分光光度法及分光光度计使用方法
分光度光度法
分光度光度法分光光度法学习资料一、分光光度法的基本概念1. 定义- 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
它利用物质对光的选择性吸收特性，不同的物质由于其分子结构不同，对不同波长的光有不同程度的吸收。
2. 原理基础- 朗伯 - 比尔定律（Lambert - Beer law）是分光光度法的基本定律。
- 朗伯定律指出：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度与光通过的路径长度成正比，即A = k_1b（其中A为吸光度，b为光程长度，k_1为比例常数）。
- 比尔定律指出：当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度与吸光物质的浓度成正比，即A = k_2c（其中c为吸光物质的浓度，k_2为比例常数）。
- 合并朗伯定律和比尔定律得到朗伯 - 比尔定律：A=varepsilon bc，其中varepsilon为摩尔吸光系数，单位为L/(mol· cm)，它表示物质对某一特定波长光的吸收能力，varepsilon越大，表明该物质对该波长光的吸收能力越强。
二、分光光度计的结构与组成1. 光源- 提供足够强度和稳定的连续光谱。
在可见光区常用钨灯或卤钨灯，其发射光的波长范围为320 - 2500nm；在紫外光区常用氢灯或氘灯，发射光的波长范围为180 - 375nm。
2. 单色器- 它的作用是将光源发出的复合光分解为单色光。
主要部件包括狭缝、准直镜和色散元件（如棱镜或光栅）。
通过调节狭缝宽度可以控制出射光的带宽和光强。
3. 样品池- 用于盛放被测溶液。
在可见光区可以使用玻璃样品池，而在紫外光区则需使用石英样品池，因为玻璃对紫外光有吸收。
4. 检测器- 检测透过样品池后的光强，并将光信号转换为电信号。
常见的检测器有光电管和光电倍增管等。
光电倍增管具有更高的灵敏度，可检测微弱的光信号。
5. 信号显示与处理系统- 将检测器输出的电信号进行放大、处理，并以吸光度或透光率等形式显示出来。
分光光度法-紫外可见分光光度计分类及特点、常见故障及排除方法
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检查保险丝（或更换保险丝）
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检查计算机主机与仪器主机连线是否正常
➢ 自检时，某项不通过，或出现错误信息
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关机稍等片刻再开机重新自检
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重新安装软件后自检
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检查计算机主机与仪器主机连接是否正常
➢ 自检时出现“钨灯能量低”的错误
检查光度室是否有挡光物 打开光源室盖，检查钨灯是否点亮：如钨灯不亮，则关机，更换新钨灯 开机重新自检 重新安装软件后自检
镜纸由上而下擦拭干净，检视比色皿外无残留液体
➢比色皿放样品室时应注意方向相同 ➢使用完毕后需洗干净，晾干，防尘保存 ➢仪器室不得存放酸、碱、挥发性或腐蚀性等物质，以免损坏仪器。
紫外可见分光光度计维护及故障
02 紫外可见分光光度计常见故障及排除方法
➢ 打开主机后发现 不能自检主机风扇不转
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检查电源开关是否正常
收池，因为普通玻璃能吸收紫外光，石英吸收池也可用于可见光区。
➢ 检测器 光敏检测器的作用是将接受的光辐射信号转换为相应的电信号，便于测量。紫外可见分光光度计常使用的检测
器是光电倍增管，响应速度快，能检测10-8~10-9s的脉冲光，灵敏度高，比一般光电管高200倍。
➢ 信号显示器 显示装置或读数装置的作用就是检测电流的大小，并将有关分析数据显示或记录下来。
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检查样品是否有光解
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检查样品是否太稀
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检查比色皿是否玷污
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是否测试时光谱带太小
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周围有无强电磁场干扰
分光光度法
紫外可见分光光度计维护及故障
分光光度法
02 紫外可见分光光度计常见故障及排除方法
➢ 钨灯是好的，但自检时出现“钨灯能量高”的错误
第十三章 可见分光光度法和紫外分光光度法
标准曲线的偏离
引起偏离 Lambert-Beer 定律的原因有物理 因素和化学因素两大类。 （一）物理因素引起的偏离
1. 非单色光引起的偏离 假设入射光仅由波长为 λ 1 和
λ2 的两种单色
光组成， 其强度分别为 I01 和 I02 ，当通过浓度 为cB，厚度为d 的吸光物质溶液后，透射光的强 度分别为 I1 和 I2。
二、物质的吸收光谱
吸光度（A）：测量溶液对不同波长的 单色光的吸收程度。 吸收曲线（或吸收光谱）：以波长 λ 为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，可 得一曲线，此曲线就是吸收曲线（或吸 收光谱）
以三（邻二氮菲）合铁（II）离 子的吸收光谱图为例，看看它的吸收光 谱： （1）、（2）（3）、 （4）的浓度逐渐增大
I0 = I a + It + I r
在分光光度法中，通常将被测溶 液和参比溶液分别置于两个材料和厚度 的吸收池中，因此上式可简化为：
I 0 = I a + It
透射光的强度It与入射光强度 I0之比称为透光率，用T表示：
It T= I0
透光率越大，溶液对光的吸收越少； 反之，透光率越小，溶液对光的吸收越 多。
讯号处理及显示器
1、光源
可见分光光度法是以钨灯作 光源。钨灯可发出320至3 200nm的 连续光谱，波长最适宜的波长范围 为360至1 000nm。
2、单色光器
单色光器由棱镜或光栅、狭缝和准直镜 等部分组成。 通过转动棱镜便可在出光 狭缝得到所需波长的单色 光。 所以混合光从空气进入棱镜后，便 按波长由长到短的顺序依次分散成为一个连 续光源。单色光器的作用就是将混合光分散 成一系列的单色光。
hν ≥ ∆E
不同物质的基态和激发态的能量差 不同，选择吸收光子的能量也不同，即 吸收的波长不同。光的能量与波长成反 比，波长越短，能量越高。
分光光度计与分光光度法
2.2.1 分光光度计的 光谱范围
包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围 为200～400 nm的紫外光区。不同的光源都有其特有的 发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光源。
钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的400～760nm 波长的光谱，光连续色谱；该色谱可作为可 见光分光光度计的光源。
3. 以7200可见光分光度计为例，讲解可见光分光度 计的正确使用方法
4. 以UV-754型紫外-可见分光光度计为例，讲解紫 外光光度计的正确使用方法
1. 分光光度法定义 与应用
1.1 定义: 分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴 别物质或测定其含量的分析检测技术。
1.2 特点: 灵敏、精确、快速和简便，在复杂组分系统 中，不需要分离，即能检测出其中所含的极少量物质。
氢灯的发射光谱：氢灯能发出185～400 nm波长的 光谱，可作为紫外光光度计的光源。
谱（1）
如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，此 时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱，它出现 了几条暗线，即光源发射光谱中某些波长的光因溶液 吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的 吸收光谱。
不同物质的吸收光谱是不同的。因此根据吸收光 谱，可以鉴别溶液中所含的物质。
4、有色物稳定性高 其它离子干扰才小。如三
磺基水杨 酸铁的Kf =1042 , F- 、H3PO4 对它无干 扰。
5、显色过程易于控制 而且有色化合物与显
色剂之间的颜色差别应尽可能大。
| m MaRx m Rax | 60nm
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二、 显色反应条件的选择
1、显色剂用量 ，适当过量。
2、溶液酸度 既要防止被测离子生成沉淀，又需
分光光度计使用方法
