工业微生物菌种的选育——诱变选育(1)
微生物菌种的选育和保藏--诱变育种
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢诱变处理： ➢诱变剂的处理方式： ✔单因子处理：采用单一诱变剂处理出发菌株； ✔复合因子处理：两种以上诱变因子共同诱发菌体突变，包括①两种或多种 诱变剂先后使用；②同一种诱变剂的重复使用；③两种或多种诱变剂的同时使用。 ➢诱变剂的处理方法： ✔直接处理方法：将菌悬液用物理、化学因子处理，然后涂平板分离突变株； ✔生长过程处理法：适用于诱变作用强而杀菌率较低的诱变剂，或在分裂过 程中只对DNA起作用的诱变剂，如NTG、LiCl、 秋水仙碱等；方法：可将诱变剂 加入培养基后涂平板；或先把培养基制成平板，将一定浓度的诱变剂和菌体加入平 板； 或摇瓶振荡培养处理；
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 制备单孢子(或单细胞)悬液： ➢ 目的：获得单孢子(或单细胞)均匀的悬液；
➢ 原因: 分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落；
➢ 方法:✔菌龄:对数期细胞、刚成熟的孢子母菌细胞悬浮液的浓度为106个/mL、
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 突变株的分离与筛选： ➢ 筛选方案:
➢ 筛选方法： ✔初筛：a.随机筛选：也称摇瓶筛选；随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选； b.平板菌落预筛：在培养皿上诱变后从试样检出突变体的一种
琼脂平板筛选法,有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等; ✔复筛:对突变株的生产性能作比较精确的定量测定工作，代表方法：琼脂
放线 菌或细菌的浓度为108个/ mL左右;
✔菌悬液配制方法:离心洗涤前培养物，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬 液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min,令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。 通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 诱变处理： ➢ 诱变剂种类的选择：物理诱变剂和化学诱变剂 ✔物理诱变剂：紫外线、χ射线、γ射线、等离子、快中子、ɑ射线、β射线、 超声波等； ✔化学诱变剂: 碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等； ➢ 最适诱变剂量选择： ✔诱变剂剂量表示方式：a.UV的剂量指强度与作用时间的乘积； b.化学诱变剂剂量：诱变剂的浓度和作用 时间的乘 积来表示； c.在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂 的相对剂量； ✔最适诱变剂量确定：a.依据：最适剂量应该使所希望得到的突变株在存活 群体中占有最大的比例； b.方法：通过比较剂量--存活率曲线和剂量-
工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）
工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）来源：青岛海博优良菌株的选育的目的是防止菌种退、解决生产实际问题、提高产品质量和开发新产品。
选育的方法主要有基于基因突变的自然选育和诱变育种以及基于基因重组的杂交、原生质体融合、基因工程等。
诱变选育诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。
诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。
诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。
诱变育种的步骤与方法（一）、工业育种的一般步骤（图）（二）、诱变育种方案设计诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。
1、出发菌株的选择工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。
出发菌株选择目前主要依据实际经验，总结如下：①以单倍体纯种为出发菌株；②采用具有优良性状的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。
2、出发菌株的纯化为什么要对出发菌株进行纯化呢？这是因为微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。
生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。
这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。
通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。
常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子。
3、单孢子悬液的制备诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。
首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。
第六章微生物诱变育种
一、出发菌株的选择
1、出发菌株的来源：主要有三方面
(1)自然界直接分离到的野生型菌株 • 这些菌株的特点是它们的酶系统完整，染色体或 DNA未损伤，但它们的生产性能通常很差（这正是 它们能在大自然中生存的原因）。通过诱变育种，
它们正突变(即产量或质量性状向好的方向改变)
的可能性大。
(2)经历过生产条件考验的菌株
3、诱变处理方法
（１）、紫外线和光照复活的交替处理
• 应用光照复活现象能使紫外线诱变作用得 到显著增强。 • 一次紫外线处理后，光照复活一次，突变 率降低；但是，增加剂量再次用紫外线照 射处理，光照复活后，突变率提高了。若 多次进行该处理，则突变率增加更大。
（２）诱变剂复合处理
• 诱变育种中还常常采取诱变剂的复合处理。 因为每种诱变剂有各自的作用方式，引起 的变异有局限性，复合处理则可扩大突变 的位点范围，使它们产生协同效应，获得 正突变菌株的可能性增大，因此，诱变剂 复合处理的效果往往好于单独处理.
