紫-碘的逸出，这样使菌体呈蓝紫色。
阴性菌脂类物质溶解，结晶紫－碘复合物随之被洗脱出，用复染剂复染后菌体呈复染后的红色。
三、实验器材1．菌种大肠杆菌、藤黄八叠球菌约24小时营养琼脂斜面培养物。
2．仪器普通生物显微镜显微镜3．材料载玻片、香柏油、二甲苯、擦镜纸、滤纸、酒精灯、接种环等4．染料草酸钱结晶紫染色液、路哥氏（Lugol）碘液、95％乙醇、0.5 %番红染色液四、实验流程涂片→干燥→固定→初染1min→水洗→媒染1min→水洗→脱色10-30s→水洗→复染1min→水洗→滤纸吸干→镜检。
五、操作步骤1．涂片取洁净的载片一张，将其在火焰上微微加热，除去上面的油脂，冷却，在中央部位滴加一小滴生理盐水，用接种环在火焰旁从斜面上挑取少量菌体与水混合。
烧去环上多余的菌体后，再用接种环将菌体涂成直径1cm 的均匀薄层，以淡淡的乳白色为宜。
制片是染色的关键，载片要洁净，不得玷污油脂，菌体才能徐布均匀。
注意初次涂片，取菌量不应过大，以免造成菌体重叠。
2．干燥涂布后，待其自然干燥或在酒精灯上方稍微加热，切勿靠近火焰。
实验二、细菌革蓝氏染色、放线菌形态观察
印片法：取一洁净载玻片置于火焰上微热后，盖在菌苔
上，轻轻按压，使培养物（气丝、孢子丝或孢固定。
上：孢子丝
右上、右下：基内菌丝 和气生菌丝
2. 结果 革蓝氏染色阳性：深紫色 革蓝氏染色阴性：浅红色
3. 放线菌的观察
基内菌丝（substrate mycelium）：也称营养菌丝，生长于培养基内，主
要功能是吸收营养物质和排泄代谢废物，营养菌丝一般无隔膜，内含有许多核质体， 直径约为0.2-0.8μm，但长度差别很大。色浅、较细。
气生菌丝（aerial mycelium）：营养菌丝发育到一定时期，长出培养基外伸
实验二、细菌革蓝氏染色、放线菌形态观察
基本概念： 革蓝氏染色（Gram staining） 革蓝氏染色阳性（Gram Positive） 革蓝氏染色阴性（Gram Negative） 基内菌丝（substrate mycelium） 气生菌丝（aerial mycelium） 孢子丝（sporophore）
放线菌的基本特点
¾分枝丝状体，原核微生物 ¾革蓝氏染色阳性反应 ¾不运动 ¾大部分腐生菌，少数寄生菌，也有致病菌 ¾ 抗生素的主要产生菌 ¾ 许多酶和维生素的产生菌 ¾甾体转化、石油脱蜡、污水处理 ¾某些与植物共生固氮
放线菌的菌丝
1、营养菌丝 匍匐生长于培养基内，吸收营养，也称基内菌丝。一般无
隔膜，直径0.2-0.8 μm，长度差别很大，有的可产生色素。
[实验目的]
1. 学习细菌革兰氏染色原理和方法 2. 学习放线菌培养观察方法 3. 观察细菌形态及运动（活体观察）
[实验材料] 1. 菌种
简述菌株革兰氏染色后的观察结果
简述菌株革兰氏染色后的观察结果
在微生物学领域中，革兰氏染色是一种常用的染色技术，通过染色可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
革兰氏染色的原理是利用细菌细胞壁的不同结构特点来区分不同类型的细菌。
在进行革兰氏染色后，观察结果通常可以分为以下几个方面：
1. 革兰氏阳性菌的观察结果：
革兰氏阳性菌在染色后呈紫色或紫蓝色，这是因为它们细胞壁含有较多的革兰氏染色阳性物质，如壁多糖和蛋白多糖。
在显微镜下观察，可以看到这些菌细胞呈现出紫色或紫蓝色的颜色，通常形态较为规则，细胞壁较厚，且在细胞壁内外均有革兰氏阳性物质分布。
2. 革兰氏阴性菌的观察结果：
革兰氏阴性菌在染色后呈粉红色或粉红红色，这是因为它们细胞壁中的革兰氏染色阴性物质较多，如脂多糖。
在显微镜下观察，可以看到这些菌细胞呈现出粉红色或粉红红色的颜色，通常形态较为不规则，细胞壁较薄，且在细胞壁内外只有少量的革兰氏阴性物质分布。
3. 其他观察结果：
除了革兰氏阳性和阴性菌外，有时在染色后还会观察到一些特殊的细菌。
比如，有些细菌在革兰氏染色中呈现出不规则的颜色，可能是由于其细胞壁结构与传统的革兰氏阳性或阴性菌有所不同。
此时
需要进一步进行细菌鉴定，以确定其真实的细菌类型。
总的来说，革兰氏染色是一种简单而有效的细菌分类方法，通过观察染色后的细菌颜色和形态特征，可以初步判断细菌的类型。
然而，在实际操作中，还需要结合其他鉴定方法和技术，如生化试验、分子生物学方法等，来对细菌进行更准确的鉴定和分类。
革兰氏染色的观察结果只是鉴定细菌的第一步，只有综合多种方法才能准确判断细菌的种类和特性。
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下一个实验
二、实验原理---革兰氏染色
• 革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结 晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇 (或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。 经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的 细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被 脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红 色)，该菌属于革兰氏阴性菌。
实验报告注意事项
• 1.上课前必须写好预习实验报告 • 2. 实验报告内容必须填写完整，如 实验 课程，实验时间，指导教师等 • 3. 本次实验结束后必须记录好原始记录， 由老师签完名后方可离开 • 4. 值日生打扫卫生 • 5.实验成绩占期末总评成绩的20%
• 实验二：细菌特殊结构的染色与观察
二、实验原理---简单染色
• 染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀 死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其 对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定 两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形。
二、实验原理---简单染色
• 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和 革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法 是细菌学中最重要的鉴别染色法。 • 革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性 和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结 构和组成不同决定的。
实验一
细菌的革兰氏染色和 形态观察
球菌
杆菌
弧菌
实验一 细菌的革兰氏染色和形态 观察
• 一、实验目的