最佳答案1.接通电源;打开仪器开关;掀开样品室暗箱盖;预热10分钟..2.将灵敏度开关调至“1”档若零点调节器调不到“0”时;需选用较高档..3.根据所需波长转动波长选择钮..4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处;用擦镜纸擦清外壁;放入样品室内;使空白管对准光路..5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器;使读数盘指针指向t=0处..6.盖上暗箱盖;调节“100”调节器;使空白管的t=100;指针稳定后逐步拉出样品滑竿;分别读出测定管的光密度值;并记录..7.比色完毕;关上电源;取出比色皿洗净;样品室用软布或软纸擦净分光光度计使用的外部环境要求分光光度计属于精密仪器;应当妥善保管和精心维护;这样才能保证分光光度计长期使用、长期的稳定可靠、测量精度高..元析公司在多年的生产和应用的过程中;得到了一套在一定环境下维护分光光度计的经验;具体如下：1、环境温度在条件容许的情况下;尽量保持在15-30摄氏度之间;这样能保持电器件稳定工作;不易老化;使分光光度计不易损坏;灯源的使用寿命得到延长..若条件不容许;在高温的情况下;缩短开机时间;高效使用分光光度计;使电器件不要长期保持在高温下..在低温下;使预热时间比常温下的预热时间要长;这样能保证在仪器稳定的情况下进行测试..2、环境湿度在条件容许的情况下;尽量保持在60%以下;这样能保证光度计内部的光学件和电器件不易受潮、腐蚀、和上霉..若条件不容许;在高湿度和低湿度的情况尽量保持通风..3、环境在条件容许的情况下尽量保持洁净;打扫环境时动作不宜太大;不要扬起灰尘;打扫之前用防尘罩盖上分光光度计;不要让灰尘进入分光光度计内部..以上仅就仪器使用的外部环境作了描述;以供使用用户参考..分光光度计的使用分光光度计的应用常识分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器..常用于核酸;蛋白定量以及细菌生长浓度的定量..分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源;通过系列分光装置;从而产生特定波长的光源;光源透过测试的样品后;部分光源被吸收;计算样品的吸光值;从而转化成样品的浓度..样品的吸光值与样品的浓度成正比..核酸的定量核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能..可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸;单链、双链DNA;以及RNA..核酸的最高吸收峰的吸收波长260nm..每种核酸的分子构成不一;因此其换算系数不同..定量不同类型的核酸;事先要选择对应的系数..如：1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA;37μg/ml的ssDNA;40μg/ml的RNA;30μg/ml的Olig..测试后的吸光值经过上述系数的换算;从而得出相应的样品浓度..测试前;选择正确的程序;输入原液和稀释液的体积;尔后测试空白液和样品液..然而;实验并非一帆风顺..读数不稳定可能是实验者最头痛的问题..灵敏度越高的仪器;表现出的吸光值漂移越大..事实上;分光光度计的设计原理和工作原理;允许吸光值在一定范围内变化;即仪器有一定的准确度和精确度..如EppendorfBiophotometer的准确度≤1.0%1A..这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动;都是正常的..另外;还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值;离子浓度等：在测试时;离子浓度太高;也会导致读数漂移;因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液;如TE;可大大稳定读数..样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒;尤其是核酸样品..这些小颗粒的存在干扰测试效果..为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响;要求核酸吸光值至少大于0.1A;吸光值最好在0.1-1.5A..在此范围内;颗粒的干扰相对较小;结果稳定..从而意味着样品的浓度不能过低;或者过高超过光度计的测试范围..最后是操作因素;如混合要充分;否则吸光值太低;甚至出现负值；混合液不能存在气泡;空白液无悬浮物;否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品;否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项..除了核酸浓度;分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度;如A260/A280的比值;用于评估样品的纯度;因为蛋白的吸收峰是280nm..纯净的样品;比值大于1.8DNA或者2.0RNA..如果比值低于1.8或者2.0;表示存在蛋白质或者酚类物质的影响..A230表示样品中存在一些污染物;如碳水化合物;多肽;苯酚等;较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0..A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子..纯样品;A320一般是0..蛋白质的直接定量UV法这种方法是在280nm波长;直接测试蛋白..选择Warburg公式;光度计可以直接显示出样品的浓度;或者是选择相应的换算方法;将吸光值转换为样品浓度..蛋白质测定过程非常简单;先测试空白液;然后直接测试蛋白质..由于缓冲液中存在一些杂质;一般要消除320nm的“背景”信息;设定此功能“开”..与测试核酸类似;要求A280的吸光值至少大于0.1A;最佳的线性范围在1.0-1.5之间..实验中选择Warburg公式显示样品浓度时;发现读数“漂移”..这是一个正常的现象..事实上;只要观察A280的吸光值的变化范围不超过1%;表明结果非常稳定..漂移的原因是因为Warburg公式吸光值换算成浓度;乘以一定的系数;只要吸光值有少许改变;浓度就会被放大;从而显得结果很不稳定..蛋白质直接定量方法;适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质..紫外直接定量法相对于比色法来说;速度快;操作简单；但是容易受到平行物质的干扰;如DNA的干扰；另外敏感度低;要求蛋白的浓度较高..比色法蛋白质定量蛋白质通常是多种蛋白质的化合物;比色法测定的基础是蛋白质构成成分：氨基酸如酪氨酸;丝氨酸与外加的显色基团或者染料反应;产生有色物质..有色物质的浓度与蛋白质反应的氨基酸数目直接相关;从而反应蛋白质浓度..比色方法一般有BCA;Bradford;Lowry等几种方法..Lowry法：以最早期的Biuret反应为基础;并有所改进..蛋白质与Cu2+反应;产生蓝色的反应物..但是与Biuret相比;Lowry法敏感性更高..缺点是需要顺序加入几种不同的反应试剂；反应需要的时间较长；容易受到非蛋白物质的影响；含EDTA;Tritonx-100;ammoniasulfate等物质的蛋白不适合此种方法..BCABicinchoninine acid assay法：这是一种较新的、更敏感的蛋白测试法..要分析的蛋白在碱性溶液里与Cu2+反应产生Cu+;后者与BCA形成螯合物;形成紫色化合物;吸收峰在562nm波长..此化合物与蛋白浓度的线性关系极强;反应后形成的化合物非常稳定..相对于Lowry法;操作简单;敏感度高..但是与Lowry法相似的是容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰..Bradford法：这种方法的原理是蛋白质与考马斯亮兰结合反应;产生的有色化合物吸收峰595nm..其最大的特点是;敏感度好;是Lowry和BCA两种测试方法的2倍；操作更简单;速度更快；只需要一种反应试剂；化合物可以稳定１小时;方便结果；而且与一系列干扰Lowry;BCA反应的还原剂如DTT;巯基乙醇相容..但是对于去污剂依然是敏感的..最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大;无可比性..某些初次接触比色法测定的研究者可能为各种比色法测出的结果并不一致;感到迷惑;究竟该相信哪种方法由于各种方法反应的基团以及显色基团不一;所以同时使用几种方法对同一样品得出的样品浓度无可比性..例如：Keller等测试人奶中的蛋白;结果Lowry;BCA测出的浓度明显高于Bradford;差异显着..即使是测定同一样品;同一种比色法选择的标准样品不一致;测试后的浓度也不一致..如用Lowry测试细胞匀浆中的蛋白质;以BSA作标准品;浓度1.34mg/ml;以a球蛋白作标准品;浓度2.64mg/ml..因此;在选择比色法之前;最好是参照要测试的样本的化学构成;寻找化学构成类似的标准蛋白作标准品..另外;比色法定量蛋白质;经常出现的问题是样品的吸光值太低;导致测出的样品浓度与实际的浓度差距较大..