精细化工生产技术-第五章 生物精细化学品1

第五章生物精细化工产品
第一节生物化学工程基本知识
生物化工产品的发展：
第一代生物化工产品：酿酒、制醋、面团发酵是人类最早掌握的生物技术。

从
19世纪80年代起到20世纪30年代末为止，不少发酵产品，
如乳酸、面包酵母、乙醇、甘油、丙酮、正丁醇、柠檬酸等
相继投入生产。

第二代生物化工产品：在20世纪40年代随着抗生素工业的兴起而出现的，青霉
素、链霉素、氯霉素先后投产。

第三代生物化工产品：1974年以后，，生物学取得了以重组DNA（脱氧核糖核
酸）技术和细胞融合技术为代表的一系列新的成就，如用
DNA重组体菌种生产的胰岛素、干扰素、疫苗以及用杂交
瘤技术生产的单克隆抗体等。

基本知识准备：
一、生物化学工程的定义及特点
生物反应过程是利用生物催化剂，即游离或固定化的活细胞或酶从事生物化工产品的生产过程。

发酵过程--当采用活细胞催化剂(主要是整体的微生物细胞)。

酶反应过程--利用从细胞中提取得到的酶为催化剂。

生物反应过程包括4个组成部分：
（1）原料预处理即底物或培养基的制备过程，包括原料的物理、化学加工和灭菌过程。

（2）生物催化剂的制备生物催化剂是指游离或固定化的活细胞或酶，微生物是最常用的活细胞催化剂，酶催化剂则是从细胞中提取出来的，只在经济合理时才被应用。

不同菌株和不同酶的催化专一性、活力及稳定性有很大差异，因此有关菌种分离、筛选、选育是不可缺少的。

（3）生物反应的主体设备即生物反应器，凡反应中采用整体微生物细胞时，反应器则称发酵罐；凡采用酶催化剂时，则称为酶反应器。

（4）生物化工产品的分离和精制这一部分常称下游加工，是生化分离工
程的主要内容。

特点：
A：由于采用生物催化剂，可在常温常压下进行反应，但生物催化剂易于失活，易受环境影响和污染，一般采用分批操作；
B：可采用再生性的生物资源为原料，且来源丰富，价格低廉，过程中产生的废料危害性较小，但往往形成原料成分不易控制，对生产控制和产品质量带来影响；
C：生产设备较为简单，能量消耗较少，但由于反应液的底物和产物浓度不能太高，造成反应器体积很大；
D：酶反应的专一性强、转化率高，但成本较高；发酵过程应用面广、成本较低，但反应机理复杂，难以控制，产物中常含有杂质，给提取带来困难。

二、生物催化剂
广义上讲：指由生物产生用于自身新陈代谢，维持其生物活动的各种催化剂。

工业上：指游离或固定化的酶或活细胞的总称。

包括：
A::从生物体，主要是微生物细胞中提取出来的游离酶或经固定化技术加工后的固定化酶；对应的过程为：酶反应过程
B：统称为活细胞催化剂的游离的、以整体微生物为主的活细胞及固定化活细胞。

对应的过程为：发酵过程。

特点：
能在常温常压下反应，反应速率快，催化作用专一、价格较低等优点，缺点是易受热、受某些化学物质的及杂菌的破坏而失活，稳定性较差，反应时的温度和pH值范围要求较严格，用作固定化酶或固定化活细胞时，使用寿命一般不少于30批，否则经济上不合理。

在生物反应过程中，生物催化剂的选择应从技术上的可能性和经济上的合理性作全面比较：
1、活细胞催化剂
目前，工业上用作活细胞催化剂的几乎都是活体微生物细胞，统称为工业微生物，包括多种细菌、放线菌、酵母菌、霉菌等。

微生物个体虽小，但它是一个能在特殊条件下生活及具有某些特性的独立的生命体，有完整的酶系统，代谢能力和繁殖能力都很强，对环境有很大的适应性，对营养要求一般不高。

微生物还有易于改变遗传性能，包括改变其对环境的适应性、代谢途径等性能的特点，且可利用重组DNA技术及细胞融合技术对生产菌种作更深入的改造。

工业微生物主要应用于有机溶剂、有机酸、抗生素、氨基酸、酶制剂、维生素C、单细胞蛋白等生物化工产品的生产，同一产品可用不同的微生物进行生产；有时一种微生物在不同条件下能产生不同产物，为此，根据不同情况合理选择菌种是十分重要的。