• • • • 1、掌握无菌操作技术和细菌抹片的制备方法 2、学习掌握单染色的操作技术 3、了解革兰氏染色机理，并掌握其操作技术 4、 熟悉显微镜的使用、学习并掌握油镜的原 理和使用方法
• 细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别， 必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使 经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地 观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形 状和细菌排列的观察。 • 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱 酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离 时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部 分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与 背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简 单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解 糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时 可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
附：油镜的使用
双目显微镜
单目显微镜
2.油镜的原理
•
油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线通过空气时， 因介质折光率不同，光线将发生散射现象，使射入镜 筒的光线很少，物象不清。若在油镜与玻璃片之间加 入与玻璃折射率相近的香柏油，则使通过的光线不至 因折射而减弱，因此能清楚地看到物象。
双层瓶
香柏油
二甲苯
二、实验原理---革兰氏染色
三、实验器材
• 1、菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌斜 面菌种。 • 2、显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、 接种环、吸水纸、盖玻片、试管、水浴 锅。 • 3、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、 95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水、双 层瓶（香柏油和二甲苯）。
四、实验方法和步骤 细菌的简单染色
二、实验原理---革兰氏染色
• 当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染 成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成 结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。 当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰 氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成， 壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、 使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶 紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染 后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其 细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时， 类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞 被染上复染剂的红色。。
• • • • 1、涂片：用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸 馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充 分混匀涂成薄膜。 2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。 4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂 面染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的 水变无色为止（注：勿冲去菌体）。 6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。 7、镜检：油镜观察并绘图。
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• •
四、实验步骤
1、菌落形态观察：
滴加少量水 注意：菌落颜色、湿度、形状、大小、透明度、 2、细菌简单染色：
3、细菌革兰氏染色。
干燥→镜检
挑取菌体 注意事项：
颜色、边缘是否规则等特征。 染色过程：
涂片→干燥→固定→染色（1min）→水洗→
涂片 干燥
涂片：取菌量不能太大
干燥：自然干燥
固定 染色 水洗：水流不能直接冲在涂菌处 水洗 干燥
染色结果
金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果
染色结果
大肠杆菌革兰氏Βιβλιοθήκη 色结果染色结果金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果
显微镜放大倍数＝物镜放大倍数×目镜放大倍数 四、实验结果
• 绘图记录观察结果
思考题
• 1、在制作涂片中，为什么要进行固定这 一步？ • 2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？
2. 革兰氏染色
• 1）、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端1/4 处下面用记号笔分别标明S和E（见图示），并 滴一滴蒸馏水，分别将金黄色葡萄球菌和大肠 杆菌涂布在相应的区域内。
2. 革兰氏染色
2、干燥与固定：方法同（一）中2，3 步骤 3、染色：
结晶紫染色1-2分钟--水洗--碘液 媒染1-2分钟--水洗--酒精脱色15-20 秒--水洗--番红复染色2-3分钟--水洗 --干燥--镜检记录。