细胞爬片步骤

细胞爬片步骤

PLL配制和处理（Sigma产品，武汉博士德分装，10ml/瓶。4℃存放，有效期1年）

(1) 储存液：1:10稀释液可以保存在4℃里，三个月内仍然可以使用。稀释、储存和吸取多聚赖氨酸要使用塑料制品。

工作液：0.1%( w/v)PLL，用移液枪吸取0.3ml PLL＋3ml无菌去离子水，混匀放于10ml 无菌塑料离心管中。封口模密封后4℃存放。

(2) 无菌处理：PLL不可以高温消毒，故应过滤除菌分装于无菌处理的细胞冻存管内，1ml/管，封口模密封，4℃保存。另外，准备无菌去离子水50ml。

多聚赖氨酸PLL包被

（1）灭菌的去离子水(三蒸水)1:10稀释多聚赖氨酸溶液。

（2）用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度维持在18-26℃。

（3）将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。（注意增加时间不会提高包被效果）。

（4）将过滤除菌的多聚赖氨酸加入一个消毒好的培养皿(超净台内操作)，然后将高压灭菌的小玻片放到多聚赖氨酸内浸泡5min，无菌晾干即可。（底面贴紧培养皿，存在包被PLL不好的可能，放入培养板孔内注意正反面！！）或者：铺片于培养皿中，移液枪将PLL 工作液滴加于玻片上，室温10分钟后，用消毒好的纱布条吸取玻片上的PLL液。在超静台内风干后使用，或者超静台内过夜晾干，次日使用。或者：在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。

步骤：

（1）准备24孔细胞培养板（消毒好的培养皿）

（2）多聚赖氨酸PLL包被

（3）培养板每孔中滴1滴培养基，然后将玻片置于液滴上，压紧（通过表面张力的作用将玻片吸附于培养板上）

（4）常规细胞消化，离心，重悬，将吹打的细胞悬液分别加到每个孔盖玻片上，让其贴壁生长，可以用移液枪加样30μl于盖玻片上

（5）24孔板做完细胞爬片后，再小心用镊子将爬片取出，细胞面朝向载玻片，用中性树胶封片，照相。（主张用20%-50%甘油封片，中性树胶封的不好容易“花片”）（6）PBS洗涤，以去除血清等物质。（接着做IC）

细胞爬片方法与技巧

爬片的准备：

1、爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；

2、应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；

3、将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是冲洗干净就可以了），放在饭盒或者培养皿（一定是玻璃的哦，要不然就……）中烘干后进行高压消毒。

培养板的准备：

1、泡酸过夜

2、冲洗，烘干（1、2步骤与前大致相同）

3、放入超净工作台用紫外线照1～2小时就可以用了（在照之前可以将爬片一并放入，若细胞贴壁能力不强，可经多聚赖氨酸浸片后放入。贴壁能力强的话，就可以省略了，进行紫外线消毒）

注：此步自己的经验是爬片可以先浸入消毒后的PBS内，紧接着放入培养板内。目的：

浸过PBS的爬片依靠表面的液体，可以用培养板孔底贴和紧密，以利于细胞长到爬片上。（自己刚开始做的时候，经常就是细胞全都长在了爬片与培养板之间，爬片上细胞罕见。）细胞爬片：

1、胰酶消化细胞后计数

2、根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可

3、第二天即可进行干预措施