2、酶催化剂
酶是一类由生物体产生的具有高效专一催化功能的蛋白质。

生物体内：酶参与催化几乎所有的物质的转化过程，与生命活动有密切关系。

生物体外：可作为催化剂用于工业生产。

特点：
1）很高的催化效率
温和条件下，其催化效率是一般非生物催化剂的109—1013倍
2）选择性极高
一种酶通常只能催化一种或一类反应，而且只能催化一种或一类反应物的转
化，包括立体化学结构上的选择性。

与活细胞催化剂相比：
它的催化作用专一，无副反应，便于过程的控制和产品的分离。

提取方法及应用形式：
来源：主要从微生物发酵获得
提取方法：将细胞破碎，取得含酶的浆液；胞外酶则直接从发酵液中提取，如用色谱法、分级沉淀法等。

对于不同的用途，有不同的纯度要求。

状态：常见的酶制剂是粉状或浓缩液状态。

工业应用范围：
酶催化剂广泛应用于食品工业、纺织工业、皮革业、农业、制药业、轻工、化工等行业的生产；在精细化工方面，用于生产氨基酸、半合成抗生素、助消化药、消炎药、抑制肿瘤药、以及用固定化酶制造人工脏器等。

在利用资源和能源开发方面，生物催化剂有极为广阔的前景。

三、生物反应器
生物反应器是易活细胞或酶为生物催化剂进行的细胞增殖或生化反应提供适宜环境的设备。

生物反应过程中的关键设备。

包括：发酵罐、酶反应器、动植物细胞培养装置
1、发酵罐
发酵罐若根据其使用对象可分为嫌气发酵罐
好气发酵罐
污水生物处理装置等。

其中嫌气发酵罐最为简单，生产中不必导入空气，仅为立式或卧式的筒形容器，可借助发酵中产生的CO：气体搅拌液体。

若以操作方式区分，有分批操作和连续操作两种。

前者一般用釜式反应器，后者可用连续搅拌式反应器或管式及塔式反应器。

好气发酵罐按其能量输入方式或作用原理区分，可有如下几种：
(1)具有机械搅拌器和空气分布器的发酵罐
这类发酵罐应用最普遍，称为通用式发酵罐。

所用的搅拌器一般为使罐内物料产生径向流动的六平叶涡轮搅拌器，它的作用为破碎上升的空气泡和混合罐内的物料。

若利用上下都装有蔽板的搅拌叶轮，搅拌时在叶轮中心产生局部真空，可吸入外界的空气，则称为自吸式机械搅拌发酵罐。

(2)循环泵发酵罐用离心浆料泵将料液从罐中引出，通过外循环管返入罐内。

在循环管顶端再接上液体喷嘴，使之能吸入外界空气的，称为喷射自吸发酵罐。

(3)鼓泡塔式发酵罐以压缩空气为动力进行液体搅拌，同时进行通气的气升式发酵罐。

2．酶反应器
酶反应器分为游离酶反应器及固定化酶反应器两大类。

(1)游离酶反应器酶以水溶液状态与底物反应。

若用分批釜式反应器，酶就不能回收；
(2)固定化酶反应器除了和化学反应器类似的固定床反应器和流化床反应器外，还有多种特殊设计。

3．生物反应器的特点
生物反应器与一般化学过程的反应器相比，其基本原理和结构是相近的，但有如下特点：
①在常温常压下操作，但要求能耐受蒸汽灭菌，设备制作应严密无隙以防染菌，且用对微生物或酶无毒害的材质制作；
②当用微生物作催化剂时，催化剂本身是在发酵罐中产生的(开始时需接入菌种)，为防止杂菌污染和活性衰退，一般采用分批釜式反应器；
③酶常因底物的浓度过高发生抑制作用，微生物细胞因胞内外渗透压平衡问题，要求底物浓度也不能太高，因而反应器体积相当庞大；
④在发酵过程中，生化反应机理和途径相当复杂，反应时又常是气、液、固三相并存，有的反应液粘度大，流变学性质复杂，给反应器中物料的混合和传递带来不利，使采用化学反应工程的原理和方法解决生物反应器的设计放大问题遇到较大困难。

