木瓜蛋白酶配置
一种精制木瓜蛋白酶的制备方法[发明专利]
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[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公布说明书[11]公开号CN 101570748A [43]公开日2009年11月4日[21]申请号200810027842.0[22]申请日2008.05.04[21]申请号200810027842.0[71]申请人徐闻县美仑生物制品有限公司地址524132广东省湛江市徐闻县曲界镇仙安村[72]发明人龙晓鹏 林森 黄忠华 [74]专利代理机构广州市南锋专利事务所有限公司代理人潘献民[51]Int.CI.C12N 9/50 (2006.01)权利要求书 1 页 说明书 5 页[54]发明名称一种精制木瓜蛋白酶的制备方法[57]摘要本发明公开了一种精制木瓜蛋白酶的制备方法，它包括以下步骤：木瓜浆、预处理、碾磨、热交换、两级离心、微滤、超滤、真空冷冻干燥、粉碎调制、成品。
本提取方法的特点是：(1)通过预处理、热交换并保持提取过程在低温条件下进行，能有效减少长期高温等条件对酶活力降低的影响；(2)通过碾磨将木瓜酶充分溶解在料液中，利于提高酶提取回收率；(3)本方法提取的木瓜蛋白酶纯度高、活力高(最高活力达到300万u/g)、热稳定性好，外观、理化、微生物限度等指标均达到或超过国内外相关食品药品标准，通过调制可以生产不同规格的产品，可被广泛用于医药保健品、食品、美容化妆品、化工制革等行业和领域；(4)该方法工艺简单、生产成本低，产量高，可工业化生产。
200810027842.0权 利 要 求 书第1/1页 1、一种精制木瓜蛋白酶的制备方法，它包括以下步骤：木瓜浆→预处理→碾磨→热交换→两级离心→微滤→超滤→真空冷冻干燥→调制、粉碎、成品。
2、根据权利要求1所述的精制木瓜蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述的预处理步骤是：对采收的新鲜木瓜浆添加0.5％～1.0％的抗氧化剂，0.5％～1.0％的重金属螯合剂后，充分搅拌20～30分钟。
3、根据权利要求1所述的精制木瓜蛋白酶的制备方法，其特征在于：所述的碾磨步骤是：将预处理的木瓜浆倒入胶体磨中，充分磨碎，得到木瓜酶料液。
木瓜蛋白酶在肉类嫩化的应用
南宁东恒华道生物科技有限责任公司专注木瓜蛋白酶的生产与研究(23)，探讨了木瓜蛋白酶，复合磷酸盐和腌摘要：在传统工艺的基础上，通过正交试验L4制时间对腊牛肉嫩化效果的影响，结果表明：用0.02％木瓜蛋白酶、0.4％复合磷酸盐、经过72h腌制后，嫩化效果最佳。
木瓜蛋白酶是一种从未成熟的木瓜果实中提取的一种蛋白质分解酶，是一种天然的食品酶制剂。
由212个氨基酸残基组成单链蛋白质，分子量为23 406 D．在一定的酸性、中性、碱性范围内均具有活性。
木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白的酶，它之所以能对肉类进行嫩化，是因为它能将肉中的结缔组织及肌纤维中结构较复杂的胶原蛋白、弹性蛋白进行适当降解，使得它们结构中的一些连接键发生断裂，在一定程度上破坏了它的结构，从而大大提高了肉的嫩度。
同时可使肉的风味得到改善，并且安全、卫生、无毒，不产生任何不良风味。
木瓜蛋白酶对于胶原纤维蛋白在40～70℃温度范围内有最强的活力，由于脱水干燥时温度在50℃左右能较大程度地利用木瓜蛋白酶降低肉硬度的性质。
嫩化原理：嫩度是指肉在切割时，对破裂的抵抗力。
肉质的老韧主要由肉类中结缔组织的致密度大小、含水量的多少、弹性纤维的多少所决定。
材料和方法牛肉从市场上选购肉质新鲜黄牛肉，剔除筋腱、肥膘。
调味料碘盐、白糖、花椒粉、五香粉等。
食品添加剂硝酸钠、多聚磷酸钠、焦磷酸钠、磷酸二氢钠等均为食品级或分析纯。
木瓜蛋白酶活力为4O万活力单位/克。
设备及用具嫩度计、天平、台称、包装袋、容器、调温烘箱、锅、刀具等。
实验设计(23)进行正交试验，以木瓜蛋白酶、复合磷酸盐、腌制时间作为影响因素，探讨这3采用L4种因素对腊牛肉嫩度的影响。
配方设计采用三因素两水平的正交试验设计表。
工艺流程。