因此，应让变异处理后细胞在液体培养基中培养 几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以 得到纯的变异细胞。这样，稳定的变异就会显现 出来。 若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分 离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌 落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果 的不稳定和将来的菌株退化。
9.7 16.6
五、中间培养
表型延迟：指某一突变在DNA复制和细胞分裂后， 才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。 表型延迟现象的出现是因为对数期细胞往往是多 核的，很可能一个核发生突变，而另一个核未突变， 若突变性状是隐性的，在当代并不表现出来，在筛 选时就会被淘汰；若突变性状是显性的，那么，在 当代就表现出来，但在进一步传代后，就会出现分 离现象，造成生产性状衰退。 所以应尽可能选择孢子或单倍体的细胞作为诱变 对象。
发酵工业菌种选育 诱变育种
诱变育种具有方法简单、快速和收效显著等特点，仍是目前被广泛使用的主要育种手段。 当前发酵工业中使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的菌株。诱变育种除能提高产量外, 还可达到改善产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的。
诱变育种的一般步骤
1）出发菌株的选择2）单细胞（或单孢子）悬液制备3）诱变剂和使用剂量的选择4）变异株的初筛5）变异株的复筛6）变异株稳定性试验7）菌种特性考察8）中试验证9）大型投产试验
得单细胞悬液的方法必须具有针对性，对产抱子或芽抱的微生物最好用其孢子或芽孢。
在实际工作中，要得到均匀分散的细胞悬液，通常可用无菌的玻璃珠来打散成团的细胞.然后再用脱脂棉花或滤纸过滤。
常用的物理诱变剂处理方法
常用的物理诱变剂处理方法
01
02
后培养与稀释涂布
紫外线照射
处理前先开紫外灯预热20min，使光波稳定。然后，取30ml菌悬液置于7cm培养皿中，并置于诱变箱内的磁力搅拌器上，离灯管一定距离，打开皿盖，暴露子紫外线下照射一定时间，边照射边搅拌，力求使细胞均匀吸收紫外线光波。经过紫外线诱变后的菌体转入无菌试管内，置于冰水中浸1-2h，抑制修复酶类的活性，使修复难以进行，有利于提高突变率。
1.亚硝酸诱变
在多核细胞中，仍然采用高剂量，因为在高剂量诱变时，除个别核发生突变外，其他核均被致死，可形成较纯的变异菌落，同也造成遗传物质的巨大损伤，可减少回复突变。
诱变育种的一般原则
诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。
4.单袍了(或单细胞)悬液的制备
细胞的生理状态对诱变处理会产生很大的影响，细菌一般在对数生长期的诱变处理效果较好，而霉菌和放线菌的分生孢子在稍加萌发时进行诱变处理可提高诱变效率。分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，避免长出不纯的菌落。
（生物工程）微生物菌种选育实验
微生物菌种选育一、实验目的1．了解诱变育种的基本原理。
2．学习用诱变育种筛选高产菌株的基本方法。
二、实验内容：1、蛋白酶产生菌枯草芽孢杆菌的诱变选育2、淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌的诱变选育三、实验原理自然界中分离所得的野生菌株其发酵活力一般很低，必须经过人工选育得到突变株，或通过细胞或基因工程操作成为工程菌后才能用于工业化生产。
突变可自发产生，也可诱发产生，但自发突变的频率往往很低，而诱发突变可大大提高突变频率。
所谓诱变就是用物理或化学诱变剂处理均匀分散的细胞群，促使其突变频率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学实验之用。
诱变可由化学或物理因素引起，其中紫外线是一种最简单、最常用的物理诱变剂，它能使DNA 链中两个相邻的嘧啶核苷酸形成二聚体而影响DNA的正常复制，从而造成基因突变。
诱变育种时应遵循以下几个原则：(1)选择简便有效的诱变剂；(2)挑选优良的出发菌株，如生产中选育过的自然变异菌株，或是有利性状多的菌株；(3)处理单孢子或单细胞悬液，以使诱变剂接触均匀，避免长出不纯菌落；(4)选用合适生理状态的细胞，细菌一般以对数期为好，孢子以稍加萌发后为好；(5)选用合适的诱变剂量，凡在高诱变率的基础上既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量就是最适剂量，对质量性状的诱变拟采用高致死剂量(95％~99％的致死率)，而对产量性状，一般认为正变常出现在偏低剂量(75％~80％的致死率)中；(6)利用复合处理的协同效应，两种或多种诱变剂先后或同时使用，或同一种诱变剂重复使用；(7)设计和采用高效筛选方案；(8)创造和利用形态、生理与产量间的相关指标，以提高筛选效率。