四、发酵过程
发酵过程是指在活细胞催化剂作用下所进行的系列串联反应过程，以生产生物化工产品。

一般采用分批操作的方式。

发酵过程是生物反应过程的一个基本过程。

1．发酵过程分类
按发酵产品的不同可将发酵过程分为4个主要类型：
①以获得微生物细胞为产品的过程；
②以获得微生物酶为产品的过程；
③以获得微生物代谢产物的过程，代谢产物包括分解代谢产物和合成代谢
产物，分解代谢产物是指菌体利用基质。

④以获得微生物进行生物转化后产物的过程，即利用微生物细胞内专一性酶
将一种化合物转化为结构上与之相关的另一种产物的过程。

比较：
按操作过程发酵过程可分为分批培养、连续培养和半连续培养法。

按培养基的性质发酵过程还可分为固体培养和液体培养，后者又可分为表面培养和深层培养。

大多数发酵产品，目前是采用分批深层培养法。

嫌气性微生物分解代谢产物，如丙酮—丁醇、乙醇等发酵生产，采用连续培养法。

2．发酵工艺流程
发酵法生产生物化工产品，其工艺流程可分成6个基本组成部分：
①供菌体生长和产物形成所用培养基的制备；
②培养基、发酵罐和附属设备的灭菌；
⑧供发酵生产用的种子制备；
④在发酵罐中提供最佳条件，以使菌体生长和形成产物；
⑤产品的提炼和纯化；
⑥生产中所产生的废物的处理。

3．发酵过程的控制
为了使细菌的生长和产物的形成能沿着所要求的方向进行，必须对发酵过程中的生物、化学和物理变量，即有关发酵参数进行检测和控制。

可被检测或控制的工艺参数如下表：
参数检测尽可能采用能置于发酵罐内、可耐蒸汽灭菌的传感器，或采用与罐连通的测量装置通过在线控制仪表显示或记录。

对过程的控制可以通过手控、常规控制仪表或计算机控制进行。

五、酶反应过程
酶反应过程是指利用酶催化剂所具有的特异催化性能，借助供医学手段和生物反应器装置来生产所需的生物化工产品的过程。

特点：
与发酵过程相比，它采用了反应专一性的酶为催化剂，无副产品，精制过程和产物分离纯化较方便。

在生物反应器及操作方式上有较大的选择余地，除分批釜式反应外，可考虑用膜式反应器进行连续操作。

在应用固定化酶为催化剂时，更可采用各种固定床和流化床的连续操作反应器。

分类：
以酶为催化剂的酶反应过程，可根据作用于底物的酶性质决定。

以单一酶为催化剂的反应称单酶反应；以两个或两个以上酶参与反应的过程称多酶反应；或称多酶串联反应。

从化学反应工程角度出发，酶反应过程可分为液相催化反应及多相催化反应，后者以液固相催化反应为主。

游离酶的反应属于液相催化反应，而固定酶的反应则属于多相催化反应。

酶反应步骤
以工业生产为目的的酶反应过程可由以下5个步骤所组成：
①产生酶的微生物发酵过程；
②胞内酶的微生物细胞破碎过程、可用机械研磨、高压匀浆器进行破碎，
也可用加入溶菌酶的方法，或用超声波、反复冻融的物理方法处理；
⑧酶的分离纯化过程，根据酶分子与其他蛋白质之间的性质差异(如分子大
小、溶解度的不同)，用盐析法、有机溶媒沉淀法、电渗析法、离子交换
色谱和电泳法等技术，将酶进行分离纯化；
④为了提高酶的催化性能，将酶固定在载体上的固定化过程；
⑤酶反应器的设计和酶反应控制对于游离酶反应，通常采用分批搅拌槽式反
应器；对于固定化酶反应，则常用连续柱式反应器。

2．酶反应工艺流程
利用酶反应来生产所需的生物化工产品，其工艺流程可分为单酶反应和多酶反应两种。

(1)单酶反应具有操作稳定、分离简便、收率高、成本低等优点。

(2)多酶反应
六、生化分离工程
生化分离工程是生物化学工程的一个组成部分。

生物化工产品是通过发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得的，从上述培养液或反应液中分离、精制有关产品的过程即称为生化分离工程或称下游加工过程。