牛肉一清洗一整理一配料一腌制一烘烤一检验一成品工艺要点1、整理将牛肉洗净后，剃除筋腱、筋膜、肥膘，为了方便测定嫩度时取样，按直丝分割成0.5 kg 左右的肉块，尽量做到整齐、大小一致。
超滤法提取,PA修饰木瓜蛋白酶
番木瓜
木瓜蛋白酶理化特性
木瓜蛋白酶简称木瓜酶，是一种含巯基(SH)肽链内切酶，含11个Lys残基 溶于水和甘油，几乎不溶于乙醇、氯仿和 乙醚等有机溶剂 分子量为23400，最适合pH值6～7(一般 3～9.5皆可)，等电点pI为8.75，最适温度 55～65℃(一般10～85℃皆可) 由212个氨基酸残基组成。催化活性位点有 Cys-25、His-159、Asn-175
① 将20mL 5 mg/mL的木瓜蛋白酶溶液与 10ml 0.020 mol/ L的PA溶液混合，4 ℃下 磁力搅拌反应1 h ② 反应结束后，将上述溶液转入预先处理好 的透析袋中，4 ℃下在pH 7. 0、0. 025 mol/ L磷酸盐缓冲液中透析48 h，多次更 换透析液以除掉多余的修饰剂，得到木瓜 蛋白酶修饰酶
此可以采用pa来对木瓜蛋白酶进行化学修mgml的木瓜蛋白酶溶液与10ml0020moll的pa溶液混合4反应结束后将上述溶液转入预先处理好的透析袋中4下在ph025moll磷酸盐缓冲液中透析48h多次更换透析液以除掉多余的修饰剂得到木瓜蛋白酶修饰酶平均氨基修饰度测定氨基修饰率1氨基残留率enh2h2so4三硝基苯磺酸酶三硝基苯磺酸衍生物43亲和力酶修饰后的变化最适温度最适ph708520酶活力
酶的提取
1. 预处理：新鲜青番木瓜，取皮切碎，加 30%冰水捣碎，过滤掉不溶物，得滤液 2. 取滤液在4℃ 3500rpm 离心15min，得上 清 3. 加入酶活保护剂L-cys 0.04mol/L、EDTA 0.002mol/L，混合均匀 4. 用0.1mol/L HcL或0.1mol/L NaOH调pH至 7.0，静置 3h
平均氨基ห้องสมุดไป่ตู้饰度测定
木瓜蛋白酶生产工艺
木瓜蛋白酶生产工艺
木瓜蛋白酶是一种由木瓜果实中提取的天然酶制剂，具有广泛的应用领域，如食品加工、医药制造和纺织印染等。
下面介绍一下木瓜蛋白酶的生产工艺。
一、原料准备：
采用新鲜成熟的木瓜果实作为原料，果实应经过洗净、去皮和去籽等处理，然后切成小块备用。
二、榨汁提取：
将木瓜果块放入榨汁机中进行榨汁，获得木瓜浆。
榨汁过程中可以加入适量的酶源促进蛋白酶的产生。
三、发酵过程：
将木瓜浆通过过滤和杀菌等工艺处理，然后将其倒入发酵罐中。
可以加入适当的培养基和营养源来促进微生物的生长和蛋白酶的产生。
四、菌种培养：
将所选的产木瓜蛋白酶的微生物菌种接种到发酵罐中，并进行适当的培养条件控制，如温度、pH值和氧气供应等。
培养时
间一般为24-48小时。
五、酶的分离和提取：
将发酵罐中的培养液进行离心分离，分离出固体的微生物细胞。
然后通过酒精沉淀、低温冷冻、脱水和干燥等工艺，提取木瓜蛋白酶。
六、酶的精制：
通过离子交换层析、凝胶过滤和超滤等工艺，对提取的酶液进行精制，去除杂质和其他不需要的成分，提高酶的纯度。
七、包装和贮存：
将精制后的酶液进行包装，常见的包装形式有液体剂和固体剂。
然后对包装好的产品进行质量检验和贮存，保证酶的稳定性和活性。
通过上述生产工艺，可以得到高纯度、稳定性好的木瓜蛋白酶。
在生产过程中，需要严格控制各个环节的温度、pH值和微生
物的生长条件等，以保证酶的质量和产量。
此外，还需要进行严格的质量检验和贮存，确保产品的安全和有效性。
木瓜汁中提取木瓜蛋白酶--实验设计
木瓜汁中提取木瓜蛋白酶一、粗酶制备（冻存、调整浓度）1.蛋白质浓度（考xx蓝法）二、纯化和固定化1.双水相（PEG/磷酸盐）萃取，再过阳离子纯化；2.粗酶直接亲和磁珠纯化和固定化（咪唑梯度洗，电泳看效果）；3.先双水相，取PEG相（上清）用亲和磁珠纯化和固定化；三、纯度1.快速蛋白质液相色谱；2.非变性碱性蛋白质电泳；四、酶活性1.水解酪蛋白活性（固定化率和活力回收率、固定化酶的温度、pH等、重复使用）；2.水解IgG检测特异性；五、载体/相表征亲和磁珠：TEM、粒径、电势、磁滞回线、红外；双水相：一、xx木瓜制备粗酶[1,2]1.新鲜的木瓜用去离子水洗干净，再用不锈钢刀在果实上做了4到6个纵向2-3mm深的切口，让分泌出的乳胶顺着果实向下滴入冰浴的烧杯中。
-20 ℃存放。