物理诱变因子中以紫外线辐射的使用最为普遍，其他物理诱变因子则受设备条件的限制，难以普及。
一般用于诱变育种的物理因子有快种子、60Co、γ-射线和高能电子流β-射线等。
紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有80％左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。
第三章工业微生物菌种选育已
1.1.3 从前突变到突变 诱变剂造成的DNA分子的某一位置的结构改变
称为前突变。前突变可以通过影响DNA复制而 成为真正的突变，也可以经过修复不发生突变。 一般认为光复活作用、切补修复和DNA多聚酶 的校正作用具有校正功能而不利于突变的诱发， 而重组修复和SOS修复系统具有引起差错的性 质而有利于突变的发生。
第三章工业微生物菌种选育已
（E）DNA多聚酶的校正作用
除了上述种种修复作用以外，细胞还具有对复制过程中出 现的差错加以校正的功能。大肠杆菌中的DNA复制依赖于 三种DNA多聚酶的作用，这三种酶除了对于多核苷酸的多 聚作用以外，还具有3′到5′核酸外切酶的作用。一般认为 依靠DNA多聚酶的这一作用，能在复制过程中随时切除不 正常的核苷酸。如果DNA多聚酶发生突变而使其核酸外切 酶活性减弱，那么它切除不正常核苷酸的能力减弱，菌体 的突变率相应地提高，成为增变突变型，DNA多聚酶为 DNA修复作用所必需，所以增变突变型对于诱变剂的作用 格外敏感。
第三章工业微生物菌种选育已
生理性延迟： 在突变基因已经为纯的状态后，突变表型
还不一定出现，必须等到原有基因的产物 稀释到某一程度才表现出来，而这些原有 基因产物的浓度降低到能改变表型的临界 水平前，细胞已经分裂多次，经过多个世 代。（如噬菌体菌株的表达会出现）
第三章工业微生物菌种选育已
2.诱变育种的方案设计 诱变育种包括三个环节：突变的诱发、
第三章工业微生物菌种选育已
一切影响DNA修复系统中酶活性以及与突变相 关的酶活性的因素都能影响由前突变向突变的 转变。
例如：咖啡碱能抑制切补修复系统，从而增强 诱变作用；SOS修复系统和重组修复依赖于蛋 白质合成，因而利于蛋白质合成的因素有利于 提高突变率；Ba2+ （钡）通过对DNA多聚酶的 3’核酸外切酶活性的抑制提高突变率。
工业微生物菌种的选育——诱变选育（2）
工业微生物菌种的选育——诱变选育（2）工业微生物菌种的选育——诱变选育（2）来源：青岛海博突变菌株分离和筛选方法（1）、随机筛选又称摇瓶筛选，该法主要是随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选，做法是：将诱变处理后的菌体分离在琼脂平板上，培养后随机挑选菌落，一个菌落移入一支斜面，一个斜面的菌体接入一只三角瓶，振荡培养，根据测定产物活性，决定取舍。
优点是发酵过程的生产条件、生理条件与大规模生产条件相近，可以模拟进行。
（2）、平板菌落预筛A、根据形态筛选突变株部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性。
B、根据平板菌落生化反应筛选变株透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、浑浊圈法等。
C、采用冷敏感菌筛选抗生素变株主要用来筛选抗生素产生菌株。
冷敏菌：从人的病原菌中经诱变分离出的，在20℃下不能生长。
筛选原理：将冷敏菌和诱变后的放线菌孢子悬浮液混合，分离在同一培养基平板上，置于20℃培养3-4天，抗生素产生菌不受干扰，能正常形成菌落，冷敏菌不生长。
当放线菌菌落成熟，并且抗生素产量达高峰，将培养皿移至37℃培养18-24h,冷敏菌迅速生长，而此时在抗生素产生菌落周围的冷敏菌因生长受到抑制而形成抑菌圈。
根据菌落直径和抑菌圈直径之比的有效值，可以直接筛选出抗生素高产突变株。
D、浓度梯度法主要用来筛选抗生素产生菌株。
原理：菌株产生抗生素水平受到它自身所产抗生素数量的制约，耐受性越高，抗生素产生能力也就越强。
通常采用双层法制浓度梯度平板，用涂布法接种，培养后，挑取高浓度抗生素区域的菌落，易于筛选到抗性变株。
摇瓶液体培养产物活性鉴定摇瓶初筛阶段测定产物的几种简便方法。
（1）、琼脂平板活性圈法该法是在特制的玻璃框琼脂平板上进行的，以检验菌或底物与一定量的琼脂制成平板，用专制的打孔器取出琼脂块，在留下的圆孔中加入发酵液，或用圆滤纸片浸透发酵液直接覆于琼脂平板上，在适合温度下培养一定时间，测量圆孔或滤纸片周围形成的抑菌圈或水解圈，根据活性圈的大小挑选高产菌株。
工业菌种的选育方法
工业菌种的选育方法
1. 自然选育可别小瞧呀！就像在茫茫人海中找那个最特别的人一样。
比如说在一堆野生菌中，找出那个具有独特优良性状的菌种，不就是在自然中寻宝嘛！这种方法简单直接，有时候还真能有意外惊喜呢。
2. 诱变选育那真是相当厉害呢！就像给菌种来了一场大变身的魔法。
就好比给小麦菌种进行诱变，让它产生新的特性，这不就是在创造奇迹嘛！
3. 杂交选育就像是一场菌种的联姻呀！把两个优秀的菌种结合在一起，期望诞生出更棒的后代。
比如把一个高产的菌种和一个抗逆性强的菌种杂交，说不定就能得到一个完美的“宝宝”呢！