关键问题是;反应后1011分光光度计的重要配件——比色杯的颜色是有一定的半衰期;所以每种比色法都列出了反应测试时间;所有的样品包括标准样品;都必须在此时间内测试..时间过长;得到的吸光值变小;换算的浓度值降低..除此;反应温度、溶液PH值等都是影响实验的重要原因..此外;非常重要的是;最好是用塑料的比色法..避免使用石英或者玻璃材质的比色杯;因为反应后的颜色会让石英或者玻璃着色;导致样品吸光值不准确..细菌细胞密度OD600实验室确定细菌生长密度和生长期;多根据经验和目测推断细菌的生长密度..在遇到要求较高的实验;需要采用分光光度计准确测定细菌细胞密度..OD600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法..以未加菌液的培养液作为空白液;之后定量培养后的含菌培养液..为了保证正确操作;必须针对每种微生物和每台仪器用显微镜进行细胞计数;做出校正曲线..实验中偶尔会出现菌液的OD值出现负值;原因是采用了显色的培养基;即细菌培养一段时间后;与培养基反应;发生变色反应..另外;需要注意的是;测试的样品不能离心;保持细菌悬浮状态..分光光度计的重要配件——比色杯比色杯按照材质大致分为石英杯、玻璃杯以及塑料杯..根据不同的测量体积;有比色杯和毛细比色杯等..一般测试核酸和紫外定量蛋白;均采用石英杯或者玻璃杯;但是不适合比色法测定..因为反应中的染料如考马斯亮兰能让石英和玻璃着色;所以必须采用一次性的塑料杯..而塑料杯一般不适合用于在紫外范围内测试样品..由于另外测试的样品量不同;所以一般分光光度计厂家提供不同容积的比色杯以满足用户不同的需求..目前市场已经存在一种既可用于核酸、紫外蛋白质定量;亦可用于蛋白比色法测定的塑料杯;样品用量仅需50μl;比色杯单个无菌包装;可以回收样品..如EppendorfUVette塑料比色杯;是目前比色杯市场上一个革新..随着生命科学以及相关学科发展;对此类科学的实验研究提出更高的要求;分光光度计将是分子生物学实验室不可缺少的仪器;也成为微生物、食品、制药等相关实验室的必备设备之一..分光光度技术6.1基本原理利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱;利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法;称为分光光度法或分光光度技术;使用的仪器称为分光光度计;这种分光光度计灵敏度高;测定速度快;应用范围广;其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一..因此本章重点讨论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等..1.光谱：光是电磁波;可用波长“λ”表示;电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成;对于生物化学来说;最重要的波长区域是可见光和紫外光..光的波长是二个相邻的波峰之间的距离..光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成..λ＝C/νλ——波长C——光速ν——频率;单位时间通过一个定点的波数..光又可以看作是由具有能量的粒子所组成..这些粒子所具有的原能量“E”由下式算出：E＝hνH——普朗克常数6.624×10-27尔格秒ν——频率紫外区可分为紫外近紫外和真空紫外远紫外..由于吸收池又称样品池、比色杯等和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光;因此常规紫外测定集中在近紫外区;即200nm～400nm..可见光区为400nm～800nm..组成物质的分子均处于一定能态并不停地运动着;分子的运动可分为平动、转动、振动和分子内电子的运动;每种运动状态都处于一定的能级;因此分子的能量可以写成：E＝E0+E平+E转+E振+E电E0是分子内在的不随分子运动而改变的能量;平动能E平只是温度的函数;因此与光谱有关的能量变化是分子的转动能量、振动能量和分子的电子能量..分子的每一种能量都有一系列的能级;能级不是任意的;而是具有量子化特征的;通常分子处于基态;当它吸收一定能量跃迁到激发态;则产生吸收光谱..分子转动、振动和电子能级的跃迁;相应地产生转动、振动及电子光谱..按照量子力学原理;分子能态按一定的规律跳跃式地变化;物质在入射光的照射下;分子吸收光时;其能量的增加是不连续的;物质只能吸收一定能量的光;吸收光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系：E＝E2-E1＝hE1、E2分别表示初能态和终能态的能量;初能态与终能态之间的能量差愈大;则所吸收的光的频率愈高即波长愈短;反之则所吸收的光的频率愈低即波长愈长..由于吸收是不连续的;因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带..因为分子转动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大;因此;它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域..分子转动能级级差小;△E＜0.05电子伏特ev;分子转动光谱的吸收出现在远红外或微波区..振动能级纵间的差别较大;E＝0.05～1.0ev;振动光谱出现在中红外区..电子能级的级差更大;E＝1～20ev;所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、紫外或波长更短的光谱区..可见光、紫外光吸收光谱;是由于分子中联系较松散的价电子被激发产生跃迁从而吸收光辐射能量形成的;即分子由基态变为激发态;电子由一个低能级的轨道即成键轨道;吸收了光能量跃迁到高能级轨道称为反键轨道..与吸收光谱有关的三种电子是：⑴二个原子的电子沿其对称方向相互形成的共价键即单键;称σ键;构成键的电子称σ电子;如C－C、C－H键..⑵平行于二个原子轨道形成的价键即双键;称π键;形成π键的电子称为π电子;如C=C键..⑶未共享成键的电子;称n电子..各种电子跃迁所需能量大小的顺序是：n→π*＜π→π*≤n→σ*＜π→σ*＜σ→π*＜σ→σ*紫外吸收光谱主要是由于双键电子;尤其是共轭双键中的π电子和未共享的电子对的激发所产生的..所以各种物质分子对紫外光的吸光性质取决于该分子的双键数目和未共享电子对的共轭情况等..如下表所示：电子跃迁类型与紫外吸收波长nm关系表电子跃迁类型例子紫外吸收波长范围σ→σ*C－H100～150nmπ→π*非共轭C＝O＜200nmπ→π*共轭＝C－C＝200～300nmn→π*C＝O～300nmπ→π*跃迁：此类跃迁所需能量较小;吸收波长在紫外区的200～300nm;不饱和烃、共轭烯烃及芳香烃均可发生这类跃迁;氨基酸、蛋白质与核酸均含有大量共轭双键;因而200～300nm的紫外吸收测定;在生化实验技术中有极广泛的用途..若逐渐改变照射某物质的入射光的波长;并测定物质对各种波长光的吸收程度吸光度“A”或光密度“O.D”或透射程度透光度“T”;以波长λ作横坐标;“A”或“T”为纵座标;画出连续的“A~λ”或“T~λ”曲线;即为该物质的吸收光谱曲线..吸光度ADCBλmaxλmin波长nm由上图可以看出吸收光谱的特征：⑴曲线上“A”处称最大吸收峰;它所对应的波长称最大吸收波长;以λmax表示..⑵曲线上“B”处有一谷;称最小吸收;它所对应的波长;所对应的波长;称最小吸收波长;以λmin表示..⑶曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”;称肩峰..⑷在吸收曲线的波长最短的一端;曲线上“D”处;吸收相当强;但不成峰形;此处称为末端吸收..λmax是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长;不同物质有不同的最大吸收峰;所以它对鉴定化合物极为重要..吸收光谱中;λmax、λmin、肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质;其特征随物质的结构而异;所以是物质定性的依据..测定某物质的紫外吸收光谱的曲线;可与已知标准的紫外光谱图相对照;对照时须注意测定的条件;如溶剂、浓度等..常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验公司编制的“Sadtler”紫外标准图谱集;到七十年代末为止已收集28585个化合物紫外光谱图;此外还有药物和非极性溶剂紫外光谱图2000多幅..由于化合物紫外吸收峰较少;而且峰形都很宽;不象红外光谱是许多指纹峰;所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时;应注意：化合物相同;其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同;可能仅是存在某些相同的发色团或基团;因此在鉴定时应与红外光谱相结合..由于电子跃迁的同时也引起分子的转动和振动光谱;要把电子跃迁和分子振动、转动的跃迁完全分开是不可能的;因此我们常见的紫外吸收光谱是由一个或几个宽的吸收谱带所组成..紫外光谱中常用的术语有发色团、助色团、增色效应和减色效应..