临床免疫学检验 课件 第8章 荧光免疫技术

离心
抗体溶液
②透析法： 蛋白质含量低，样品体积小。
优点：标记均匀，非特异性荧光低。 缺点：时间长，荧光素用量多
TITC 抗体溶液 反应过夜
PBS
FITC 标记 的抗体溶液
③ 影响因素
温度和时间： pH：8.8～9.5 蛋白含量：20 ～25mg/mL 蛋白为宜 荧光素的纯度：不应低于75%
四、 荧光标记抗体的纯化
指荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱 甚至消退的现象。 原因： (1)紫外光照射长； (2)苯胺、酚、ＫＩ、铁、汞、镍等。 有利：猝灭剂消除不需要的荧光,如硝基苯
处理有荧光的镜油。 保存：避光、避免与其它化学物质接触
二、荧光物质
(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。
1、荧光色素应具备的条件 P87
(3)四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) ? 最大吸收光谱 : 550nm 。 ? 最大发射光谱 : 620nm 。 ? 荧光颜色: 橘红色。 ? 应用：
常用于双重标记或对比染色；
激发峰和荧光距离较大，易于选择滤光系统。
(4)藻红蛋白（ PE） ? 最大吸收光谱: 565nm 。 ? 最大发射光谱: 575nm 。 ? 荧光颜色: 橙色。 ? 应用：
3、花菁染料 (Cyanine Dyes ，Cy2，Cy3，Cy5） 荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定
性较强，荧光量子产率较高，对pH 等环境不敏感。常 用于多重染色。
Cy2比FITC 更稳定，荧光强度更大，光稳定性和抗 淬灭性更好。
Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮，更稳定，背景更 弱。
第八章 荧光免疫技术
Fluoroimmunoassay, FIA
荧光免疫技术
? 概念：是将免疫学反应的特异性与荧光 技术的敏感性结合起来的一种方法。
? 方法： 荧光抗体技术(FAT) : 用荧光素标记抗 体进行抗原定位、定量检测等。
第一节 荧光免疫试验的组成要素
一、荧光的基本知识
1.荧光：某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内发 射出的波长大于激发光波长的光。
录到的样品发射荧光的相对强度。
2.激发光谱 ：固定发射波长，用不同波长的激发光
激发样品,所记录到的相应的荧光发射强度。
3.荧光效率 ：是指荧光物质将吸收的光能转变成
为荧光的百分率。 荧光效率＝发射荧光的光量子数(荧光强度)/
吸收光的光量子数(激发光强度)
取决于荧光色素本身的物理特性
4.荧光的淬灭：
Cy5的缺点是不能用表面荧光显微镜观察，因此通常 用具有远红外检测器的共聚焦显微镜观察。
荧光显微镜观察
1、荧光显微镜
1）光源：（供能作用）用短波长的光源 提供很强的激发光源
高压汞灯：波长不连续：365nm ～435nm (紫外光或蓝紫光)
只能用作荧光激发光源 氙灯 卤素灯 光源有一定寿命：标本要集中观察
常可作为FITC的补充。
(二)其他荧光物质 1、镧系螯合物 ? 铕(Eu 3+)（应用最广）、 铽(Tb 3+) 、铈(Ce3+)的螯合物 ? 应用：荧光衰变时间长，用于时间分辨荧光免疫测定 2、酶作用后产生荧光的物质(荧光底物) ? 如碱性磷酸酶（4-甲基伞酮磷酸盐）、辣根过氧化物酶
（对羟基苯乙酸）的底物。 ? 应用：酶免疫荧光分析
第二节 荧光抗体的制备
一、抗体要求
纯度高、特异性强、亲和力高、效价高（双 扩效价 ≥1：32）
二、荧光素要求 三、荧光素标记抗体的方法
①搅拌法: 用于标记体积大, Pr含量高的Ab 溶液。 优点：标记时间短、荧光素用量少（10μg FITC/1mg Ig） 缺点：非特异性荧光高
逐滴加入FITC 溶液 搅拌4～6h
①人眼对黄绿色较橘色更为敏感。 ② 一般切片等标本中绿色的自发荧光少于红 色的，本底低 。 ? 缺点：易猝灭
(2)四乙基罗丹明 (RB200) ? 最大吸收光谱: 570nm 。 ? 最大发射光谱: 595-600nm 。 ? 荧光颜色: 亮橙、橘红色。 ? 应用：
常用于双重标记或对比染色。可作为 FITC 的补充，但其荧光效率较低。
2.产生机制：
百度文库
基态---能量(波长短的光)----激发态---荧光(波长长的光，光
致发光)---基态 化学物质 基态
吸收能量
激发态
释放能量：发光
3.特点： 即时性(停止供能，荧光现象即止 10-7～
10-8s） 4.能量来源 ：光、化学物质、射线。
有关参数
1.发射光谱： 固定激发波长，在不同波长下所记
①除去未结合的游离荧光素及其降解产物 :减少非特 异性染色的来源 透析法、凝胶过滤色谱法
②去除过度标记和未结合荧光素的抗体 ： 离子交换层析（搅拌）
③非特异反应物质的去除 ：以同一正常组织／同种 动物其它组织的组织粉预先吸收，使非特异荧光 大为减弱。
②阻挡滤片（barrier filter ）：吸收滤片或抑制滤片 位置：物镜和目镜之间 作用：使荧光通过(410～650nm) 阻断荧光以外的其它光。保护眼睛。
OG( 橙黄色)：
GG( 淡绿色)：
③隔热滤片 位置：灯室聚光器前 作用：阻拦红外线
3）镜头: 需消色差、无荧光
4）光路: 透射式：适于观察对光可通透的标本 落射式：适于观察透明度不好及各种活性组织
①能与蛋白质共价结合，结合蛋白质后不易解离，而未 与蛋白质结合的色素及其降解产物容易被清除
②荧光效率高 ③荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明 ④结合蛋白质后，不影响蛋白质的生化性质及免疫
学活性，而且标记方法简单、快速，结合物稳 定，易于保存。 ⑤安全无毒，不具有附加的抗原性。
2、常用的荧光色素： (1)异硫氰酸荧光素 (FITC） ? 最大吸收光谱 : 490-495nm 。 ? 最大发射光谱 : 520-530nm 。 ? 荧光颜色 : 黄绿色。 ? 应用最广 ：
2）滤片系统： ①激光滤片（exciter filter ）： 位置：光源和物镜之间 作用：使短波长的光通过、吸收长波长的光
紫外光滤片： UG 通过275nm ～400nm 阻挡400nm 以上的可见光
组织的自发荧光弱,呈灰蓝色 蓝紫外光滤片： BG 通过325nm ～500nm
荧光强度大,适于观察细菌标本; 不适于观察有自发荧光的组织标本