培养液是复杂的多相系统，生化分离过程的一般步骤包括提取和精制，
1．提取
提取包括培养液(如发酵液)的预处理和细胞的破碎与分离两部分。

(1)培养液的预处理
目的在于改变培养液的性质，使其便于过滤和提取。

一种有效的方法是加入絮凝剂，使细胞或溶解的大分子化合物聚结成较大的颗粒。

无机絮凝剂有硫酸铝、氯化钙、氯化铁、碱式氯化铝等。

有机絮凝剂有聚丙烯酰胺、聚丙烯酸钠、聚季铵酯等中性、阴离子型和阳离子型的絮凝剂。

高聚物的相对分子质量对絮凝效果有很大的影响。

由于细胞表面常带负电，因此处理培养液常用阳离子型絮凝剂。

(2)细胞的破碎和分离细胞破碎的方法有机械、生物和化学等各种方法。

生产中常用高压匀浆器和珠磨机，
2．精制
生化产品精制的方法常用沉淀、萃取、吸附和离子交换以及超滤等，简要介绍如下。

(1)沉淀法
溶解的蛋白质由于表面电荷或极性基团所形成的水化层而达到稳定，加入高浓度的无机盐，如硫酸铵，可使蛋白质沉淀。

(2)萃取法
(3)吸附和离子交换
广泛用于抗生素和氨基酸提取。

(4)超滤法
主要用于胞外酶的浓缩和去除低相对分子质量的杂质。

(5)色谱分离
几个前沿技术简介：
一、重组DNA技术
重组DNA技术，也称基因工程或遗传工程，是一种于20世纪70年代在分子遗传学、细胞生物学基础上发展起来的新技术，利用这种技术可以按照人们的设计改造和组建生物品种，包括进行菌种性能改良。

二、细胞融合技术
细胞融合技术是一种新的获得杂交细胞以改变细胞性能的技术。

细胞融合可以在分类学上亲缘关系较远的生物之间进行，因此它不但是菌种改良的重要手段，而且是动植物品种改良的一种有潜力的方法。

生物化工产品，按产品性质分：
大宗生物化工产品，如乙醇、丙醇、甘油、乳酸等
精细生物化工产品，如各种氨基酸、酶制剂、各种抗生素、生物农药等。

现代生物技术产品，如干扰素、单克隆抗体、新型疫苗等。

第二节酶制剂
酶是由细胞产生的具有催化活性的特殊蛋白质，广泛地存在于动植物和微生物中。

作为一类生物催化剂，它参与生物体内的一系列代谢反应，如果没有酶，就没有生物体的新陈代谢，也就没有生命活动。

酶作为催化剂与一般化学催化剂相比，具有专一性强、催化效率高，反应条件温和、环境污染少和能耗少等特点。

目前，生物界发现的酶已有3000多种，其中大多数来自动物，但工业上大量生产的20多种酶主要来自微生物。

一、酶的基本概念
酶是活细胞成分之一，有活细胞产生，它是一种具有催化活性的蛋白质，其功能与化学催化剂相似。

酶虽然是由活细胞产生的，但并非只能在细胞内才起作用。

在一定的条件下，酶可以离开机体而发挥催化作用，这对酶的产生和应用有重要意义。

酶的化学本质是蛋白质，所以酶的性质、组成及结构都与蛋白质完全一致。

1．酶的组成
酶是大分子，相对分子质量在一万至数百万之间，酶的元素组成有C、N、H、O外，还有少量的S、P、Fe和其他元素。

酶按其组成可分为单成分酶和多成分酶，单成分酶一般仅由蛋白质分子组成，多成分酶的组成除了蛋白质部分（称蛋白酶）外，还有非蛋白的部分。

双成分酶中只有两个部分都存在时，酶才具有催化活性，双成分酶又称为全酶。

2．酶的结构
蛋白质根据其空间结构的不同可分为蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构、四级结构，酶的分子结构也与蛋白质一样，具有四种结构。