发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n→π*、π→π*、n→σ*等电子跃迁的基团称为发色团..例如：C＝C、C＝O等发色团..助色团：助色团是一些具有非共价键的基团如OH、NH2、SH等..这些基团在波长＞200nm处没有吸收;当它与发色团相连接时;使发色团的吸收带向长波移动;称为红移或浅色效应;红移的同时吸收带的强度增加..若助色团与发色团相连接;产生n→π*跃迁;使吸收波长向短波移动;称为兰移或深色效应..增色效应hyperchromiceffect:核酸变性或降解;使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加;即ε值吸光系数或称消光系数显着升高;此现象称为增色效应..此效应是由于碱基之间电子相互作用的改变所致;通常在260nm处测量..减色效应hypochromiceffect:在一定的条件下;变性的核酸又可以复性;此时ε值又明显减少;回复到原来的核酸分子ε值较低的水平;即此时DNA或RNA溶液的紫外光吸收显着降低;此现象称为减色效应;此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的;通常在260nm条件下测量..2.光吸收定律：朗伯——比尔Lambert－beer光吸收定律：A＝－lgT＝εbcA——吸光度;又称光密度“O.D”..T——透光度;T＝I/I..;I..——为照射到吸收池上的光强;I——为透过吸收池的光强..ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数Lmol－1cm－1..b——样品光程cm;通常使用1.0cm的吸收地;b=1cm..C——样品浓度mol/L..由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比..摩尔吸光系数：;是物质对某波长的光的吸收能力的量度..ε越大;吸收光的能力越强;相应的分光度法测定的灵敏度就越高..ε值越大;说明电子跃迁的几率大;通常ε＝10～105：一般认为ε＞104为强吸收；ε＝103～104为较强吸收；ε＜102为弱吸收;此时分光光度法不灵敏..因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A＝0.001;所以;当b＝1cm;ε＝105时;可检测的溶液最小浓度是C＝10-8mol/L..常用的吸光系数还有一种百分吸光系数;即在某一波长下;溶液浓度为1%W/V;液层厚度b＝1cm时的吸光度;以E1%λmax表示..C——百分浓度W/V..L——液层厚度;吸收杯光径长度..A——吸光度..最大吸收波长λmax时的ε和E1%λmax值可用下式换算：ε＝E1%λmax×分子量/10吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性：A＝ε1C1b1＋ε2C2b2＋ε3C3b3＋……＝即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和..这是多元混合物分光光度法定量分析的基础..若溶液中各溶质的吸光系数ε相同;则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例..例如;离子交换柱层析分离核苷酸实验中可利用吸光度计算回收率：m＝CV;∵;∴m——溶质的量C——溶质浓度V——溶液体积A——吸光度ε——吸光系数b——吸收池光径∴回收率100%上式中假设ε总和各核苷酸的ε近似相等例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定260nm处的吸光度为0.650;用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070;计算尿嘧啶溶液的摩尔浓度;已知其摩尔吸光系数=8.2×103 M－1cm－1M＝mol/L..∵A＝εbC∵A＝溶剂加样品的吸光度－溶剂的吸光度∴A＝0.650－0.070＝0.580∵b＝1cm∴C==7.1×10－5mol/L例二：1%W/V;10mg/ml酪氨酸酶溶液的吸光度为24.91cm吸收池;280nm;计算A280=0.250的酪氨酸酶溶液的浓度..由于这两种酶溶液的百分吸光系数“E1%1cm;280nm”是相同的;因此可用正比例法计算浓度..∵∴∴C未知＝0.01％＝0.1mg/ml6.2分光光度计的组成和构造：1.组成：各种型号的紫外/可见分光度计;不论是何种型式;基本上都由五部分组成：1光源；2单色器包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统；3样品室；4接收检测放大系统；5显示或记录器..光源单色器样品室检测放大系统显示器国产分光光度计近年来已有很大的发展;各种档次的分光光度计都已更新升级换代;可见光系列有：721、722、723等型号;紫外/可见光系列有：751、752、753、754、756等型号;主要生产厂为上海分析仪器总厂等..我系1985年购买的瑞士KONTRON康强公司生产的UNICON860型紫/可见光分光光度计;是双光束、快速自动扫描、荧屏显示的高档分光光度计..这种双光束分光光度计的特点是来自光源的连续光谱经凹面全息光栅分光后;由出射狭缝得到单色光;经过由电机带动的25周/秒左右的旋转镜分解为“样品”、“参比”光束;顺序分时通过参比池和样品吸收池;照射到光电倍增管上;由于两条光路是几乎同时测量;参比信号又不断与标准电压比较;使参比信号恒定;所以由光源、单色器、外界杂光、光电倍增管以及电源电压等带来的影响;仪器均能自动消除..最快波长扫描速度为1200nm/min;有五种测量功能和五种数据处理功能..我系2000年购买的德国耶拿蔡司公司生产的SPECORD200型高档紫外/可见光分光光度计的光路原理图如下：SPECORD200分光光度计的样品和参比光路;分别有各自的带温控的光电二极管检测器;因而取消了电机带动的旋转镜;大大提高了仪器的稳定性及各项检测指标;其波长范围是190nm～1100nm;吸光度测定范围是0～3A;可变狭缝宽度为1nm、2nm和5nm;仪器使用微机控制时;扫描速度最高可达6000nm/min;宽大的样品室可以安装各种附件;仪器性能优良;适合教学、科研使用..该仪器的使用说明详见附录..2.构造：⑴光源：理想光源的条件是：①能提供连续的辐射；②光强度足够大；③在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化；④光谱范围宽；⑤使用寿命长;价格低..用于可见光和近红外光区的光源是钨灯;现在最常用的是卤钨灯Halogenlamp;即石英钨灯泡中充以卤素;以提高钨灯的寿命..适用波长范围是320～1100nm..由于能量输出的波动为电压波动的四次方倍;因此电源电压必须稳定..用于紫外光区的是氘灯Deuteriumlamp;适用波长范围是195～400nm;由于氘灯寿命有限;国产氘灯寿命仅五百小时左右;要注意节约灯时..⑵单色器：单色器是分光光度计的心脏部分;它的作用是把来自光源的混合光分解为单色光并能随意改变波长..它的主要组成部件和作用是：①入射狭缝——限制杂散光进入..②色散元件——即棱镜或光栅;是核心部件;可将混合光分解为单色光..③准直镜——把来自入射狭缝的光束转化为平等光;并把来自色散元件的平等光聚焦于出射狭缝上..④出射狭缝——只让额定波长的光射出单色器..转动棱镜或光栅的波长盘;可以改变单色器出射光束的波长；调节出入射狭缝隙的宽度;可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度..光栅：光栅有透射光栅和反射光栅;实际应用的都是反射光栅;它又可分为平面反射光栅即通称的反射光栅或闪烁光栅和凹面反射光栅两类;凹面反射光栅可以起色散元件和准直镜两个作用;使色散后的光束聚焦于出射狭缝;得到锐线光谱..光栅的刻制方法有两种：机刻光栅：用金刚刀挤压镀于硬质玻璃上0.5~1的铝反射层而得..刻制工作量极大;一般每分钟只能刻10条线;刻100mm宽的600线/mm的光栅要100小时..最多刻到3600线/mm..由于其制造周期长;成本高;一般只能制得少量的母光栅;而实际应用的多是复制光栅;即在母光栅上涂上硅油;再镀上一层铝;用环氧树脂粘下来;就得到复制光栅..机刻光栅的缺点是线槽稍有缺陷时就会出现“鬼线”;即位于光谱强线两侧的模糊不清的假线..全息光栅：用全息照相法刻制的高精度光栅..即用高强度的相干性极好的单色光;如激光;用高分辨的感光材料——光致抗蚀剂记录干涉条纹;曝光1小时;化学处理掉受光部分;再进行真空镀膜镀铝;得到全息反射光栅..这种光栅几乎没有线槽间的周期误差;几乎没有“鬼线”;杂散光很少..最大线槽密度可达6500线/mm;最大直径可达400mm;刻线越多;分辨率就越高;最常用的是1200~1500线/mm的全息光栅..狭缝、光谱频带宽度和分辨率：出射狭缝的宽度通常有两种表示方法：一为狭缝的实际宽度;以毫米mm表示;另一种为光谱频带宽度;即指由出射狭缝射出光束的光谱宽度;以毫微米nm表示..例如;出射狭缝的宽度是6nm;并不是说出射狭缝的宽度是6nm;而是指由此狭缝射出的光具有6nm的光谱带宽..纯粹的单色光只是一种理想情况;分光光度计所能得到的“单色光”;实际上只是具有一定波长范围的谱带;狭缝越宽;所包括的波长范围也愈宽..对单色光纯度来说;狭缝是愈窄愈好;但光的强度也就越弱;因此狭缝不能无限制地小;狭缝的最小宽度取决于检测器能准确地进行测量的最小光能量..目前达到的最小宽度为0.1nm..。
