第三章 发酵工业培养基设计 2

第三章发酵工业培养基设计内容提要•发酵工业培养基的基本要求•微生物的培养基类型及功能•发酵工业培养基的成分及来源•发酵培养基的设计原理与优化方法微生物在人工培养和自然条件下的生理学特性有很大不同，其中培养基的组成对微生物的各种代谢活动的影响最为显著。

⏹培养基：是指入们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。

⏹广义上讲培养基是一切可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料。

⏹同时培养基也为微生物提供除营养外的其它所必需的条件，工业生产上选择的培养基俗称发酵培养基，还应包括能够促进微生物合成产物所必须的成分。

一、用于大规模发酵的培养基应该具有以下几个特点：⏹必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分；⏹能提高单位营养物质的转化率；⏹有利于提高单位容积发酵罐的生产能力；⏹有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期；⏹有利于减少副产物的形成，便于后期的分离纯化；⏹培养基的原料应因地制宜、价格低廉、性能稳定、取材容易；⏹所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等等。

二、培养基的类型及功能1. 按纯度分类，分为合成培养基和天然培养基(复合培养基)。

⏹合成培养基所用的原料其化学成分明确、稳定，比如药用葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾等。

⏹天然培养基常用于发酵生产，它的原料是一些天然动植物产品，例如花生饼粉、蛋白胨等，其特点是营养丰富、适于微生物的生长。

M 培养基(1L)：Na 2HPO 46g ，KH 2PO 43g ，NaCl 0.5g ，NH 4Cl 1g ，MgSO 4.7H 2O 0.5g ，CaCl 20.011g ，葡萄糖2-10, pH 7.0 YPS 培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g ，酵母提取物（英国Oxoid ）5g, NaCl 10g ，pH 7.2培养大肠杆菌常用两种培养基2. 按用途分类⏹斜面培养基：是供微生物生长繁殖或保存菌种用。

这种培养基的特点是富含有机氮源，能使菌体迅速生长或产生较多优质的孢子，且不易引起菌种发生变异。

⏹种子培养基：是供种子扩大培养用。

这种培养基的特点是除含有丰富的氮源外，还含有生长因子，能使微生物细胞快速分裂和生长，成为活力强的“种子”。

⏹发酵培养基：是供菌体生长、繁殖和合成产物用。

它是发酵生产最主要的培养基，为了最大限度的获得目的产物，必须根据菌体自身的生长规律、产物合成的特点来设计培养基。

三、培养基的成分及来源微生物细胞含有80%的水和20%的干物质，干物质又包括50%的碳素、5%-13%的氮素、3%-10%的矿物质元素。

⏹碳源⏹氮源⏹无机盐及微量元素⏹水⏹其它成分（一）、碳源凡是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称为碳源。

生产中常用的碳源有糖类、油脂、有机酸、低碳醇和其它碳氢化合物等。

1、糖类糖类是发酵培养基中应用最广泛的碳源，常用的主要有葡萄糖、糖蜜和淀粉。

葡萄糖是最容易利用的碳源，几乎所有的微生物都能利用它。

但过多的葡萄糖会产生葡萄糖效应，即导致培养基中的溶解氧含量下降，使中间代谢产物不能完全氧化而积累，导致PH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。

糖蜜是制糖工业的副产物。

一般糖蜜分为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜，糖蜜常用在酵母发酵、丙酮丁醇的生产、抗生素生产等微生物工业中作为碳源。

在酒精工业中，用糖蜜代替甘薯粉则可以简化生产工艺。

糖蜜使用的注意点：除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。

例：谷氨酸发酵有害物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）预处理：澄清→脱钙→脱除生物素例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：→黄血盐淀粉糊精等多糖也是常用的碳源⏹使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类⏹优点：来源广泛、价格低廉，可以解除葡萄糖效应。

⏹缺点：发酵液比较稠，一般先液化或糖化后再作为培养基原料使用。

⏹常用的淀粉为玉米淀粉、小麦淀粉和甘薯淀粉(半纤维素酶)(1.5g麸皮)摘自李江华，无锡轻工大学学报，20042、油和脂肪油和脂肪也能被许多含有比较活跃的脂肪酶的微生物作为碳源和能源。

常用的油有菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油等。

在发酵过程中加入的油脂还兼有消泡的作用。

（1）、有机酸一些微生物对许多有机酸(如乳酸、柠檬酸、乙酸等)有很强的氧化能力，因此有机酸和它们的盐也能作为微生物的碳源。

有机酸被酶水解为甘油和脂肪酸，在溶解氧的作用下氧化成CO2和H2O，释放大量的能量。

作为碳源，氧化产生的能量被菌体用于生长繁殖和代谢产物的合成，有机酸氧化时，常伴随碱性物质的产生，对整个发酵过程中pH的调节和控制也有影响。

例如醋酸盐作为碳源时，其反应时如下：CH3COONa2CO22CO2H2O NaOH+++（2）、烃和醇类自然界中，能同化乙醇的微生物和能同化糖质的微生物一样普遍，且种类繁多。

近年来随着石油工业的发展，烷烃(一般是从石油裂解中得到的14～18碳的直链烷烃混合物，以及甲烷、乙烷、丁烷等)用于有机酸、氨基酸、维生素、抗生素、酶制剂和单细胞蛋白的工业生产中。