4. 基因工程选育简直酷到没朋友呀！这就像是直接对菌种的基因进行雕琢。
像科学家们改造大肠杆菌的基因，让它能够生产药物，这多神奇呀！
5. 原生质体融合选育多有趣呀！就如同让两个菌种打破隔阂，融合在一起。
想象一下把两种不同特性的微生物通过这种方法融合，那会带来怎样的新奇变化呢！
6. 筛选和鉴定选育那可是关键步骤呀！就如沙里淘金一样。
从大量的菌种中仔细甄别，找出那个真正的“金子”。
比如在一堆工业菌种里，一点点地筛选鉴定出最符合要求的那个，这得需要多大的耐心和智慧呀！
我觉得这些工业菌种的选育方法都各有特点和优势，在不同的场景下都能发挥重要的作用呢！为我们的工业生产带来了巨大的帮助呀！。
工业微生物菌种的选育
工业微生物菌种的选育第三节工业微生物菌种的选育用发酵法生产产品，首先要有一个良好的菌种。
因此必须进行菌种选育工作。
菌种选育工作大幅度提高了微生物发酵的产量，促进了微生物发酵工业的迅速发展。
通过菌种选育，抗生素、氨基酸、维生素、药用酶等产物的发酵产量提高了几十倍、几百倍、甚至几千倍。
菌种选育在提高产品质量、增加品种、改善工艺条件和生产菌的遗传学研究等方面也发挥重大作用。
菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。
菌种选育包括经验育种和定向育种，其中经验育种又分自然选育和诱变育种。
在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变（亦称自然突变）而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育。
由于野生菌株生产能力低，往往不能满足工业上的需要。
因为在正常生理条件下，微生物依靠其代谢调节系统，趋向于快速生长和繁殖。
但是，发酵工业生产，需要培养微生物使之积累大量的代谢产物。
为此，采用种种措施来打破菌的正常代谢，对代谢流进行调节控制，从而大量积累我们所需要的代谢产物。
例如青霉素的原始生产菌种产生黄色色素，使成品带黄色，经过菌种选育，生产菌不再分泌黄色色素；土霉素产生菌在培养过程中产生大量泡沫，经诱变处理后改变了遗传特性，发酵泡沫减少，可节省大量消泡剂并增加培养液的装量；红霉素等品种发酵遇有噬菌体侵袭时，发酵产量大幅度下降，甚至被迫停产，菌种经诱变处理获得抗噬菌体的特性，就可保证发酵生产的正常进行。
自然选育自然选育包括从自然界分离获得菌株和根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。
⒈ 从自然界分离获得菌株从自然界分离新菌种一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。
⑴ 采样采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合、具体地分析来决定。
如果预先不了解某种生产菌的具体来源，一般可从土壤中分离。
采样的方法多是在选好地点后，用小铲去除表土，取离地面5～15 cm处的土壤几十克，盛入预先消毒好的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况等，以备考查。
第二节 工业微生物菌种选育
1.选择出发菌株
• 出发菌株是指用于诱变的原始菌种。 • 选择原则：菌种对诱变剂的敏感性强、变 异幅度大、产量高。 • 获得途径： （1）从自然界的土样或水样中分离出来的野 生型菌种； （2）生产中正在使用的菌种； （3）从菌种保藏机构购买
2.同步培养
• 培养中的细胞不处于同一生长阶段，它们 的生理状态和代谢活动也不完全一样。 • 同步培养法：使培养的微生物比较一致， 生长发育在同一阶段上的培养方法。 • 在诱变育种前，最好选用生理状态一致的 单细胞或单孢界直接分离筛选菌种的步骤
• 1.采样： （1）选择采样地点 中性偏碱：细菌和放线菌多 酸性红土壤及森林土壤：霉菌多 果园、菜园、野果生长区（富含碳水化合物）和沼泽池：酵母和霉 菌多。 （2）确定采样时间 秋初好：温度适中，雨量不多。 夏季或冬季土壤微生物存活量少，暴雨后显著减少。 （3）采样 5cm~15cm处取土。放在牛皮纸袋或玻璃屏或聚乙烯袋中，标明 样品种类、采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等 采集的样品应及时处理，暂不处理应放在4℃保存。
机械法 （选择法） 离心沉降分离法
同步培养方法 诱导法 温度调整法
膜洗脱法
营养条件调整法
特点：同步生长只能维持几代
机械法
膜洗脱法
通过大小不同 的微孔过滤器
离心沉降分离法
小细胞 沉淀慢
• 主要通过控制环境条件：如温度、营养物质等来诱导同步生 长。 • （1）温度调整法 • 将温度控制在接近最适温度条件下一段时间，缓慢进行新陈 代谢，但不进行分裂。然后再将温度提高到最适生长温度， 大多数细胞进行同步分裂。 • （2）营养条件调整法 • 控制培养基的浓度或培养基的组成以达到同步生长。例如限 制碳源或其他营养物，使细胞只能进行一次分裂而不能继续 生长，从而获得刚分裂的细胞群体，然后转入适宜的培养基 中，它们便进入了同步生长。 • 另外有在培养基中加入某种抑制蛋白质合成的物质（如氯霉 素）诱导一定时间后再转到另一种完全培养基中培养；或用 紫外线处理；对光合行微生物的菌体可采用光照与黑暗交替 处理法等。 • 总之：不管采用哪种诱导因子，都必须具有以下特性：不影 响生物的生长，但可特异性地抑制细胞分裂，当移去（或消 除）该抑制条件后，微生物又可立即同时出现分裂。
