实验报告血红蛋白

实验报告血红蛋白

篇一：生化实验报告实验5 血红蛋白凝胶过滤

实验报告

课程名称：生化实验B实验日期：

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血红蛋白凝胶过滤

一、背景及目的

血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。人体内的血红蛋白由两个α亚基和两个β亚基组成。每个亚基均成球状，内部有一个血红素。血红素上的亚铁离子可以可逆的与氧分子结合，起到运输氧气的作用。当携带氧气时，血红蛋白呈鲜红色，无氧时为暗红色。

凝胶过滤法又称凝胶排阻层析或分子筛层析，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离

成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。

影响分离效果的因素主要有以下几点：1.基质的(本文来自：小草范文网:实验报告血红蛋白)颗粒大小、均匀度

2.筛孔直径和床体积的大小

3.洗脱液的流速

4.样品的种类等，

5.缓冲液的pH

6.而最直接的影响是 Kav 值的差异性， Kav 值差异性大，分离效果好； Kav 值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。

影响凝胶过滤的因素主要有：

1、层析柱的选择：长的层析柱分辨率要比短的高，但层析柱长度不能过长。

2、加样量：加样过多，会造成洗脱峰的重叠；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低。

3、凝胶柱的鉴定：凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。

4、洗脱速度：洗脱速度应保持适中。

目前凝胶过滤技术的应用主要是以下几点：

1、脱盐

2、用于分离提纯

3、测定高分子物质的分子量

4、高分子溶液的浓缩

5、蛋白质的复性

二、实验原理

层析法是基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。按操作形式可以划分为：柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。按流动相与固定相的不同划分：气相层析、液相层析。按层析的机理可以划分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。2

凝胶过滤是一种按分子量大小分离物质的层析方法。该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱，大分子不能进入凝胶颗粒的静止相中，只能在凝胶颗粒间随流动相移动，因而可以被较快洗出，而小分子则能够自由进出凝胶颗粒，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此需要花费较长时间流经柱床，从而使不同大小的分子得到分离。

本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即被还原为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移，

与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。这样，就可以形1

21 百度百科凝胶过滤层析 /81744.htm 百度百科层析 /15375.htm#2

象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。

本实验操作简便，直观性强，趣味性浓，通过肉眼就可以检验分离效果。

三、仪器与试剂、实验材料

1、仪器

⑴层析柱⑵恒流泵（HL-2恒流泵，上海沪西分析仪器厂）⑶胶头滴管

⑷ 50ml烧杯 3个⑸玻璃棒

2、试剂

⑴磷酸缓冲液（老师已配好）

⑵还原层试剂（1:1的40nM FeSO4和80 mMNa2H2EDTA,0.2MNaHPO4, ,老师提供）

⑶ Sephadex G-25

3、实验材料

血红蛋白样品（1ml抗凝血加10ml pH7的20mM磷酸缓冲液，再加入固体铁氰化钾，浓度达5mg/ml，老师提供）

四、实验步骤

1、凝胶溶胀：老师已准备好

2 、检验：旋上层析柱下端柱帽，加少量去离子水，看水是否顺利流出，如果流速过缓，用洗耳球自上端吹气，使其畅通。上下端倒置，按上述步骤检验。

3、装柱及平衡：取下上端柱帽，装入5cm左右的洗脱液，溶胀好的凝胶边搅拌边倒入柱中，同时开始洗脱，使柱中的凝胶一直处在溶液中，装柱长15cm左右。溶液液面应该高于凝胶面3-5cm，防止凝胶因脱水而毁柱。实验中沉降完成后，液面高于凝胶面4cm左右。此时观察柱面，上下均一，无界面，裂隙。旋上上端柱帽，细管管接上磷酸盐缓冲液，下端柱帽的细管接恒流泵，开始平衡洗脱。过程中调节好流速，6滴/分。平衡过程20分钟。

4、上样：事先剪好略小于层析柱内径的滤纸片，打开上柱帽，将滤纸片放入层析柱中，使其自然飘落覆盖在凝胶面上，防止上样时液滴对床面的冲击。确定流速后准备上样。利用恒流泵排气键加速洗脱，直至洗脱液面与胶床液面相切，停止洗脱。用滴管加0.7ml还原试剂，小心注入胶床液面中央。开始洗脱，待液面与凝胶床面相齐时，关泵。上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面相齐。关泵。上0.7ml血红蛋白样，开泵，至液面与胶面相齐，关泵。上1ml磷酸缓冲

液,开启泵,至液面与胶面相齐。关泵。上5ml的磷酸缓冲液。接上上端柱帽与磷酸缓冲液，连续洗脱，观察现象，并用烧杯分别收集血红蛋白样品与铁氰化钾。

5、待黄色液体全部流出，开排气键，加速洗脱10分钟

五、结果

1、实验现象

还原层上样时，溶液呈黄色，当还原液面与凝胶床面相切时，床面以下两厘米左右呈现黄色。

加上褐色的血红蛋白样品时，开启泵。此时褐色下渗，在未加入缓冲液之前，褐色带下端已经开始变为暗红色。层析柱上的色带由上至下依次为黄色，褐色，暗红色。

当上5ml缓冲液并开始洗脱时候，褐色全部变为暗红色，红色带下端颜色变浅。此时即为两个色带，上端黄色下端暗红。

开始洗脱七分钟时，暗红带下端开始变鲜红色，随时间推移，暗红带全部转变为鲜红色。

过程中，红色带在下，黄色带在上。两色带一直下移。色带边界不是很清晰，而且与其他组的同学相比，鲜红色较浅。

随色带的下移，两色带间距变大。