分光光度法及分光光度计使用方法
分光光度法及分光光度计使用方法分光光度计是进行分光光度法实验的重要仪器，它包含了光源、待测溶液、检测装置、调节装置和记录设备等部分。
下面将从光度计的基本组成和使用方法两个方面来介绍分光光度法及其仪器。
一、分光光度计的基本组成1.光源：分光光度计常用的光源有白炽灯、氘灯和钨灯等。
白炽灯是连续谱的光源，适用于有色物质的分析。
氘灯是一种光谱特性好的光源，适用于有机物分析。
钨灯是高温灯丝发光的光源，适用于测量波长较长的吸收分析。
2.分光器：分光器是分光光度计的核心部分，它能将进入光束分成不同频率的光束，使其通过样品后进入检测装置。
3.样品室：样品室是放置待测溶液的位置。
它是一个透明的容器，一般为石英或玻璃制成，允许光线通过。
样品室应保持清洁，以避免杂质的影响。
4.检测装置：检测装置一般采用光电二极管或光电倍增管等器件，用于测量经过样品后的光强度。
通过测量样品前后的吸光度差来计算溶液的吸光度。
5.调节装置：分光光度计上有波长调节装置和吸收度调节装置。
波长调节装置用于调节分光光度计的波长，以使其与溶液或样品所吸收的光的波长一致。
吸收度调节装置用于调节样品或溶液的光程以及比色皿的位置，以保持测量的准确性。
二、分光光度计的使用方法1.校准：使用分光光度计前，首先需要进行校准。
校准时使用标准溶液，将其放入样品室中，调节波长和吸收度使显示屏上的数值达到最大。
这样可以保证测量的准确性。
2.选择波长：根据待测溶液的特性，选择合适的波长进行测量。
有些物质在不同波长下的吸光度表现不同，因此需要根据需要选择合适的波长。
3.放置样品：将待测溶液倒入透明的样品室中，确保样品室的透光性。
4.测量：将样品室放入分光光度计中，并调节光程和吸收度，使显示屏上的数值稳定。
记录下吸光度值。
5.数据处理：根据所测得的吸光度值，通过标准曲线或校准曲线等，计算出溶液的浓度或其他相关指标。
6.清洗：每次使用分光光度计后，要及时将样品室和分光器等部件进行清洗，以避免污染和影响下次实验的结果。
分光光度计的使用方法
分光光度计的使用方法主体内容：1．使用仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理。
以及各个操作旋钮之功能。
在未接通电源前，应该对仪器的安全性进行检查，电源线接线应牢固。
通地要良好,各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再接通电源开关。
仪器在使用前先检查一下，放大器暗盒的硅胶干燥筒（在仪器的左侧），如受潮变色，应更换干燥的蓝色硅胶或者倒出原硅胶，烘干后再用。
2．将灵敏度旋钮调置“1”档（放大倍率最小)。
3．开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调至测试用波长。
仪器预热20分钟。
4．打开试样室盖（光门自动关闭），调节“0”旋钮，使数字显示为“00。
0”，盖上试样室盖，将比色皿架置与蒸馏水校正位置，使光电管受光,调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为“100.0”.5．如果显示不到“100。
0”，则可适当增加微电流放大器的倍率档数，但尽可能置低倍率档使用,这样仪器将有更高的稳定性。
但改变倍率后必须按(4）重新校正“0”和“100％”。
6．预热后，按(4)连续几次调整“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作.7．吸光度A的测量按(4)调整仪器的“00。
0"和“100%”,将选择开关置于“A”,调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000",然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。
8．浓度C的测量:选择开关由“A"旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，即可读出被测样品的浓度值.9．如果大幅度改变测试波长时，在调整“0"和“100%"后稍等片刻，（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间)，当稳定后，重新调整“0”和“100％”即可工作.10．每台仪器所配套的比色皿，不能与其它仪器上的比色皿单个调换。
11．本仪器数字表后盖，有信号输出0～1000MV，插座1脚为正，2脚为负接地线。
分光光度计的使用和邻二氮菲分光光度法测定铁实验报告
实验八分光光度计的使用和邻二氮菲分光光度法测定铁实验报告一、实验原理1、分光光度法基本原理当光通过溶液后有一部分被物质吸收，如图1所示。
如果I0为入射光的强度，I t为透过光的强度，则I t/I0是透光率T，- lgT定义为吸光度A。
实验证明，当一束单色光(一定波长的光)通过一定厚度b 的有色溶液时，A=εbc，这种定量关系称为朗伯-比尔定律。
其中ε是一个比例系数，它与入射光的波长以及溶液的性质、温度等因素有关，是物质的特征常数。
任何一种物质的溶液对不同波长光的吸收程度是不同的。
如果将各种波长的单色光依次通过一定浓度的某一种物质溶液，测量该溶液对各种单色光的吸光度A，以波长λ为横坐标，以吸光度A为纵坐标绘制的曲线称为吸收曲线，如图2所示。
最大吸光度所对应的波长称为最大吸收波长，用λmax表示。
在λmax处进行测量，光的吸收程度最大，测定的灵敏度和准确度最高。
在一定的条件下，测量一系列已知准确浓度的标准溶液的吸光度A，以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标绘制曲线，即得工作曲线，如图3所示。
在分析未知溶液时，根据测量的吸光度A，查工作曲线即可确定出相应的浓度。
图1 溶液对光的吸收图2 物质吸收曲线图3 工作曲线2、邻二氮菲分光光度法测铁原理邻二氮菲(o-Ph)在pH＝2～9 的溶液中与Fe2+生成稳定的红色络合物，lg K ＝21.3，最大摩尔吸收系数ε =1.1×104，其反应式如下：Fe2+ + 3(o-Phen) = Fe(o-Phen)3红色络合物的最大吸收峰位于510 nm。
对于Fe3+，可用盐酸羟胺事先将其还原至Fe2+。
本方法的选择性很高，相当于含铁量40倍的Sn2+、Al3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、SiO32-，20倍Cr3+、Mn2+、V(V)、PO43-，5倍Co2+、Cu2+等均不干扰测定。
本实验采用工作曲线法测定铁。
二、基本操作1、721型分光光度计的结构721型分光光度计的基本结构：光源、单色器（光栅）、比色槽和比色皿、光电转换器、显示装置（微安表、数码显示屏）。
第十章 分光光度法
注：溶液的透光率T反映了物质对光的吸收程度， T越大表示它对光的吸收越弱；反之，T越小，表 示对光的吸收越强。
T 取值为0.0 % ~ 100.0 %
T
全部吸收
T = 0.0 %
全部透射 T = 100.0 %
2.吸光度： 为透光率的负 A lg I0 lg 1 ＝ lgT
（四）吸光系数 1．定义（物理意义）
一定条件下，吸光物质在单位浓度及单位液层 厚度时的吸光度，叫这个物质的吸光系数。
2．两种表示方法
(1) 摩尔吸光系数( ε )：表示一定波长下，吸光物质的溶液
浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时，溶液的吸光度。
(2)百分吸光系数(
E1% 1cm
)：表示一定波长下，吸光物质的溶
黄 橙
红
/nm 颜色 400-450 紫
450-480 蓝 480-490 青蓝 490-500 青 500-560 绿 580-610 黄 610-650 橙 650-760 红
互补光 绿
黄 橙 红 紫 蓝 青蓝 青
物质的颜色与光的关系：
完全吸收
光谱示意 复合光
表观现象示意
完全透过
吸收黄色光
二.物质对光的选择性吸收
A. A~λ曲线
B. A~c曲线
C. A~V曲线
D. E~V曲线
4、紫外分光光度法中，为了使测定结果有较高 的灵敏度和准确度，入射光的波长应（ ）
A．最大吸收波长
B．最小吸收波长
检测器 作用：将光信号转换为电信号，并放大 光电管，光电倍增管
信号输出 表头、记录仪、屏幕、数字显示
第十章
1 光源
在紫外可见分光光度计中，常用的光源 有两类：热辐射光源和气体放电光源 热辐射光源适用350nm-800nm，用于可见 光区，如钨灯和卤钨灯；气体放电光源适 用150nm-400nm，用于紫外光区，如氢灯 和氘灯。
UV2000分光光度计说明书
UV2000 型
光学系统
单光束，1200 条/毫米衍射光栅
光谱带宽
2nm
波长范围
190—1000 nm
波长精度
±2.0 nm
波长重复性
1.0 nm
波长显示 杂散光
刻度盘；精确至 2 nm ≤0.5%T
光度范围
在 220nm,360 nm 处 0-125%T，-0.097-02.500A，
0-1999C（0-1999F）