现代工业微生物育种
现代工业微生物育种一、诱变育种诱变育种是通过使用物理或化学方法，如紫外线、X射线、化学诱变剂等，诱导微生物发生基因突变，从而产生具有新性状的菌株。
这种方法可以大幅度提高微生物的变异频率，为育种工作提供了丰富的材料。
二、基因工程育种基因工程育种是通过人工构建基因表达载体，将其导入到微生物中，从而实现基因的转移和表达。
这种方法可以定向地改造微生物的遗传物质，使其表达出所需的性状。
基因工程育种具有高度定向性和可预测性，是现代工业微生物育种的重要手段之一。
三、代谢工程育种代谢工程育种是通过改变微生物的代谢途径，提高其代谢产物的产量或改变代谢产物的性质，从而获得所需的菌株。
这种方法需要对微生物的代谢过程有深入的了解，并能够精确地调控其代谢网络。
代谢工程育种在现代工业微生物育种中具有重要的应用价值。
四、组合生物合成育种组合生物合成育种是通过构建多个基因的组合文库，并筛选出具有所需性状的菌株。
这种方法类似于基因工程育种，但具有更高的遗传复杂性，可以创造出更丰富的变异类型。
组合生物合成育种在现代工业微生物育种中已经成为一种重要的策略。
五、定向进化育种定向进化育种是一种模拟自然进化过程的育种方法。
它通过对大量随机突变体进行筛选和选择，以实现所需性状的定向进化和优化。
定向进化育种可以在短时间内获得高度适应特定条件的优良菌株，具有很高的应用价值。
六、菌种保藏与复壮菌种保藏与复壮是工业微生物育种的重要环节。
通过科学的保藏方法，可以保持菌种的活力和遗传稳定性；而复壮则是通过一定的手段使保藏的菌种恢复活力，以保证其用于生产的性能。
七、基因组编辑育种基因组编辑育种是利用基因编辑技术对微生物基因组进行精确的编辑和改造，以实现定向改良和创造新品种的目的。
目前常用的基因组编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、ZFNs和TALENs等。
基因组编辑育种具有高度精确性和可控性，为现代工业微生物育种提供了强有力的工具。
诱变育种1
微生物诱变育种大家好，我硕士期间做的实验跟微生物诱变育种有关，主要方法有物理诱变、化学诱变、和离子注入等。
期间，我从最基本的做起，摸索实验方法，走了很多弯路，不过还好，顺利毕业啦，如果你们有什么问题，我们可以互相探讨一下，尽量让大家避免同样的错误，对吧。
我实验过程中，从选菌株，定试剂，找仪器，摸索实验方法，都是自己一步一步走过来的，很辛苦，也学到了很多东西。
大家可以交流一下，我一定知无不言，言无不尽。
哇咔咔！--------------------------------------------------------------------------------麻烦问以下丙酮丁醇梭菌诱变的方法,以及用什么方法可以筛选出来.用改变培养基的方法还是用其他什么方法?谢谢了--------------------------------------------------------------------------------我还想问我的丙酮丁醇梭菌在4度冰箱里面放,为什么有的培养基融化了?请指教谢谢了? --------------------------------------------------------------------------------以下是我参编的教材之一章——第十一章菌种选育与保藏菌种选育(selection strain)的目的是改良或改变菌种的特性，使其符合工业生产或科研的要求。
菌种选育过程由三个环节组成：一是使菌种产生变异；二是筛选出变异的菌株；三是使变异菌株的特性得到表达。
根据使菌种产生变异的方式的不同，菌种选育可分为自然选育、诱变育种、杂交育种、基因工程这四种方法。
自然选育、诱变育种是利用基因突变来获得优良菌种，具有改良菌种特性的性质。
杂交育种、基因工程是通过DNA重组来获得优良菌种，具有改变菌种特性的性质。
菌种选育技术的应用大幅度提高了微生物发酵产量，促进了微生物发酵工业的发展。
工业发酵菌种选育(1)
➢光谱范围与有效光谱范围
40-390nm
200-300nm；260nm
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• 紫外线诱变一般采用15W紫外线杀 菌 灯 ． 灯 与 处 理 物 的 距 离 为 15 ～ 30cm，照射时间依菌种而异，一般 为几秒至几十分钟。一般我们常以 细胞的死亡率表示，希望照射的剂 量死亡率控制在70～80%为宜。
21
• 被照射的菌悬液细胞数，细菌为106个 ／ml左右，霉菌孢子和酵母细胞为106～ 107个／ml。由于紫外线穿透力不强，要 求照射液不要太深，约0.5～1.0cm厚，同 时要用电磁搅拌器或手工进行搅拌，使 照射均匀。
• 由于紫外线照射后有光复活效应，所以 照射时和照射后的处理应在红灯下进行。
工业发酵菌种选育
1
诱变育种