（或者10mL汁液加90mL pH 6.0的PBS，搅拌15min，4℃9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定并调整上清中的蛋白质的浓度。
）2.将解冻后的乳胶与40mM半胱氨酸按3:1(w/v)的比例混合，用6MHCl将悬浮液调整为pH 5.6，在4 ℃搅拌15 min，过滤并用6 M NaOH将滤液pH调整为9.0，4 ℃ 9000×g离心取上清（除去不溶物），最后测定上清中的蛋白质含量，然后用水/PBS调节。
可省略。
3.[1]NitsawangS,Hatti-KaulR,KanasawudP.PurificationofpapainfromCaricapapayalatex:Aqueoustwo-phaseextractionversustwo-stepsaltprecipitation[J].Enzyme & Microbial Technology, 2006, 39(5):1103-1107.[2] Rocha M V, Giacomo M D, Beltramino S, et al. A sustainable affinity partitioningprocess to recover papain from Carica papaya, latex using alginate as macro-ligand[J].Separation & Purification Technology, 2016, 168:168-176.。
木瓜蛋白酶活力测定方法
木瓜蛋白酶活力测定方法分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。
精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。
照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算：效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度：As为酪氨酸对照品溶液的吸收度：Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度，ug/mlW为供试品重量，mg;在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。
试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。
酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。
酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。
木瓜蛋白酶
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英文：PapainCAS:90001-73-4酶活力：60万U/g。
本品为乳白色至微黄色粉末，具有木瓜特有的气味,稍具有吸湿性。
水解蛋白质能力强,但几乎不能分解蛋白胨，易溶于水,甘油,不溶于一般的有机溶剂,耐热性强。
可利用酶促反应，使食品大分子的蛋白质水解成小分子肽或氨基酸。
用于水解动植物蛋白、制成嫩肉粉、水解羊胎素、水解大豆、饼干松化剂、面条稳定剂、啤酒饮料澄清剂、高级口服液、保健食品、酱油酿造及酒类发酵剂等。
有效转化蛋白质的利用，大大提高食品营养价值，降低成本。
有利于人体的消化和吸收。
1、食品工业：利用木瓜蛋白酶的酶促反应，可把食品中大分子的蛋白质水解成易于吸收的小分子肽或氨基酸，广泛适用于如：鸡、猪、牛、海产品、血制品、大豆、花生等动植物蛋白酶解、肉类嫩化剂、酒类澄清剂、饼干松化剂、面条稳定剂、保健食品、酱油酿造及酒类发酵剂等，即可提高食品的营养价值，又可降低成本。
2、饼干行业：降低面团湿筋度、改良面团可塑性及理化性质，同时使蛋白质大分子水解成短肽和氨基酸，从而有利于糖类和氨基类物质进行复杂的美拉德反应，使产品上色快，色泽悦目有油润光鲜感，疏松酥脆容比力大，断面网状结构明显，层次好；裂饼、碎饼率降低，饼形端正饱满不缩身，花纹清晰，饼面光滑；并且可以相应减少10％-25％的焦亚硫酸钠，从而减少SO2等有害物质的残留量，还可以矫正化学添加剂对饼干风味的影响，有效提高饼干产品的质量。
