纸层析法分离鉴定氨基酸

❖ 看看接下来会发生什么事情…
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❖ 可以看出1号氨基酸上升的最
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高，在滤纸上跑得最快。
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❖ 而4号氨基酸与滤纸的结合最
紧，因此跑的速度比其他的氨
基酸慢。
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甘氨酸
组氨酸
缬氨酸
半胱氨酸
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❖ 这就是纸色谱法。
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❖ 对照上图，可知道1-4号的各
代表什么氨基酸。
❖ 纸色谱法是分离鉴定蛋白质的 氨基酸组成的重要工具。
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纸色谱小.实验动画演示
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溶质在固定相的溶解度 分配系数 =
溶质在流动相的溶解度
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纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层 析：纸纤维上的 –OH 基具有亲水性，所以 能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶 剂作为流动相。流动相流经支持物时与固定 相间连续抽提，使物质在两相间不断地分配 而得到分离。
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❖ 溶质在滤纸上的移动速率用Ｒf（比移）值来 表示：
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3、扩展 ：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将滤
纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点 样线1 cm）。待溶剂上升约15 cm时即取出滤纸，铅笔描出 溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。
4、显色： 用喷雾器均匀喷上0。1％茚三酮正丁醇溶液，然
后置烘箱中烘烤5分钟(100℃)或用热风吹干即可显出各层析斑 点。
展层层斑点中心与原点间的距离 Rf = --------------------------------------------
溶剂前沿与原点之间的距离
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影响Rf值的因素（多种）
❖ 物质结构与极性 物质的极性大小决定了物质在水
和有机溶剂之间的分配情况。
❖ pH值 展层剂的pH影响被分离物质的极性基团 的解离形式。
纸层析 薄层层析
离子交换柱层析
吸附薄层层析 气体吸附层析
酶与底物 抗原与抗体
凝胶过滤
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固定相 液体 固体 固体 固体 固体
流动相 液体
液体 液体 气体 液体 液体
分离依据 溶解度 带电性 静电引力 吸附力
配体专一性 分子大小 4
分配层析：是利用不同物质在两种不相溶的溶剂中 的分配系数不同而达到分离的一种技术。
3、氨基酸溶液 0.5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸溶液
及它们的混合液
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【四、实验步骤】
1、层析滤纸准备：取层析滤纸(长20 cm、宽15 cm)一张。
在纸的一端距边缘2～3 cm处用铅笔划一条直线，在此直线 上每间隔2cm作一记号。
2、点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这5个位置上，
干后再点一次。每点在纸上扩散的直径，最大不超过3 mm。
可分离物质 糖类、有机酸、氨基酸、核苷等
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❖固定相 在层析中起分离作用而不随层析过程移动
的物质。如纸层析中固定相是滤纸纤维中结合的水。 固定相被看成是样品移动的阻力。
❖流动相 在层析过程因其本身流动而推动样品移动
的物质。
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层析的分类
名称 分配层析 离子交换层析 吸附层析 亲和层析 凝胶层析
操作方式
❖ 层析滤纸的质量 层析用滤纸要质地均匀，紧密，
❖ 有一定的机械强度，并含杂质少。国产新华滤纸可
❖ 用于一般的纸层析。 .
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【三、器材与试剂】
器材：
1、层析缸 2、毛细管 3、喷雾器 4、培养皿 5、层析滤纸(新华一号)
试剂：
1、扩展剂 （正丁醇：水：冰醋酸= 4：3：1）
2、显色剂 0.1％茚三酮正丁醇溶液。
实验一 纸层析法分离鉴定氨基酸
【一、实验目的】 ❖ 通过实验，掌握纸层析的基本操作技能。 ❖ 加深对分配层析原理的理解。
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【二、实验原理】
层析技术 是利用混合物中各组分的物理化学性质
的差别，使各组分以不同程度分布在两相中，其中 一相为固定相，另一相流过此相称作流动相，并使 各组分以不同速度移动，从而达到分离的目的。
5、计算Rf值
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【五、实验结果与分析】 【六、注意事项】
【七、思考题】
1、实验中作为固定相和流动相的物质分别是什么？ 2、Rf值的含义、影响因素？
下次实验 ： 实验二 蛋白质和氨基酸的颜色反应
值 日 生. 值 日
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小实验
❖ 当滤纸接触到溶剂时，溶液将上 升。
❖ 滤纸上的小圆点是4种不同的氨 基酸的混合物。