• 以微生物的自然变异作为基础的生产选 种的机率并不很高，一个基因的自然突 变频率仅10-6-10-10左右。
• 诱变育种：以诱发突变为基础的育种， 是迄今为止国内外提高菌种产量、性能 的主要手段。
2
诱变育种的意义及特点
* 适于改良品种的个别性状 * 育种程序简单，年限短 * 变异的方向和性质不定 * 与其它育种方法结合使用，将发挥巨大
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(五)分离和筛选
• 筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量 的达到初步要求的分离菌落为目的，以量 为主。
• 复筛则是精选，以质为主，也就是以精确 度为主。因此在具体方法上就有差异。
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（二）诱变育种应注意的问题
诱变成功的关键： ➢出发菌株的选择 ➢诱变因素的选择 ➢诱变剂量的选择 ➢单孢子（或单细胞）悬液的制备
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(二)操作步骤
1．将细菌培养液以3000r／min离心5min，倾 去上清液，将菌体打散加入无菌生理盐水再 离心洗涤。 2．将菌悬液放入一巳灭菌的，装有玻璃珠的 三角瓶内用手摇动，以打散菌体。将菌液倒 入有定性滤纸的漏斗内过滤，单细胞滤液装 入试管内，一般处于浑浊态的细胞液含细胞 数可达108个／ml左右，作为待处理菌悬液。
工业微生物诱变育种
四．摇瓶液体培养
常规随机筛选的全过程，都要通过摇瓶培养，而 平板菌落筛选是经过平板菌落预筛后，弃去大量 低产菌株，被挑选的菌落移入试管斜面，然后再 迸行摇瓶液体培养；才艳逐步地筛选出高产菌株。
产物活性测 定
一．琼脂平板活性圈法
二．滤纸片法
三．琼脂薄层纸片法
○ 筛选菌种为一种重复性和计量性的工作，所 以必须应用统什方法。区别并肯定其产量上 的差异。以便迸行下轮育种的评估。
处理具体方法
一．直接处理方式，将菌悬液用物理、化学因子处 理，然后分离，直接处理是最常用的方式。
二．生长过程处理，适用于诱变作用强的而杀菌率 较低的诱变剂，或在分裂过程中只对DNA起作 用的诱变剂，如NTG、秋本仙碱等。
六．影响突变体的因素
七．菌种遗传特性不同
八．菌体细胞壁结构
○ 丝状菌孢子壁的厚度及表面的蜡质会阻碍诱变剂渗人细胞，减弱与 DNA的作用。一般加大诱变剂量，效果会好一些。有的微生物细胞壁 含有蜡质，常用一定浓度的洗衣粉、脂肪酶处理，除去蜡质，提高诱变 效果。
解除反馈抑制筛选模型 一二．初筛来用大通量的琼脂块法 一三．结合饰变育种
原生质体作为诱变材料
制备原生质体，用0.6％纤维素酶+0.6%蜗牛酶处理 3h， 0.6％ NaCI＋0.3%CaCl2作稳定剂，可获得 原生质体。采用麸皮＋琼脂粉作为再生培养基。
将菌体制备成原生质体后，用UV、和He-Ne，激光 进行诱变。经筛选发现，原生质体对诱变剂的敏感 性要比孢子大得多。
实践证明并非所有的诱变剂对某个出发菌株都是有效的。一种 诱变剂对A菌株有较高的诱变效应；对B菌株则可能相反。不 同微生物对同一种诱变剂敏感性有很大区别。
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选择诱变剂
选择诱变剂时要注意选择专一性比较强的诱变剂。
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工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）工业微生物菌种的选育——诱变选育（1）诱变选育诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。
诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。
诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。
诱变育种的步骤与方法（一）、工业育种的一般步骤（图）（二）、诱变育种方案设计诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。
1、出发菌株的选择工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。
出发菌株选择目前主要依据实际经验，总结如下：①以单倍体纯种为出发菌株；②采用具有优良性状的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。
2、出发菌株的纯化为什么要对出发菌株进行纯化呢？这是因为微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。
生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。
这些都会造成细胞内遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。