3、医药工业：含木瓜蛋白酶的药物，如木瓜润喉片、木瓜肠溶片（胶囊）、木瓜含片，具有消炎、利胆、止痛、助消化、提高免疫力等功效，进一步研究表明亦可用于检查红细胞表面及血型鉴别剂、治疗妇科病、青光眼、昆虫的叮咬等。
探索木瓜蛋白酶最适反应条件、固定化和制备结晶
摸索，对于酶工程实验的开设和指导生产实践具有良好 ４、６、７、 ８ 和 １０。
的借鉴意义。
１．２．５ 木瓜蛋白酶的固定化
1. 实验材料与方法
木瓜蛋白酶液与海藻酸钠溶液先混匀；加入明胶溶
１．１ 材料：番木瓜
液再混均；用 ６ 号注射器针头以 １５ ｃｍ 高度均匀向下注
１．２ 方法
入到氯化钙溶液中，立刻形成光滑的微球；冰箱放置 ３０
１．２．１ 提 取 未 成 熟 新 鲜 青 番 木 瓜， 去 皮 切 ｍｉｎ；抽滤滤出微球，置入戊二醛中硬化 １－２４ ｈ；待微球
碎，加磷酸缓冲液，过滤，取滤液离心 １５ ｍｉｎ（３５００ｒ／ 达到一定硬度后，用生理盐水洗涤，制备成固定化酶。
ｍｉｎ，４℃），取上清液弃沉淀，加入 ４５％ 乙醇，４℃静置过夜，
制作标准曲线。具体操作如下：酶反应体系 ３ ｍＬ，０．２ Ｍ ｍｉｎ 加完。由于丙酮和硫酸铵的协同作用，静置 １５ ～ ３０
不同 ｐＨ 的磷酸缓冲液（含 Ｌ－Ｃｙｓ 和 ＥＤＴＡ）１ ｍＬ，１％ ｍｉｎ 后溶液分相，上相约占总体积的 １／３，为丙酮和木瓜
酪蛋白 １．５ ｍＬ，木瓜蛋白酶 ５００ ｕＬ。以磷酸缓冲液代替 蛋白酶的混合物；下相几乎无活性，可直接弃去；
木瓜蛋白酶液作为参比对照。反应时间 １０ｍｉｎ，加入 ３．０
结晶。将上相离心，取相界面处沉淀，即为浓缩木
ｍｌ ０．８Ｍ ＴＣＡ（三氯乙酸）终止反应，震荡混匀后，室温 瓜蛋白酶。将沉淀抽真空除去丙酮后，在显微镜下观察
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农业科技
并照相。该方法参考。
应温度范围非常广，在 ４０℃ －８０℃之间都能有比较高的
１．２．６ 木瓜蛋白酶的结晶
离心 ２０ ｍｉｎ（５５００ ｒ／ｍｉｎ），取沉淀，紫外吸收法测定酶
木瓜蛋白酶提取实验方案课件资料
实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取,纯化分离及其生物学研究一、实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。
是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。
工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。
现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。
木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。
它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。
有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法。
有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。
使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。
高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。
硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
木瓜蛋白酶酶活力测定
木瓜蛋白酶酶活力测定1、原理蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀出去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸收度计算酶活力。
2、酶活力定义在一定条件下，每分钟水解酪蛋白生成1ug酪氨酸所需的酶的量，为1个酶活力单位（U）。