3．酶的蛋白质性质
自然界中一切生物均含有蛋白质。

蛋白质是一类复杂的含氮的高分子化合物，它是由氨基酸构成。

蛋白质是极为重要的活性物质，它在生物体内的生物功能是多种多样的。

酶是一类大量普遍存在的具有催化功能的蛋白质，它几乎催化着机体一切化学反应，酶所具有的性质和蛋白质完全一样，它在水溶液中显示蛋白质的两性性质、胶体性质、显色反应、变性等所有性质。

(1)两性性质酶是两性介质，这是因为酶是蛋白质组成的，蛋白质的分子链两端含有自由的羧基和氨基，故既可酸性离解也可碱性离解，既是酸又是碱，当pH值达到某一值时，酸碱离解相等，这就达到了蛋白质的等电点，此时蛋白质易沉淀。

(2)胶体性质酶具有胶体性质，如存在着表面作用、吸附力等。

在酶颗粒表面分布着许多亲水基，这些亲水基吸附着许多水分子，在表面形成一层水膜，这些水膜在热量的作用下失水干燥，干燥后又能吸水膨胀和溶解，利用这种性质，常将酶干燥成粉末状后使用。

(3)显色反应组成酶的氨基酸所含的基团能和某些化学试剂作用，产生某
种颜色，所以具有显色反应。

(4)变性当受到加热、振荡、放射线或紫外线照射、超声波处理、产生泡沫、强酸、强碱、氧化剂、还原剂、表面活性剂、有机溶剂、胍、尿素、重金属盐等作用时，酶的分子结构发生变化，性质也随之改变，这种现象叫变性，变性可导致酶的溶解度下降和一些理化性质显著改变。

4．酶的活性中心
酶的活性中心是指酶蛋白分子中直接与底物结合，形成酶—底物复合物的特殊部位。

酶的活性部位可分为结合部位和催化部位，前者的作用是直接和底物结合，后者的作用是催化底物进行特定的化学反应。

5．酶的分类
现在已分离得到的酶有2000多种，酶的分类方法也很多，为了避免混乱，国际生化联合会规定将酶按所催化的类型，分为如下6大类。

（1）氧化还原酶类氧化还原酶是指催化氧化还原反应的酶类，如葡萄糖氧化酶等。

氧化还原酶催化反应的通式为：
（2）转移酶类转移酶类是催化一种化合物分子上的基团，转移到另一种化合物分子上，如谷丙转氨酶等。

催化反应通式为：
（3）水解酶类水解酶是催化大分子物质加水分解成小分子物质，其催化反应通式为：
这类酶大多属于细胞外酶，在生物体分布最广，数量也多，应用也最广泛，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、核糖核酸酶及纤维素酶等。

（4）裂解酶类裂解酶类催化一个化合物分解成几个化合物，反应是可逆的，如脱羧酶等。

其催化反应通式为：
（5）异构酶类此类酶催化同分异构化合物相互转化，如葡萄糖异构酶等。

其催化反应通式：
（6）连接酶类连接酶也称合成酶，系指能将两种物质合成一种物质，并必须与腺苷三磷酸（ATP)的分解相偶联的酶，这类酶关系着许多重要生命物质的合成，如蛋白质、核酸等；反应通式为：
6、酶在细胞内的分布
通常按酶的活动部位将酶分成胞外酶和胞内酶两大类。

胞外酶是指由细胞产生后分泌于细胞外面进行作用的酶，这种酶主要包括水解酶类；而胞内酶是由细胞产生并在细胞内部起作用的酶，这类酶的种类很多，如氧化还原酶、转移酶、裂
解酶、异构酶和合成酶等。

7、酶的性质与催化反应
酶是生物催化剂，它具有催化剂的共性，但他也具有不同于一般催化剂的如下特点：
（1）一般催化剂为小分子，而酶却为大分子，具有大分子的各种性质。