通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。
常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子。
3、单孢子悬液的制备诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。
首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。
其次是分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。
由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。
若诱变剂产生的突变只在DNA双链中的某一条单链，故该突变无法反映在当代的表型上。
只经过DNA的复制和细胞分裂，表型才会发生变异，出现不纯菌落，这就叫表型延迟(phenotypic lag) 。
不纯菌落的存在，也是诱变育种工作中初分离的菌株经传代后很快出现生产性状“衰退”的主要原因。
（1）供试菌株的孢子或菌体的选择供试细胞要新培养的，细胞生理活性既要同步，又要在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也好。
对细菌来说，常常通过前培养达到要求。
菌悬液中的菌体应该是单细胞或单核的孢子，不但能均匀地接触诱变剂，还可减少分离现象发生。
在实际工作中，要得到均匀分散的细胞悬液，通常可用无菌的玻璃珠来打散成团的细胞，然后再用脱脂棉或滤纸过滤。
菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞10 6 ~ 10 7 个/ml，放线菌或细菌10 8 个/ml。
菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。
有时，也需用0.1mol/L磷酸缓冲液稀释，因为有些化学诱变剂处理时，常会改变反应液的pH 值。
（2）菌悬液制备方法细菌：在诱变处理前进行摇瓶振荡培养，利用温度和碳源控制其同步生长，离心洗涤，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬液，放在有玻璃珠的三角瓶内振荡10min，用无菌脱脂棉或滤纸过滤，通过菌体计数，调整菌悬液的浓度。
孢子：在试验中尽量采用成熟而成熟的孢子，并置于液体培养基中振荡培养到孢子刚萌发，即芽长相当孢子直径0.5－1倍。
离心洗涤，加入生理盐水或缓冲液，振荡打碎孢子团块，以脱脂棉过滤，计数，调整菌体浓度供诱变处理。
对不产孢的真菌，可直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理。
4、诱变剂的种类和选择A、诱变剂种类的选择物理诱变剂包括：各种射线，如紫外线（焦耳）、X射线（库仑/千克）、β射线、γ射线、α射线和超声波等；化学诱变剂包括甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。
选择诱变剂要根据诱变剂作用机制，结合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂，同时要考虑菌种特性和遗传稳定性。
同时还要参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂。
对遗传稳定的菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂进行复合处理，然后再采用一些作用较缓的诱变剂处理。
对遗传不稳定的菌株，首先进行自然分离，划分菌落类型，从中选择效价高的、性能好的一类菌落作为诱变处理的出发菌株。
采用温和诱变剂或对该类菌剂进行继续处理，从中筛选突变体。
并结合自然分离和环境条件的改变，使有效的菌落类型不断增加，成为正常型菌落。
在诱变之前还要考查出发菌株的诱变系谱，详细分析，总结规律性，选择一种最佳的诱变剂。
B、最适诱变剂量的选择诱变的最适剂量，应该使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大比例，这样可减少以后的筛选工作。
要确定一个合适的剂量，通常要经过多次试验。
就一般微生物而言，诱变频率往往随剂量的增高而增高，但达到一定剂量后，再提高剂量会使诱变频率下降。
根据对紫外线、x 射线及乙烯亚胺等诱变剂诱变效应的研究，发现正突变较多地出现在较低的剂量中。
而负突变则较多地出现在高剂量中，同时还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，高剂量更容易出现负突变。
因此，在诱变育种工作中，目前较倾向于采用较低剂量。
例如，过去在用紫外线作诱变剂时，常采用杀菌率为90—99.9%的剂量，而近年来则倾向于采用杀菌率为70%～75%，甚至更低(30%～70%)的剂量，特别是对于经多次诱变后的高产菌株更是如此。
化学诱变剂主要是调节浓度、处理时间和处理条件（温度、pH等）。
物理诱变剂主要控制照射距离、时间和照射过程中的条件（氧、水等），以达到最佳的诱变效果。