和 0%T。 3. 将您的参比样品溶液，标准样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛
有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第一个槽位 中。仪器所附的比色皿，其透射比是经过配对测试的，未经配对处理的比色皿将影响样品的测 试精度，比色皿透光部分表面不能有指印、溶液痕迹，被测溶液中不能有气泡、悬浮物，否则 也将影响样品测试的精度。 4. 将参比样品推（拉）入光路中，按“0A/100%T”键调 0A/100%T，此时显示器显示的“BLA”， 直至显示“0.000”A 为止。 5. 用＜MODE＞键将测试方式设置至 C 状态。 6. 将标准样品推（或拉）入光路中。 7. 按“INC”或“DEC”键将已知的标准样品浓度值输入仪器，当显示器显示样品浓度值时，按 “ENT”键。浓度值只能输入整数值，设定范围为 0—１９９９ 注意 ：若标样浓 度 值 与它的吸光度的比值大于 １９９９ 时 ，将超出仪器测量范围，此 时 无 法 得 到 正 确 结 果。比如标准溶液浓度为 １５０，其吸光度 ０．０６５，二者之比为 １５０／０．０６５＝２３０８，已大于 １９９９。这时可将标样浓度值除以 １０ 后输入，即输入 １５ 后进行测试。只是你在下面第 ８ 步测得的浓度值需要乘以十扩大十倍。 8. 将被测样品依次推（或拉）入光路，这时，您便可从显示器上分别得到被测样品的浓度值。 ５．２．２ 已知标准样品浓度斜率（Ｋ 值）的测量方法 1. 用＜MODE＞键将测试方式设置至 A（吸光度）状态。 2. 用波长旋钮设置样品的分析波长，根据分析规程，每当分析波长改变时，必须重新调整 0A/100%T 和 0%T。 3. 将您的参比样品溶液和被测样品溶液分别倒入比色皿中，打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿 分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖。一般情况下，参比样品放在第一个槽位中。
分光光度法
光度法的优点
与目视比色法相比，光度法的优点： 1. 用光电仪器进行测量可消除轻度色盲、眼睛 疲劳等主观误差。 2. 有其他物质共存时，可选适当的入射光和参 比溶液来消除干扰，提高选择性。 3. 对于大批试样分析，校正曲线可简化手续， 提高分析速度。
2.3.2.测量条件的选择(1)
（1）选择合适的入射光 由于溶液对光的吸收是有选择性的，因此 必须选择溶液吸收最大的波长作为入射光的波 长。 （2）控制适当的吸光度范围 用光度计测量吸光度，都存在着误差。当 测量小于0.2和大于0.7吸光度时，误差会迅速 增加。为了使测量误差落在0.2～0.7之间，可 以控制试样的称取量。对于组分含量高的试样， 可减少称取量，或是稀释;对于含量低的溶液 可增加称样量或浓缩的方法来提高浓度。
图2－8 721分光光度计的光学系统
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（三）
图2－9 7530G紫外—可见光分光光度计
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（四）
图2－10 7530G紫外-可见分光光度计光学系统
检测器和读数装置 （2）
2. 光电管. 是一个二极真空管由一个阳极和一个光敏阴 极组成。 3. 光电倍增管。 是利用光敏阴极把光信号放大的装置。 4. 读数装置。 读数装置常用的是微安计或检流计。
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（一）
图2－7 721分光光度计
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（二）
2.分光光度法 2.分光光度法
光度可用光电比色计或分光光度计进 行测量。 测定时常用的是校正曲线法或比较法。
（1）校正曲线法
校正曲线法，又称工作曲线或标准曲线法。 当溶液厚度b固定时，吸光度A与溶液浓度c成 正比.取一系列不同浓度标准溶液（5－7图）， 分别测定其吸光度，以浓度c为横坐标，吸光 度为纵坐标，作校正曲线.试液用同样条件显 色，测定吸光度，从曲线上求得试液浓度。
分光光度法及分光光度计使用方法
I0 I
值大，表示溶液吸收光线较多；
当I 0时，lg I0 值无穷大，表示光线几乎被溶液完全吸收，即溶液不透光。 I
由此可见， lg I0 表示溶液对光吸收的程度，称作吸光度（absorbance）， I
用A表示，即A lg I0 I
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
如何求被测组分的含量
分光光度法
南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心
2012春季学期
内容
1 分光光度法的原理 2 如何求被测组分的含量
3
3 分光光度计的基本结构 4 分光光度计的使用与注意事项
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
分光光度法
• 概念：是利用物质所特有的吸收光谱来 鉴别物质或测定其含量的一项技术。
lg Io k l ＋ lg Io k c ＝ lg Io k c l
I
I
I
2012春季学期
A k cl
生物化学与分子生物学实验教学中心
分光光度法的原理
lg Io k c l IΒιβλιοθήκη 公式的意义：当I
I
时，
0
lg
I0 I
0，表示溶液完全不吸收光线；
当I＜I0时，lg
若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然 得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线 。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测 定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
根据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度
。
A
0.8 0.6 0.4
紫外分光光度计的使用原理和方法 PPT
这些显色反应,必须满足以下条件:
1、反应得生成物必须在紫外-可见光区有较 强得吸光能力,即摩尔吸光系数较大;
2、反应有较高得选择性,即被测组分生成得 化合物吸收曲线应与共存物质得吸收光谱有 明显得差别;
3、 反应生成得产物有足够得稳定性,以保 证测量过程中溶液得吸光度不变;
4、反应生成物得组成恒定。
按所吸收光得波长区域不同,分为紫外分 光光度法与可见分光光度法,合称为紫外-可见 分光光度法。
紫外-可见分光光度法得特点:
1 与其它光谱分析方法相比,其仪器设备与操 作都比较简单,费用少,分析速度快;
2 灵敏度高; 3 选择性好; 4 精密度与准确度较高; 5 用途广泛。
§1、 紫外-可见吸收光谱
3、 狭缝宽度得选择
为了选择合适得狭缝宽度,应以减少狭 缝宽度时试样得吸光度不再增加为准。一 般来说,狭缝宽度大约就是试样吸收峰半 宽度得十分之一。
二、显色反应条件得选择
对多种物质进行测定,常利用显色反应 将被测组分转变为在一定波长范围有吸收 得物质。常见得显色反应有配位反应、氧 化还原反应等。
参比溶液得选择视分析体系而定,具体有:
1、溶剂参比 试样简单、共存其它成分 对测定波长吸收弱,只考虑消除溶剂与吸收 池等因素;
2、试样参比 如果试样基体溶液在测定 波长有吸收,而显色剂不与试样基体显色 时,可按与显色反应相同得条件处理试样, 只就是不加入显色剂。
3、试剂参比 如果显色剂或其它试剂在 测定波长有吸收,按显色反应相同得条件, 不加入试样,同样加入试剂与溶剂作为参 比溶液。
红移与紫移
在有机化合物中,常常因取代基得变更或 溶剂得改变,使其吸收带得最大吸收波长λmax 发生移动。向长波方向移动称为红移(表3-3), 向短波方向移动称为紫移。
浅谈分光光度法和分光光度计的原理及其应用
范以辉等:浅谈分光光度法和分光光度计的原理及其应用11 浅谈分光光度法和分光光度计的原理及其应用D iscussing P rincipium and A pply for R ange Spectrophotom eter范以辉 惠焕强(南京市计量监督检测院,江苏南京210037)摘 要:近几年分光光度计越来越多的进入各行各业,但有些单位对分光光度计的工作原理不是很了解,我们在此重述分光光度法和分光光度计的原理及其应用。
关键词:分光光度法;分光光度计;原理及应用 分光光度法是比色法的发展。
比色法只限于在可见光区,分光光度法则可以扩展到紫外光区和红外光区。
比色法用的单色光是来自滤光片,谱带宽度从(40120)n m ,精度不高,分光光度法则要求近于真正单色光,其光谱带宽最大不超过(35)nm ,在紫外区可到1n m 以下,来自棱镜或光栅,具有较高的精度。
能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器称为分光光度计。
分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用(全波段)分光光度计等。