（2）酶本身是蛋白质，具有蛋白质的共性，在较高温度或过大过小酸碱度下容易变性失活，酶反应在温和条件下进行不需要高温、高压或强酸强碱的反应条件。

（3）酶对反应物及反应有专一性，一种酶只对一类或一种底物(受酶作用的物质)发生特定的催化作用。

（4）酶催化的反应所需活化能极低，故反应率较高，比一般催化剂高109--1013倍。

（5）酶反应可以受到各种因素(温度、pH、酶与底物浓度、抑制剂与激活剂等)的调节或控制。

二、工业酶制剂的生产
酶按其来源可分为动物酶、植物酶或微生物酶三类，而微生物是工业酶的主要来源。

1．微生物酶的培养
微生物酶的生产方法，通常是筛选合适的微生物后，采用固体或液体深层培养方法，用一定组成的培养基，在一定温度、pH、通气量下培养适当时间，待酶产量达高峰时，停止培养而用适当方法来提取酶。

固体培养是利用麸皮，或再添加适量米糠、豆粕、玉米粉及微量元素，加50％一60％水拌匀后，蒸热、冷却到30C左右，接种微生物菌种后，置浅盘(1～2cm厚)中，在相对湿度80％～90％下培养，或将接种后的培养基，在通风池中或制曲机中，通入一定湿度与温度的净化空气进行培养，此法生产效率较高，占地面积少。

深层培养法是工业酶制剂生产的主要手段，采用发酵罐培养。

培养是在一定的温度和强烈搅拌，并通入无菌空气下进行的，发酵罐的容积一般为10～20m3，也有大到50～200m’的，深层培养法设备占地面积少，生产效率高，但动力消耗大，技术管理要求严格，特别是防止染菌是生产成败的关键。

工业上生产酶的微生物主要是芽孢杆菌和真菌。

用于工业酶生产的微生物，
不仅要求菌种的遗传性稳定、酶的产量高，还必须考虑菌种的安全性，应当是非致病性的，不产生毒素和抗生素、激素等生理活性物质。

一个新菌种在用于工业生产前必须通过一系列毒性试验以证明其安全性后方可允许使用。

2．酶的提取
工业酶根据用途不同对酶纯度要求各异，有些酶不必提纯，含酶的材料直接可以作为酶来使用；有些胞内酶在制成无细胞酶制剂时，必须先将细胞破碎，以利酶的抽提，常用的破碎细胞的方法有机械法如研磨法、压力破碎法和超声波法等。

工业上大规模破碎细胞常用细胞擂碎器或高压匀浆泵处理。

3．酶制刑的制备
大多数的工业酶制剂是液体酶，是滤去菌体等固态物的发酵液或组织抽提液，采用薄膜蒸发、超滤等方法浓缩后添加稳定剂与防腐剂而成。

粉状干燥的酶制剂的制备主要采用溶剂沉淀法和盐析法。

溶剂沉淀法：先向酶液添加一定比例的与水可互溶的溶剂如丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇以及这些溶剂的混合物，在一定pH下，使酶蛋白沉淀而同酶液中大量杂蛋白及其他杂质相分离。

溶剂与酶液的质量比例，若是丙酮则为(0．5～1．5) ：l，若为乙醇则是(2．5～4．0) ：l，为节省溶剂，酶液宜先经超滤浓缩。

酶在溶剂水溶液中很不稳定，故操作时宜在0～10C下进行，时间愈短愈好，通常只有几分钟。

将沉淀的酶，在加有硅藻土为助滤剂下，用板框压滤机或用离心机进行固液分离。

工业上离心机可采用管式高速离心机，含溶剂的酶泥可在20～50‘C温度下真空干燥，然后磨粉，测活力，标准化和包装。

盐析法：向澄清浓缩的酶液，添加硫酸铵或硫酸钠至一定浓度，使杂蛋白和酶沉淀而析出。

为了制取高纯度之酶，可采用分级沉淀法，向酶液先添加硫酸铵至一定浓度，使大部分杂蛋白盐析沉淀除去后，继续加硫酸铵到所需浓度，使酶充分沉淀，这样的酶纯度较高。

制备纯度更高的酶，应采用其他手段，一切用于蛋白质提纯的手段都可以用在酶的提纯上，例如分级沉淀法、离子交换法、吸附法、凝胶过滤法、亲和色谱法等都是提纯酶的常用方法。

4．酶制剂的稳定化
酶制剂的稳定化是制备酶制剂的重要环节，酶制剂的配方中，根据情况应含有稳定剂、活化剂、防腐剂与缓冲剂等物质以利酶的长久贮存。

通常添加于酶制剂中的pH缓冲剂有磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸与无机。