5、诱变处理A、不同诱变处理方法（1）紫外线照射由于紫外线不需要特殊贵重设备，只要普通的灭菌紫外灯管即能做到，而且诱变效果也很显著，因此被广泛应用于工业育种。
紫外线诱变育种的原理是：紫外线是波长短于紫色可见光而又紧接紫色光的射线、波长范围为136～300nm，紫外线波长范围虽宽，但有效范围仅限于一个小区域，多种微生物最敏感的波长集中在265nm处，对应于功率为15W的紫外灯。
它是一种非电离辐射，当物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子将被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而造成突变；而不吸收紫外线的物质，能量不发生转移，分子也不会激发，不会产生任何化学变化，然而，脱氧核糖核酸能大量吸收紫外线，因此它极容易受紫外线的影响而变化。
紫外线的诱变作用是由于它引起DNA分子结构变化而造成的。
这种变化包括DNA链的断裂，DNA分子内和分子间的交连，核酸与蛋白质的交联，嘧啶水合物和嘧啶二聚体的产生等，特别是嘧啶二聚体的产生对于DNA的变化起主要作用。
紫外线诱变方法：将10mL菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器，使用15w功率紫外灯管，照射距离为30cm左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理10 min左右。
为准确起见，照射前紫外灯应先预热20~30min，然后再进行处理。
不同的微生物对于紫外线的敏感程度不一样，因此不同的微生物对于诱变所需要的剂量也不同。
在紫外灯的功率、照射距离已定的情况下，决定照射剂量的只有照射时间，这样可以设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适当的照射剂量。
一般以照射后微生物的致死率在90%~99.9% 的剂量为最佳照射剂量，近来也有倾向于采用杀菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的剂量。
一般认为，偏低的剂量处理后正突变率较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。
目前趋向采用低剂量、长时间处理，尽管致死率较高，而诱变效果较好。
实验时，为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选。
（2）CO60 照射CO60属γ射线，是一种高能电磁波，其诱发的突变率和射线剂量直接有关，而与时间长短无关。
它能产生电离作用，直接和间接改变DNA结构。
直接的效应是导致碱基的化学键、脱氧核糖的化学键、糖-磷酸相连接的化学键的断裂；间接的效应是电离辐射使水和有机分子产生自由基，自由基作用于DNA分子，特别是对嘧啶的作用更强，可引起缺失和损伤，造成基因突变，还能引起染色体断裂，引起倒位、缺失和易位等畸变。
不同的微生物对C060的辐射敏感程度差异很大，可以相差几倍，引起最高变异的剂量也随菌种而有所不同。
一般照射时多采用菌悬液，也可用长了菌落的平皿直接照射。
照射剂量在4~10万伦琴，或者采用能使微生物产生90％~99％死亡率的剂量。
电离幅射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺失突变，但可能影响邻近基因的性能。
（3）等离子输入等离子输入是一种较新的诱变方法，国外自20世纪60年代中、后期相继开始把等离子注入技术应用于生物学领域的研究，国内将离子束作为一种新技术应用于生物等品种改良的研究则是由中国科学院等离子体物理研究所于1986年开创的。
低能离子束是以具质量、能量双重诱变效应的特征不同于传统的电磁辐射，它的注入引发的生物效应，机制相当复杂，既有能量的沉积、动量的传递，又有粒子的注入和电荷的交换，可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和膜电场的改良，与γ射线，中子束等明显不同。
离子束与生物体作用，首先有能量的沉积，即注入离子与生物大分子发生一系列碰撞，生物大分子获得能量时，键断裂，分子击出原位，留下断键或缺陷；同时还有质量沉积，离子束是高LET 粒子，有Braag峰，具有较强的电离作用，还能产生活性高的自由基间接损伤作用，因此它对生物体的作用可导致较高的突变率；另外由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，提供了众多的诱变条件，通过这种电、能、质的联合作用，将强烈影响生物细胞的生理生化特性，以引起基因突变，所以变异幅度大，有较高的突变率，较广的突变谱；再者突变体的遗传性能比较稳定，回复突变率低。
B、不同诱变处理方式①单一因子处理：采用单一诱变剂处理，可以减少减少菌种遗传背景复杂化、菌落类型分化过多的弊病，使筛选工作趋向简单化。
②复合因子处理：指两种以上诱变因子共同诱发菌体突变。
适合于遗传性稳定的纯种及生活能力强的菌株处理，能导致较大的突变。
主要有：两个以上因子同时处理；不同诱变剂交替处理；同一种诱变剂连续重复使用；紫外线复活交替处理。