无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成,即光源、单色器、狭缝、样品池,检测器系统。
1 光的基本知识光是由光量子组成的,具有二重性,即不连续的微粒和连续的波动性。
波长和频率是光的波动性和特征,可用下式表示:λ=CV式中:λ—为波长,具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长;V —为频率,即每秒钟振动次数;C —为光速等于299770千米/秒。
光属于电磁波。
自然界中存在各种不同波长的电磁波,分光光度法所使用的光谱范围在200nm -10μ(1μ=1,000n m )之间。
其中200n m ～400nm 为紫外光区,400～760n m 为可见光区,760～10,000n m 为红外光区。
2 吸收光谱原理物质中分子内部的运动可分为电子的运动、分子内原子的振动和分子自身的转动,因此具有电子能级、振动能级和转动能级。
分光光度法
吸收 外观有颜色的药物在可见光区有特征吸收 都可用紫外-可见分光光度法进行分析。
仪器
可见分光光度计
721型分光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
一、基本组成
光源
单色器
样品室
检测器
显示器
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光
把分子吸收能量随波长变化的情况记录下来所得 的图谱为吸收光谱。
利用物质的吸收光谱进行定性、定量及结构分析 的方法称为吸收光谱法, 简称光谱法。
三、光的吸收定律
（一）百分透光率（T）和吸收度（A） 入射光 I0 → 吸收Ia → 透射It
I0 = Ia + It 透光率（描述入射光透过溶液的程度）
一、光的性质与波长范围
光的性质
光是一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和 粒子性。
光在传播时表现了光的波动性
一定的光波具有一定的波长 、频率 、光速c等 参数来描述:
c=
续前:
波长: 相邻两波峰或波谷之间的距离，波长的单位 可用纳米（nm），微米（um）表示:
1nm=10-3um=10-6mm=10-7cm=10-9m 频率（ ）: 是每秒内光波的振动次数，单位是
A=－lgT=ECL 朗伯-比尔定律适用于无色溶液、有色溶液及气
体和固体的非散射均匀体系。
（三）吸收系数
吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸收度。 A
E= CL
当溶液的浓度C的单位不同时，吸收系数的意义和表 示方法也不同，常用的表示方法有两种：
1、摩尔吸收系数：是指在一定波长下，溶液浓度为 1mol/L，液层厚度为1cm时的吸收度，用ε表示。
可见分光光度法和紫外分光光度法
光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的，它可用于紫 是利用光的衍射 干涉作用制成的 它可用于紫 衍射与 作用制成的，
外、可见及红外光域，而且在整个波长区具有良好的、几 可见及红外光域 而且在整个波长区具有良好的、 乎均匀一致的分辨能力。它具有色散波长范围宽、 乎均匀一致的分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨本 领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点是各级 领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点是各级 光谱会重叠而产生干扰。 光谱会重叠而产生干扰。 Back
εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了 表明了该吸收物质最大限度的吸光能力 最大限度的吸光能力， 光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度， 越大， 光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度，εmax越大，
表明该物质的吸光能力越强， 表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵 敏度越高，ε>1000即可进行分光光度法测定。 敏度越高， 即可进行分光光度法测定。 即可进行分光光度法测定
（四）检测器 检测器的功能是检测信号、测量单色光透过溶液后光 检测器的功能是检测信号、 强度变化的一种装置。 强度变化的一种装置。 常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。 常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等 光电池 硒光电池对光的敏感范围为300~800nm，其中又以500 ，其中又以 硒光电池对光的敏感范围为 ~ 600nm最为灵敏。这种光电池的特点是能产生可直接推 最为灵敏。 最为灵敏 动微安表或检流计的光电流， 动微安表或检流计的光电流，但由于容易出现疲劳效应而 只能用于低档的分光光度计中。 只能用于低档的分光光度计中。 光电管在紫外 可见分光光度计上应用较为广泛。 光电管在紫外-可见分光光度计上应用较为广泛。 在紫外 可见分光光度计上应用较为广泛 光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件，它的灵 光电倍增管是检测微弱光最常用的光电元件， 敏度比一般的光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器 敏度比一般的光电管要高 倍 狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。 狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。back
紫外可见分光光度计的操作和使用
紫外可见分光光度计是一种广泛应用于化学、生物、药物等领域的实验仪器，它可以用来测量样品对紫外和可见光的吸收情况，从而得到样品的吸光度和浓度等重要参数。
在科研实验室和生产现场中，紫外可见分光光度计的操作和使用技巧非常重要，正确的操作可以确保实验结果的准确性和可靠性。
下面将介绍紫外可见分光光度计的操作和使用方法：一、准备工作1.1 样品的制备：首先要准备好需要测量的样品，确保样品的制备符合实验要求，并且样品溶液的浓度和透明度在光度计测量范围内。
1.2 仪器的准备：打开紫外可见分光光度计的电源，将仪器预热至稳定的工作温度，同时检查仪器的灯泡和光栅等部件是否正常。
二、测量操作2.1 校准仪器：在进行测量之前，必须对仪器进行校准，保证测量结果的准确性。
2.2 装样品：将样品溶液分别加入光度计的比色皿或石英比色皿中，注意不要留下气泡或杂质。
2.3 设定参数：根据样品的特性和测量要求，设定光度计的波长、光程和测量范围等参数。
2.4 测量数据：开始测量之后，观察样品的吸光度变化曲线，并记录下稳定的吸光度数值。
三、数据处理3.1 计算浓度：根据测得的吸光度数值，使用比色法或标样法计算出样品的浓度。
3.2 分析结果：根据测得的数据，分析样品的吸收特性和浓度变化规律，得出实验结论。
四、仪器维护4.1 清洁保养：每次使用完毕后，要及时清洁光度计的仪器和光学部件，确保仪器的稳定性和精度。
4.2 故障排除：如果在使用过程中发现仪器出现故障或异常，及时进行故障排除和维修处理。
五、注意事项5.1 防止污染：在操作过程中要注意避免样品污染或交叉污染，确保测量结果的准确性。
5.2 安全操作：使用化学药品和致癌物质时，要做好个人防护，避免对身体造成伤害。
通过以上对紫外可见分光光度计的操作和使用方法的介绍，相信大家对这一实验仪器有了更加深入的了解。
正确的操作和使用方法可以帮助科研人员和实验人员获得准确可靠的实验数据，为科学研究和生产实践提供有力支持。
第七章分光光度法
第七章分光光度法【基本要求】1.1 掌握分光光度法基本原理—Lambert-Beer定律，能熟练运用Lambert-Beer 公式进行有关计算。
1.1 掌握吸光度、透光率、吸光系数、摩尔吸光系数的概念。
1.2 明确溶液颜色与光吸收的关系。
1.3 了解物质对光的选择性吸收及吸收光谱。
1.4 了解分光光度计的基本构造；提高测量灵敏度和准确度的方法。
1.5 了解紫外分光光度法进行物质定性分析和定量测定的基本原理。
【重点难点】2.1 重点分光光度法原理－Lambert-Beer定律。
紫外分光光度计的使用2.2 难点提高测量灵敏度和准确度的方法。
【讲授学时】4学时4.1 第一节概述一、比色分析法比色分析法：利用比较溶液颜色深浅的方法来确定溶液中有色物质的含量。
有色物质溶液颜色越深，浓度越大；颜色越浅，浓度越小。
二、比色分析法测定步骤①选择适当显色剂，使被测组分转变成有色物质，称为显色阶段。
测定无色溶液时要进行显色阶段。
②选择最佳条件测定溶液的深浅度，称为比色阶段。
三、发展过程：目视比色法→光电比色法→分光光度计（吸光光度法）四、比色与分光光度法的特点比色和分光光度法主要用于测定微量组分。
1、灵敏度高：测定试样中微量组分（1～0.001%）常用方法，甚至可测定10-4 ~ 10-5%的痕量组分。