3、仪器和设备恒温水浴（37±0.2）℃紫外分光光度计4、试剂和溶液4.1、酶稀释液称取L-半胱氨酸盐酸盐（C3H7NO2S·HC L·H2O）5.27g，氯化钠（NaCL）23.4g，加水500ml溶解，另取乙二胺四乙酸二钠2.23g加水200ml溶解，合并两液混匀，用0.1mol/l 氢氧化钠溶液或0.1mol/l盐酸溶液调至pH=5.5，加水稀释至1000ml。
4．2、0.05mol/l磷酸氢二钠溶液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）17.89g，加水溶解，并定容至1000ml。
4.3、酪蛋白溶液称取经硅胶干燥器忠干燥至衡重的酪蛋白0.6g（精确到0.0002g），置烧杯中，假如0.05mol/l磷酸氢二钠溶液80ml。
在沸水浴忠边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，用0.1mol/l盐酸调至pH=7.0,转移到100ml容量瓶中，加水至刻度。
临用现配。
4.4、三氯乙酸溶液称取三氯乙酸8.995g，加无水乙酸钠14.97g，冰乙酸9.45ml加适量水溶解后，加水使成500ml，振摇均匀。
4.5、酪氨酸标准溶液称取于105℃干燥至衡重的酪氨酸50mg（精确0.0002g）用0.1mol/l盐酸溶解，移入100ml容量瓶中，并用0.1mol／l盐酸调至刻度，摇匀，即可得含酪氨酸50ug／ml的溶液。
4.6、试样溶液称取木瓜蛋白酶0.9g（精确0.0002g）置于研钵中，加入少量酶稀释液研磨20min，用酶稀释液移至250ml容量瓶中，加酶稀释液至刻度，充分摇匀；取出上述液体1ml以酶稀释液稀释，定容20ml，充分摇匀，供测试用（60min内使用）。
木瓜蛋白酶酶切IgG的标准操作规程
木瓜蛋白酶酶切IgG的标准操作规程（编号：070）1、目的及适用范围通过木瓜蛋白酶酶切从IgG中得到Fab片断。
2、主要仪器AKTA FPLC、HiTrap Protein G、Hitrap Protein A、冷冻离心机3、试剂及配置方法3.1抗体结合Buffer：20 mM sodium phosphate, pH 7.03.2抗体洗脱Buffer：0.1 M glycine-HCl, pH 2.73.3 Papain Agrose（Sigma）：40U/mL3.4 papain酶切Buffer：50mM Tris + 150mM NaCl + 1mM EDTA + 1mM DTT，pH 7.04、相关的预处理在酶切前将Papain Agrose换液至Papain酶切Buffer，加入10mM Cysteine，37℃激活30min。
5、操作步骤5.1 Protein G从腹水或血清中纯化IgG。
5.1.1样品处理：将腹水或血清4℃，12000rpm离心10min，取上清，稀释于4-5倍体积的Binding Buffer中，并用0.45μm的滤膜过率滤。
5.1.2 安装Protein G柱，设置压限0.3MPa。
5.1.3 用水冲洗整个系统。
5.1.4 用Binding Buffer洗泵，并用10倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子5.1.5 上样，流速0.5-1mL/min5.1.6 用Binding Buffer冲洗柱子直到紫外吸收线走平为止5.1.7 用2-5柱体积的Elution Buffer洗脱抗体。
5.1.8 1mL/管收集蛋白，每个收集管加入pH9.0的1 M Tris-HCl 60–200 μL（预实验算好加的体积）。
5.1.9 SDS-PAGE检测纯化结果。
5.2 将纯化的IgG换液至Papain酶切Buffer。
5.3 加入预处理好的Papain Agrose，37℃酶切4h。
木瓜蛋白酶的提取
木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法13生物技术第二大组第二小组组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景：在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。
