培养基成分及设计

不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响
糖蜜使用的注意点：
除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是 许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。
例：谷氨酸发酵 有害物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）
生物素（发酵控制）
预处理：澄清→脱钙→脱除生物素 例：柠檬酸发酵
有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成） 预处理：→黄血盐
有些产物会受氮源的诱导和阻遏 例： 蛋白酶的生产
有机氮源选取时也要考虑微生物的同化能力
开发效果好、有针对性的有机氮源仍然是令人感兴趣 的课题
3、无机盐和微量元素
✓作用：各种不一样 ✓来源：C、N源，以盐的形式补充 ✓用量：根据具体的产品，以实验决定， ✓使用注意点
对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和 微量元素在发酵过程中必须加以考虑
当培养基中Mn2+ 缺乏时，微生物体内积累几种氨基酸 （GA、GLu、Arg、Oin等），这些氨基酸的积累，意味着 体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受 到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。
2、丙酮酸羧化酶：组成酶，催化生成草酰乙酸。
3、丙酮酸脱氢酶：催化生成乙酰CoA，和丙酮酸固定CO2 反应相平衡。
②丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。丙酮酸氧化
脱羧生成乙酰CoA和CO2的固定两个反应的平衡，以及柠 檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。
• ③顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：
•
柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7
•
同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，
使柠檬酸积累。
• ④随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸 酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累。
⑤非粮食生物质的转化
农业：农作物废弃物
林业：木材废弃物，森林疏伐，灌木处理
组成：纤维素、半纤维素、木质素
生物质将为未来世界不断地提供可再生能源和材料。美国能源部 提出到2030年生物质要为美国提供5%的电力、20%的运输燃料 和25%的化学品，相当于当前石油消耗量的30%，每年需要用10 亿吨干生物质原料，是当前消耗量的5倍。要达到此目标，廉价 原料的持续供应是关键。农作物废弃物生物质可作为近期生产燃 料和化学品的纤维素原料。但是，必须要开发一个综合的原料供 应系统，以合理的价格提供原料。
（二）三羧酸循环的调节
1、柠檬酸合成酶的调节：柠檬酸合成酶是TCA循环第一个 酶。但黑曲霉中柠檬酸合成酶没有调节作用。
2、顺乌头酸水合酶、异柠檬酸脱氢酶的调节：
顺乌头酸水合酶是催化柠檬酸<>顺乌头酸<>异柠檬酸 正逆反应的酶，研究表明，黑曲霉中有一种单纯的位于线 粒体上的顺乌头酸水合酶，它在催化时能建立下面的平衡： 柠檬酸:顺乌头酸:异柠檬酸＝90:3:7。
③ 培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源 丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的 供应。
④ 所选用的培养基应能满足总体工艺的要求，如不应该影响 通气、提取、纯化及废物处理等。
一 培养基的类型及功能
培养基按其组成物质的纯度、状态、用途可分为三大类型
1、按纯度
合成培养基 : 原料其化学成分明确、稳定 适合于研究菌种基本代谢和过程的物质变化规律
4 前体的控制
5补料，即中间补料法，控制基础料的量，发酵过程中补料， 目的是为了避免菌体的生长繁殖过快，导致过早衰老，使 产物合成的旺盛期延长，控制代谢的方向。
• 以柠檬酸发酵为例
（一）糖酵解及丙酮酸代谢的调节
1、磷酸果糖激酶（PFK）：
Mn2+浓度对磷酸果糖激酶的影响
Mn2+ 缺乏为何会使NH4+浓度升高呢？
例 玉米浆： ①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸 ②较多的乳酸 ③硫、磷、微量元素等
有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过 程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响
氮源使用的一些相关问题：
有机氮源和无机氮源应当混合使用 早期：容易利用易同化的氮源—无机氮源 中期：菌体的代谢酶系已形成、则利用蛋白质
4、生长因子、前体和产物促进剂
生长因子
从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机 物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。
如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷 型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重 要的作用 。
有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源 含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可 缺少的生长因子
注意事项
• 细菌,碳源浓度超过5%,脱水 • 酵母或霉菌,高达200g/L • 碳分解代谢物阻遏
2、氮源 氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、
核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机 氮源和无机氮源。 无机氮源
种类：氨盐、硝酸盐和氨水