2、准确度高：一般比色法相对误差为5～10%，分光光度法为2～5%，其准确度虽比重量法和滴定法低，但对微量组分的测定已完全满足要求。
如采用精密蓝450-480紫400-450红650-750青蓝480-490青490-500绿500-580黄580-600橙600-650白光分光度计，误差将减少至1～2%。
3、应用广泛：几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可以直接或间接地用比色法和分光光度法进行测定。
4、操作简便、快速，仪器设备也不复杂。
例如：试样中含Cu 量为0.001%，即在100mg 试样中含Cu 0.001mg ，用比色法可以测出。
邻二氮菲分光光度法测定铁含量
五、分光光度计使用方法
3. 测试样品步骤：（整个过程样品池盖关闭） 空白样品调零：1号溶液为空白样品（1号溶液透光率为 100%），利用拉杆（轻轻调节拉杆即可）使光路对准空
白样品进行调零， “模式”按键调到透射比-“100%”
按键（光全部退通过1号溶液，相当于将背景吸光度扣除 掉）
不 同 浓 度 的 同 一 物 质 ， 其 吸 收 曲 线 性 质 相 似 λmax 不 变 。 而 对 于 不同物质它们的吸收曲线形状和 λmax不同。
吸 收 曲 线 可 以 提 供 物 质 结 构 信 息，作为物质定性分析的依据。
二、 Lambert-Beer定律
根据Lambert-Beer定律数学表达式： A = εbc
邻二氮菲分光光度法 测定铁含量
2014年12月
实验目的
1. 通过本实验了解分光光度法的基本原理和基 本方法。
2. 掌握邻二氮菲吸光光度法测定铁的方法。
3. 学习吸光光度法测定铁吸收曲线和标准曲线 的绘制方法。
4. 了解分光光度计的构造、性能及使用方法。
一、分光光度法
分光光度法(spectrophotometry): 根据物质的分子对光的 选择性吸收而建立起来的分析方法，是应用分光光度计测量 溶液在某一波长下的吸光度以确定溶液中被测物质含量的分 析方法。
表5-3 标准溶液和待测溶液的吸光度数据记录
容量瓶编号
1（空白） 2
3
4
56
7（水样）
c稀释（Fe2+）/ mmol·L-1 0.00
吸光度A
0.00
？？
根据标准曲线 读出浓度数值
七、数据记录与结果分析
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Cu Cs
Au As
Cs
生物化学与分子生物学实验教学中心
利用标准曲线计算测定物含量
先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测出
它们的吸光度。然后以各管吸光度（A）为纵坐标，各 管的浓度（C）为横坐标，在方格坐标纸上作图。 若被测物质对光的吸收符合光的吸收定律，则必然 得到一条通过原点的直线，即标准曲线，亦称工作曲线 。以后对末知浓度物质测定时，无需再作标准管，据测 定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度。
• 读数后，将黑体放入光路中，开盖取出比色杯。
• 将参比液倒回原试管中，清洗比色杯并倒扣在滤纸上晾干
• 关机，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。
V-1100分光光度计 使用注意事项
• 注意防震、防潮、防光和防腐蚀。 • 每台仪器所配套的比色皿不能与其他仪器的比色皿单个调 换。 • 不可用手指或毛刷摩擦比色杯的透光面。 • 盛装参比液时，达到比色杯的3/4即可，不宜过多，以防 溶液溢出。 • 比色杯外壁如有液体，只能用滤纸沾去水份，再用擦镜纸 拭净。 • 注意比色杯的清洁，用后应先用自来水冲洗，再用蒸馏水 清洗。 • 测试结束要及时登记，仪器有问题及时报告。
MODE 0%
键切换到T档。 键校零,T=000.0。
• 开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯 架上，拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按
100%
键校T=100.0
MODE
• 合上盖，按
键切换到A档
• 拉动拉杆，将标准、待测液依次放入光路中 ，即可读取其吸 光度A值。重复3次，记录3组数据。
1
2
3
各管平均 A值
各管各测定3次，取其平均A值再代入公式计算。
2012春季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
结果计算
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
利用标准管计算测定物的含量
在相同条件下测定已知浓度（CS）标准液的吸光度（AS），
同时也测定末知浓度（CU）的吸光度（AU），
根据定律得：Au KuCuLu 因为：Ku Ks Lu Ls As KsCsLs
所以As与Au之比值也等于两浓度之比值 即 Au As Cu
分光光度法
南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心
2012春季学期
内容
1
2 3 3 4
分光光度法的原理 如何求被测组分的含量 分光光度计的基本结构 分光光度计的使用与注意事项
2012春季学期
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分光光度法
• 概念：是利用物质所特有的吸收光谱来 鉴别物质或测定其含量的一项技术。 • 特点：灵敏度高、精确度高、操作简便 、快速。对于复杂的组分系统，无须分 离即可检测出其中所含的微量组分的特 点。
加入物 蒸馏水 CuSO4标准液
B 3ml —
S — 3ml
U — —
CuSO4待测液
—
—
3ml
以空白管B调零，在690nm处，读取标准管S和待测管U吸光度A值，记 录3组数据，取平均A值，代入公式计算。
2012春季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
数据处理表格
各管测定次数
测定管 标准管
待测管
I
透过光强度
lg
Io I
k c
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
分光光度法的原理
• Lambert-Beer定律
如果同时考虑液层厚度和溶液浓度对光吸收的影响，将Lambert和Beer定律 合并，描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系。
lg
Io I
k l
＋
lg
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
根据测定管吸光度从标准曲线上即可求得测定物的浓度 。
A
0.8 0.6 0.4 0.2 0 1 2 3 4 5
C
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标准曲线(浓度-吸光度曲线）
2012春季学期
V-1100型可见光分光光度计
2012春季学期
生物化学与分子生物学实验教学中心
2012春季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
分光光度法的原理
• Lambert定律
C
L 液层厚度 溶液浓度
入射光强度 I0
I
透过光强度
透光率 T
I I0
lg
化学与分子生物学实验教学中心
分光光度法的原理
• Beer定律
C
L 液层厚度 溶液浓度
入射光强度 I0
2012春季学期
Io I
k c l
0，表示溶液完全不吸收光线； 值大，表示溶液吸收光线较多； 值无穷大，表示光线几乎被溶液完全吸收，即溶液不透光。 表示溶液对光吸收的程度，称作吸光度（absorbance ）， I0 I
生物化学与分子生物学实验教学中心
如何求被测组分的含量
1.利用标准管计算测定物的含量 2.利用标准曲线计算测定物含量 3.利用标准系数法求出待测溶液的浓度 4.利用消光系数法求出待测溶液的浓度
2012春季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
操作练习实验材料
• 试剂： CuSO4标准液 （8mg/ml） 待测CuSO4溶液 蒸馏水 • 器材：加样枪、刻度吸管、试管、试管架 V-1100型可见光分光光度计
2012春季学期
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操作练习步骤
分别取3支试管，做好标记，按下表操作：
Io I
k c
＝
lg
Io I
k c l
A k c l
2012春季学期 生物化学与分子生物学实验教学中心
分光光度法的原理
lg
公式的意义： 当I I 0时， lg 当I＜I 0时，lg 当I 0时，lg 由此可见， lg I0 I I0 I I0 I I0 I 用A表示，即A lg
V-1100分光光度计键盘控制的使用说明
A
T C F 0%T 100%T
0.000
MODE
A：吸光度 T：透射比 C：浓 度 F：斜 率
0%T MODE
ATCF切换键
100%T
校零、下降键
确认键
校100、上升键
V-1100分光光度计操作步骤
• 开机，预热30分钟。 • 转动波长旋钮，调所需波长。按 • 将黑体放入光路中，合上盖，按