二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。
木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。
木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。
至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。
它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。
木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。
木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。
木瓜蛋白酶的应用简介
木瓜蛋白酶的应用简介木瓜蛋白酶在食品加工中的应用1木瓜蛋白酶概述木瓜酶是一种运用很广泛的植物蛋白酶，纯天然，安全无毒素，在食品加工业中应用广泛，属于食品添加剂，已在啤酒酿造和肉类嫩化等行业被普遍应用。
利用木瓜酶的酶促反应，可把食品中的大分子的营养物质（如蛋白质、脂肪、麦芽糖、纤维素等）水解成小分子的氨基酸或多肽等，有助消化，易于人体吸收，十分适合体弱或消化系统疾病患者的营养需要，更利于老人、儿童、病人的消化吸收；木瓜酶能有效转化肉质汤料，用于生产高级方便食品。
可制成肉类嫩化剂、酒类澄清剂、饼干松化剂、高级口服液、保健食品、营养食品等。
由于酶促反应的专一特性，使得应用木瓜酶制剂的食品加工过程中副产品极少，更便于产品的提纯和简化工艺步骤；木瓜酶反应条件温和、催化效率高、安全性高、能有效降低食品生产成本，提高食品质量，增加收入。
2木瓜蛋白酶的组成和结构未成熟番木瓜果实中含有木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶a、木瓜凝乳蛋白酶b、木瓜肽酶b等多种蛋白水解酶。
且已知4种半胱氨酸蛋白酶的一级结构具有高度的同源性。
其中木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解在肽键的n端具有2个羧基的氨基酸或芳香l氨基酸的肽键。
木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为27000u，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。
至少有3个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，它们分别是cys25、his159和asp158，另外6个半胱氨酸残基形成了三对二硫桥，且都不在活性部位。
3木瓜蛋白酶的制备和保存木瓜蛋白酶的制备是将未成熟番木瓜果实割取乳液去杂，在室温下加入半胱氨酸溶液在研钵中充分磨匀，静置后取上清液即为粗制酶，其水溶液呈混浊状，然后在通过离心去杂的上清液中加入硫酸铵分级分离得沉淀，加入半胱氨酸溶液后经盐析重结晶干燥得精制酶。
木瓜蛋白酶室温贮存活力稳定性与活力高低呈反比，正常使用时造成活力下降的主要因素为干燥失重、温度和空气氧化。
木瓜蛋白酶
木瓜蛋白酶活性测定方法及特点
1.以酪蛋白为底物的紫外分光光度法 （操作简 便,成本低,适于酶纯化过程中的活性比较、系 列产品的酶活性测定） 2.茚三酮显色法（操作烦琐,但所需仪器简单, 在条件简陋的地区也可以用） 3. BAEE(苯甲酰-L-精氨酸-乙酯)法（反应稳 定、重复性好,适于酶学性质的理论研究和试剂 酶的活性测定。 ）
木瓜蛋白酶
木瓜蛋白酶的基本信息
木瓜蛋白酶（papain）简称木瓜酶，又 称为木瓜酵素，别名番木瓜酶,木瓜朊酶, 番瓜酵素，是一类琉基蛋白酶，广泛地 存在于番木瓜(Carie a p a p a y a)的根、 茎、叶和果实内其中在未成熟的乳汁中。 它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生 安全等特点 。
木瓜蛋白酶的固定化研究代生物技术的重要手段,利 用不同载体制备固定化木瓜蛋白酶,可以 大大节约用酶,并能反复利用。 我国在这一领域主要有两个方面 1.纤维素固定化木瓜蛋白酶的研究 2.琼脂固定化木瓜蛋白酶的研究