特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利 用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变 化如：
前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化， 流加也有利于提高前提的转化率
产物促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又
非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。
促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方 面的。
➢ 有些促进剂本身是酶的诱导物；
➢ 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，
前体
前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接被微生 物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结 构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大 的提高。
青霉素：分子量356
苯乙酸:分子量136
用法：前体使用时普遍采用流加的方法
前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%
第五章 培养基成分及设计
培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长 繁殖 所需的一组营养物质和原料。同时培养基也为微生 物培养提供除营养外的其它所必须的条件。
发酵培养基的作用：
➢ 满足菌体的生长 ➢ 促进产物的形成
发酵培养基的要求
① 培养基能够满足产物最经济的合成。
② 发酵后所形成的副产物尽可能的少。
工业上常用的糖类
① 葡萄糖
➢ 所有的微生物都能利用葡萄糖 ➢ 但是会引起葡萄糖效应 工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质
量指标
不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大
② 糖蜜 糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。
糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分 甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。
CH3CHO+NaHSO3
CH3 CH OH
OSO3Na 这就使乙醇代谢途径中的乙醛不能成受氢体，而使
NADH在细胞中积累，从而激活 -磷酸甘油脱氢酶的活性 ，使磷酸二羟基丙酮取代乙醛作为NADH 的受氢体，而还
原为 - 磷酸甘油，其水解后即形成甘油。
三 营养成分的调节
1 不同碳源的利用速度
③ 淀粉、糊精及其水解液
使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类 缺点：难利用、
发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶 成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。
优点：来源广泛、价格底 难利用，可以解除葡萄糖效应
例：地衣牙孢杆菌生产α-淀粉酶
碳源对生长和产酶的影响
碳源 葡萄糖 蔗糖 糊精 淀粉
顺乌头酸水合酶、NAD和NADP-异柠檬酸脱氢酶在柠檬 酸产生与不产生时，这3种酶均存在，而当铜离子0.3mg/L， 铁离子2mg/L和pH2.0情况下，这3种酶均不出现活力，发酵 中柠檬酸正是在这个pH条件下积累的。
3、α-酮戊二酸脱氢酶的调节
在黑曲霉柠檬酸产生菌中，TCA循环的一个显著特点 是，α-酮戊二酸脱氢酶的合成受葡萄糖和铵离子的阻遏。 因此当以葡萄糖为碳源时，在柠檬酸生成期，菌体内不存 在α-酮戊二酸脱氢酶或活力很低。
例1：铁离子 青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml，发酵罐必 须进行表面处理
啤酒生产中要控制铁离子的含量
例2 磷酸盐 的影响 • 谷氨酸发酵中，过高磷酸盐降低谷氨酸产量，代谢转向缬
氨酸 • 抗生素受到磷酸盐的影响较大 • 淀粉酶生产中需要较高浓度的磷酸盐
• 适合微生物生长的磷酸盐浓度是0.3~300mmol，适合次级 代谢产物合成所需的浓度平均仅为0.1mmol
培养基营养单一，价格较高，不适合用于大规模工业 生产
天然培养基: 采用天然原料 料质量等方面不加控制会影响生产稳定性
2、按状态
固体培养基 :适合于菌种和孢子的培养和保存，也广泛应 用于有子实体的真菌类，如香菇、白木耳等的生产 半固体培养基:即在配好的液体培养基中加入少量的琼 脂，一般用量为0.5%～0.8% ,主要用于微生物的鉴定。 液体培养基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不 溶性 的营养成分，是发酵工业大规模使用的培养基。
α-酮戊二酸脱氢酶催化的反应是TCA循环中唯一不 可逆反应，一旦α-酮戊二酸脱氢酶丧失，就会引起：① TCA循环中的苹果酸、富马酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆 TCA循环生成，使TCA循环成“马蹄形”。②α-酮戊二 酸又抑制异柠檬酸脱氢酶的活性。
小结：
①Mn2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑，解除磷酸果糖激 酶的代谢调节，促进EMP途径畅通。
(NH4)2SO4 → 2NH3 + 2H2SO4
NaNO3 + 4H2 → NH3 + 2H2O + NaOH
无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸 性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸 性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢 后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如 硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程 的pH有积极作用。