高通量测序技术在无创产前检测中的应用

高通量测序技术在无创产前检测中的应用

摘要：随着以高通量、自动化为显著特征的二代测序技术的发展，基于该技术的无创产前检测(NIPT)在临床上迅速得以应用。国际上发表了一系列与NIPT相关的指导意见，我国卫计委也于今年发布了技术规范。文章将对NIPT技术规范进行解读，并对高通量测序技术在NIPT应用中的优势、局限性和临床应用要点进行评价。

染色体非整倍体是胎儿出生缺陷最常见病因之一，其中以21-三体综合征、18-三体综合征最为常见，占所有足月妊娠的0.2%~0.3%。对先天性遗传病进行产前筛查和产前诊断是优生优育的重要保证。自1970年以来，针对上述胎儿染色体疾病的产前筛查和产前诊断已逐渐应用到临床上，并在降低出生缺陷方面得到了良好的效果。

从取材方法进行分类，产前检查分为有创性和无创性两种。有创性产前诊断是目前诊断胎儿染色体疾病的的金标准，主要是指通过绒毛活检术、羊水穿刺术和脐静脉穿刺术采集胎儿细胞或组织，进行细胞核型分析获取胎儿染色体信息，有创检测的准确率为98%~99%，但伴有0.5%~1.0%的流产风险，同时也会伴有羊水渗漏、宫内感染等风险。因此，有创产前诊断目前仅应用于筛查高风险、高龄妊娠或家庭中生育过遗传病患儿等情况。传统的无创性产前检查主要有超声检查和孕妇血清学检测等方法，使用这些方法进行检测可避免对胎儿和孕妇造成的危害，但是其灵敏度及特异性有限。近20年来，基于超声检查和孕妇各种蛋白或激素的血清学筛查相结合的产前筛查发展迅速。产前母体血清学筛查的目标疾病是21、18-三体综合征和神

经管缺陷，当假阳性率控制在5%时，在早孕期、中孕期、早中孕期的检出率分别为82%~87%、81%、94%~96%[1]，这些方法的假阳性率较高，为后续有创性产前诊断带来较大的临床压力与实验室压力。

常规产前筛查和有创性产前诊断方法的局限性促使研究者积极开发一种针对胎儿染色体非整倍体及其他染色体异常的、无创伤性的高精度检测方法。1997年Lo等[2]通过孕育男性胎儿的孕妇外周血血浆Y染色体PCR扩增的方法证明了孕妇外周血循环中存在胎儿游离DNA(cell free fetal DNA，cffDNA)，开启了基于cffDNA无创产前检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)方法。其后，利用各种分子诊断技术对cffDNA的检测已经在胎儿性别鉴定、Rh血型鉴定、X连锁隐性遗传病、先天性多囊肾检测等方面得到应用，但由于方法繁琐、耗费时间长、精度低、费用较高等问题，一直难以推广于临床。

近年来，随着以高通量、自动化为显著特征的二代测序技术的发展，基于该技术的NIPT在临床上迅速得以应用。今年，国家卫生计生委妇幼司发布了第一批高通量测序技术临床应用试点单位，同时发布了《高通量基因测序产前筛查与诊断技术规范(试行)》。如何充分理解并合理规范应用NIPT，如何正确解读技术规范，将NIPT作为常规产前筛查方法时有哪些注意事项，我国产前筛查和产前诊断体系中NIPT该如何正确定位等，本文将对这些问题进行深入探讨。

一、母血中胎儿游离DNA的特性

大量研究发现，cffDNA来源于凋亡的胎儿滋养层细胞，经过胎盘屏障时受母体免疫攻击破裂或胎盘细胞凋亡进入母血，自然降解成DNA片段。绝大部分的cffDNA都是包裹在核小体外部，与胎儿游离RNA(cell free fetal RNA，cffRNA)相比，其在外周血浆中的性质更加稳定。早期研究认为，cffDNA在早、晚孕期分别占孕妇外周血总DNA的3%、6%，不同孕妇间个体差异性较大，其中80%的片段长度<193bp，最早可从孕4周时检出，且在7周时稳定存在，随孕周延长而增加[3]。最近研究发现，cffDNA在早、中、晚孕期时含量分别为9.7%、9.0%、20%，分娩后母体cffDNA快速降解，2h 内快速消失，半衰期为16.3min，再次妊娠cffDNA的检测不受上次妊娠影响[4]。

孕妇外周血中cffDNA微量存在、非整倍体检测过度依赖于特定基因位点等特点，严重限制了使用常规分子生物学方法检测胎儿染色体非整倍体的技术可靠性和使用范围，迫切需要一种快速、高精度、可自动化的方法。新一代高通量测序方法的出现，可轻易实现同时针对百万以上单分子多拷贝PCR克隆阵列的检测，该方法对游离DNA 的研究已经成功应用到无创产前检测、癌症和器官移植标志物研究等方面。

二、基于高通量测序技术的NIPT

2008年Lo和Quake两个小组开创性地使用第二代高通量测序技术，对孕妇外周血浆进行测序，成功检测出21-三体综合征(trisomy 21,T21)胎儿[5-6]，后续研究表明该方法的敏感性仅受限于测序序列

的数据量，其分析的原理是胎儿为T21时，胎儿的21号染色体2个拷贝数变成了3个拷贝数，从孕妇外周血游离DNA中检出的21号染色体来源的序列(包括T21胎儿和正常孕妇)占整个基因组的比例较胎儿为21号染色体2个拷贝数时升高。

大量的科研小组对该方法的临床应用进行了验证，并使得该方法逐渐成为新的无创检测染色体非整倍体的方法。Chiu等[7]研究753例筛查高风险孕妇，其中86例T21胎儿，结果表明，该方法针对T21胎儿有100%的检测灵敏度和97.9%的特异度，紧接着Ehrich 和Sehnert两个小组通过类似的方法证明了该方法的高灵敏度和特异度[8]。Bianchi等[9]对532个样本进行了分析，与其他研究不同的是，此研究对包括易位型三体、嵌合体及复杂变异在内的胎儿非整倍体进行检测，发现13、18、21、X、Y五大染色体非整倍体的检测灵敏度为78.6%~100%，特异度为99.8%~100%，并发现某个染色体为非整倍体时并不影响其他染色体整倍体状态的分析。

针对18-三体综合征(trisomy 18，T18)和13-三体综合征(trisomy 13，T13)的检测，Chen等[10]研究小组使用改进后的算法分析发现T13、T18的灵敏度提高到98.9%和91.9%[10]。Palomaki 等[11]后续研究亦使用类似方法，对T18和T13的检出率分别为100.0%和91.7%，假阳性率分别为0.28%和0.97%；对283个染色体非整倍体异常样本复合检出率为98.9%，总的假阳性率仅0.5%。

近期，北京协和医院完成的一项以低危为主的孕妇人群进行游离胎儿DNA检测的研究，有效样本1741例，准确检出其中的15例