)甲醇甲烷乙醇葡萄糖醋酸正烷烃(C18含碳量/%52.240408537.575菌体得率/(g0.830.500.43 1.400.670.88细胞/g碳源)乙醇与其它碳源的比较（二）、氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和合成含氮代谢物。

分为有机氮源和无机氮源。

1、有机氮源有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、尿素、和酒糟等，它们在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢。

成分复杂：有机氮源除提供蛋白质、多肽和游离氨基酸外，还提供少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素和某些生长因子。

例如玉米浆：①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸②较多的乳酸③硫、磷、微量元素等有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响。

既可以作为菌体生长繁殖的营养物质，还可以为某些产物的合成提供前体。

例如，半胱氨酸和α-氨基己二酸是合成青霉素和头孢菌素的主要前体，甘氨酸可作为L-丝氨酸的前体等。

2、无机氮源种类：常用的无机氮源有铵盐、硝酸盐和氨水。

特点：因为微生物对它们的吸收利用一般比有机氮源快，所以也称为“速效氮源”。

无机氮源的迅速利用常会引起PH 的变化。

NaOHO H NH H NaNO SO H NH SO NH ++→++→2323423424242)(经微生物生理作用(代谢)后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质；代谢后能产生碱性物质的无机氮源叫生理碱性物质。

氨水可以调节pH ，在许多抗生素的生产中普遍使用，例如链霉素和红霉素的生产中。

氨水添加时要加强搅拌，少量多次。

在氨水中还含有多种嗜碱微生物，因此在使用前应用石棉等过滤介质进行除菌过滤。

PH变化与酶活性的研究陈涛，中国酿造，2004PH变化对中性蛋白酶影响大无机氮源的影响：硫酸铵>硝酸铵>硝酸钠>尿素氮源使用的一些相关问题：❑有机氮源和无机氮源应当混合使用早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质❑有些产物会受氮源的诱导和阻遏❑有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力3、无机盐及微量元素微生物在生长繁殖和产物合成中都需要无机盐和微量元素，如磷、硫、铁、镁、钙、锌、钴、钾、钠、锰、氯等。

其中许多金属离子的浓度与微生物生理活性相关，低浓度时往往呈现刺激（促进）作用，高浓度则表现出抑制作用。

在培养基中，磷、硫、镁、钙、钾、钠、氯等常以盐的形式加入，而钴、铜、铁、锰、锌、钼等因需要量很少，除了合成培养基，一般复合培养基中不另外单独加入。

当然也有少数例外，例如生产维生素，钴元素是重要的组成成分，需要额外加入氯化B12钴来补充钴元素的不足。

无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质。

主要功用是：①、构成菌体成分（磷—核酸和蛋白质）；②、作为酶活性基的组成部分或维持酶的活性（镁—许多重要酶的激活剂、铁—细胞色素氧化酶、过氧化氢酶的组成成分、硫—某些辅酶的活性基）；③、调节渗透压、pH值、氧化还原电位等（钾、钠、钙）；④、作为自养菌的能源(磷—ATP)。

例：铁离子青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml发酵罐必须进行表面处理B、使用时注意盐的形式（pH的变化）例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，磷对酶活的影响pH 酶活不加 4.25 120分钟加K2HPO4 5.45 30分钟加KH2PO4 4.62 75分钟用量：根据具体的产品，以实验决定使用注意点：A. 对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑4、水水是所有培养基的主要组成成分，也是微生物机体的重要组成成分。

可以通过物理和化学的方法得到去离子或脱盐的工业用水。

水源质量的主要考虑参数包括：pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。

在工业发酵中，水直接参加一些微生物生理代谢外，还能调节细胞温度，提供必要的生理环境。

5、其它成分（1）、生长因子凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子。

不是所有的微生物都必需的。

例如赖氨酸产生菌几乎都是谷氨酸产生菌的各种突变株，属于生物素缺陷型。

有机氮源是生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B族维生素和微量元素以及一些微生物生长不可缺少的生长因子，比如玉米浆。

（2）、前体前体：是指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合的产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因此有较大的提高一类化合物。

在实际生产中前体的加入不仅可以提高目的产物的产量，还可以显著提高产物中目的成分的比重。

在青霉素生产中加入苯乙酸可生产青霉素G ，而用苯氧乙酸作为前体则可生产青霉素V。

NS H H COOH H NO OCOOH 青霉素G 分子量356苯乙酸分子量136作用：前体有助于提高产量和组份比例（3）、产物合成促进剂产物合成促进剂：是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。

四、培养基的设计与优化目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照前人所使用的较适合某一类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。

（一）、发酵培养基的设计原理⏹菌体的同化能力⏹对菌体代谢的阻遏和诱导的影响⏹合适的C：N比对菌体代谢调节的重要性⏹pH对不同菌体代谢的影响1、菌体的同化能力一般只有小分子能够通过细胞膜进入细胞体内进行代谢，微生物能够利用复杂的大分子是由于微生物能够分泌各种各样的水解酶类，在体外将大分子水解为微生物能够直接利用的小分子物质。