木瓜蛋白酶的应用
1.在食品行业中的应用：肉类嫩化，啤 酒澄抗寒……
木瓜蛋白酶的应用
2.在医药行业中的应用：治疗水肿、炎症、驱 虫、已经清除创面，加速伤口愈合…… 3.在纺织行业中的应用：可用于处理羊毛、蚕 蛹脱胶、蚕丝精炼，能达到手感柔软、舒适、 抗收缩、抗张强度等效果。 4.在皮革行业中的应用：利用木瓜蛋白酶制成 脱毛剂，鞣制皮革，具有毛孔细腻，皮纹光亮 效果。
取新鲜乳汁→搅拌使其液化并过滤→加入等量 含0.2 mmol/ EDTA, 1 mmol/ NaCl 和 0.04mol/ Cys的溶液,并混均→加入已溶解的 丹宁溶液至浓度达到0.1%,静置→用盐酸调pH 至3.4 → 离心→沉淀→真空干燥→粉碎后即得 粗酶。（用该法制备木瓜蛋白酶设备简单,投 资少, 而且酶稳定性好,适合用于食品及制革等对酶 纯度要求不高的工业。） 实验室用酶需进一步纯化
木瓜蛋白酶提取实验记录
木瓜蛋白酶实验记录2016.11.3实验前准备：所需试剂的配制：饱和硫酸铵：取150ml蒸馏水，放入冰桶中，不断加入硫酸铵固体，直至沉淀不能溶解，过滤取滤液，保存在4℃冰箱中。
酶保护剂：准确称量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸馏水中，调节PH 至9.0，溶解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA，定容至250ml，转入棕色瓶中。
预实验：确定实验的可行性酶液提取：①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。
②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。
③收集5ml乳汁加入95ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。
④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。
⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液。
⑥分装木瓜蛋白酶原液，加入2ml酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。
对静置的酶液继续处理2016．11.4试剂配制考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于50mL 95%乙醇中（95%乙醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸馏水）再加入86% 磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸馏水定容至1000mL。
静置1h后，取棕色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。
重提木瓜蛋白酶实验设置对照一组开始即加入酶保护剂编号酶B*、一组加硫酸铵之前才加酶保编号酶*。
①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。
②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。
③收集10ml乳汁加入190ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。
④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。
使木瓜蛋白酶的方法
使木瓜蛋白酶的方法
木瓜蛋白酶存在于木瓜的乳胶中，是一种天然的蛋白酶。
以下是一些常见的使木瓜蛋白酶的方法：
1. 传统提取法：将木瓜果实切开，收集乳胶，然后通过沉淀、过滤、离心等步骤提取木瓜蛋白酶。
这种方法简单易行，但提取效率较低。
2. 发酵法：将木瓜乳胶与微生物一起培养，利用微生物产生的酶来分解乳胶中的蛋白质，从而提取木瓜蛋白酶。
这种方法提取效率较高，但需要一定的发酵设备和技术。
3. 化学法：利用化学试剂处理木瓜乳胶，使其中的蛋白质变性，从而提取木瓜蛋白酶。
这种方法提取效率高，但可能会对酶的活性产生一定的影响。
4. 基因工程法：利用基因工程技术，将木瓜蛋白酶基因导入到其他生物体中，使其表达和分泌木瓜蛋白酶。
这种方法可以大规模生产木瓜蛋白酶，但需要一定的基因工程技术和设备。
需要注意的是，木瓜蛋白酶是一种蛋白酶，具有一定的生物活性和催化作用。
在使用木瓜蛋白酶时，需要根据具体的应用场景和需求选择合适的提取方法和使用条件，以确保其活性和效果。
同时，需要注意木瓜蛋白酶的安全性和稳定性，避免对人体和环境造成危害。
木瓜蛋白酶的正确使用方法
木瓜蛋白酶的正确使用方法木瓜蛋白酶是一种天然的酶类蛋白质，在食品加工和医药领域有着广泛的应用。
它具有分解蛋白质的作用，能够帮助人体更好地消化食物，促进新陈代谢，增强免疫力。
然而，要充分发挥木瓜蛋白酶的作用，正确的使用方法至关重要。
本文将介绍木瓜蛋白酶的正确使用方法，希望能够帮助大家更好地使用这一天然酶类蛋白质。
首先，正确的存储木瓜蛋白酶非常重要。
木瓜蛋白酶应该存放在阴凉干燥的地方，远离阳光直射和高温环境。
避免暴露在空气中，以免受潮结块。
另外，木瓜蛋白酶应该远离有害气体和异味，以免受到污染影响品质。
其次，正确的使用木瓜蛋白酶需要注意其适用温度和pH值。
一般来说，木瓜蛋白酶的最适工作温度为50-60摄氏度，pH值为6-8。
在使用过程中，要根据具体情况控制好温度和pH值，以确保木瓜蛋白酶的活性和稳定性。
另外，正确的使用木瓜蛋白酶需要根据具体的应用领域和需求进行配比和添加。
在食品加工中，可以根据食品的种类和加工工艺确定木瓜蛋白酶的添加量和添加时间；在医药领域，需要根据药物的性质和用途确定木瓜蛋白酶的使用方法和剂量。
此外，正确的使用木瓜蛋白酶还需要注意其作用时间和作用条件。
木瓜蛋白酶的作用时间一般为30分钟至数小时不等，具体取决于温度、pH值和添加量等因素。
在使用过程中，要根据具体情况确定作用时间和作用条件，以达到最佳的效果。
最后，正确的使用木瓜蛋白酶需要注意其安全性和卫生问题。
在使用过程中，要严格遵守相关的操作规程和安全规定，做好个人防护，避免接触皮肤和呼吸道。
同时，要保持操作场所的清洁和卫生，避免污染和交叉感染。
总之，木瓜蛋白酶作为一种天然的酶类蛋白质，在食品加工和医药领域有着广泛的应用前景。
正确的使用方法可以帮助我们充分发挥其作用，提高生产效率，改善产品质量，受益医药健康。
希望本文介绍的木瓜蛋白酶的正确使用方法能够对大家有所帮助，更好地应用这一天然酶类蛋白质。
木瓜蛋白酶最适PH值和温度
木瓜蛋白酶最适PH值和温度木瓜蛋白酶vpapainw是由种植的番木瓜未成熟果实中割取乳液经采用生物技术提取、微滤、超滤、冷冻干燥提练而得的纯天然、健康、安全、高效的生物酶制剂。
本品是蛋白酶混合物，含木瓜蛋白酶、木瓜凝乳酶、木瓜肽酶。
有很强的蛋白水解催化活性及凝乳、溶菌活性，还具备脂解能力及蛋白合成能力，主要是催化蛋白质水解，切割分解点很多，优先分解精氨酸，苯丙氨酸的肽i。
木瓜蛋白酶是由212个氨基酸组成，分子量为21000，属于含疏基v―shw肽链内切酶，由于木瓜蛋白酶具有酶活高，热稳定性好，可广泛应用于食品、医药、日化、饲料、皮革及纺织等行业。
一、酶解原理在一定温度，ph值及底物浓度下，木瓜蛋白酶能水解蛋白质分解成蛋白胨，多肽及氨基酸等物质。
二、活力定义紫外光分后光度法：在测量条件（37±0.2℃；ph值7.0）每分钟水解酪蛋白放出的三氯乙酸氢氧化物物在275nm波长存有喷光度与1微克酪氨酸的喷光度相当时，所需的酶量即为一个活力单位，用u/g则表示。
三．木瓜酶最适ph值木瓜蛋白酶的拉沙泰格赖厄县ph值：每个酶都存有拉沙泰格赖厄县ph，在此ph之下催化反应的速率就是它的最高值。
木瓜蛋白酶可以展开催化反应的ph促进作用范围就是3.5~9，拉沙泰格赖厄县ph范围就是5~7。
四、木瓜酶最适温度木瓜蛋白酶的最适温度：木瓜蛋白酶最佳温度是50~60℃，最佳的温度必然受作用时间的影响，较短的作用时间必须有较高的最适温度，较长的作用时间必须有较低的最适作用温度，这是木瓜蛋白酶与其他酶类的共同特点。
木瓜蛋白酶的有效率促进作用温度范围就是20~80℃。
这个温度范围既适宜木瓜乳汁生产细酶的温度，也适宜木瓜蛋白酶在一定条件下的活性反应促进作用。
少于80℃时，木瓜蛋白酶活性可以上升，当温度升至90℃时木瓜蛋白酶可以熔融。