常见层析法
免疫层析法检测原理分类介绍
免疫层析法检测原理分类介绍免疫层析法是一种常用的免疫学测定手段，通过血清免疫反应和生物化学技术的结合，可以快速、敏感地检测特定物质的存在与水平。
免疫层析法根据不同的检测原理可以分为多种类型，下面将对常见的几种免疫层析法原理进行分类介绍。
1.竞争型免疫层析法竞争型免疫层析法是一种常用的免疫层析法，其原理基于抗体对抗原的结合竞争关系。
在竞争型免疫层析法中，通常将抗原标记在固定相上，待测样品中的特定抗原与固定相上标记的抗原竞争结合抗体。
这样，样品中的抗原与标记物竞争结合抗体，通过可视化或者仪器测定标记物的存在与水平来判断样品中的目标物质。
2.夹心型免疫层析法夹心型免疫层析法是一种常用的免疫层析法，其原理基于抗原与抗体的特异结合。
在夹心型免疫层析法中，通常将特定抗原固定在固定相上，待测样品与标记的抗体在该抗原上竞争结合。
样品中的抗原与标记的抗体的竞争结合通过可视化或者仪器测定标记物的存在与水平来判断样品中的目标物质。
3.单抗免疫层析法单抗免疫层析法是一种通过单克隆抗体进行检测的免疫层析法。
单抗免疫层析法拥有高度特异性和敏感性，通常可以用于检测非常低浓度的目标物质。
其原理和基本步骤类似于竞争型或夹心型免疫层析法，主要区别在于用于检测的抗体是经过单克隆化处理的。
4.荧光免疫层析法荧光免疫层析法是一种通过荧光标记物进行检测的免疫层析法。
其原理和基本步骤类似于竞争型或夹心型免疫层析法，主要区别在于标记物不同。
荧光标记物具有较高的敏感性，并且可以通过仪器进行定量测定。
因此，荧光免疫层析法通常用于对目标物质进行定量检测。
5.滴定型免疫层析法滴定型免疫层析法是一种通过滴定反应进行检测的免疫层析法。
滴定型免疫层析法能够通过滴定法测定目标物质的含量，常用于检测待测样品中目标物的浓度。
滴定型免疫层析法的原理是待测样品中的目标物质与滴定试剂反应生成可滴定物种，通过滴定法判断目标物质的存在与水平。
以上是常见的几种免疫层析法的原理分类介绍。
3 层析法
壁慢慢加入至柱顶部，勿使样品搅动吸附剂表面。
三、实 验 内 容
3.洗 脱
在柱顶不断加入洗脱剂，使
洗脱剂永远保持有适当的量，不 要让洗脱剂表面流干，使流动相 流速适当。
四、聚酰胺色谱
聚酰胺(Polyamide)是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化 合物，层析分离中常用的聚酰胺是由己内酰胺聚合而成的 尼龙6和由己二酸和己二胺聚合而成的尼龙66。
为Sephadex G-25经羟丙基化后的产物，应用较广。
具有分子筛特性，可按分子量大小分离物质；
在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反
相分配色谱的作用，适合于不同类型有机物的分离。
Sephadex LH-20即能在水中，也能在有机溶剂中或者 含水的混合溶剂中应用。
聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等有机
溶剂，对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差，可溶
于浓盐酸、冰醋酸及甲酸。
吸附机理---形成分子间氢键
聚酰胺通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物
的酚羟基，或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪酸上
的羰基形成氢键缔合而产生吸附。
CH2 N H O C CH2 CH2 O C
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2 点样
用微量注射器 或玻璃毛细管吸取 一定量试样点在原 点上。试样点的直 径一般应小于5mm。
层析纸按需要剪裁成长条形（或筒型）
可并排点多个试样
同时展开。
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3 展开
将滤纸浸于层析缸中的展开剂中，使展开 剂通过滤纸的毛细作用上升（或下降）， 实现试样的分离
展开时必须在密闭的容器中进行。 展开剂不得浸泡到起始线 上行展开法/下行展开法 双向展开法 连续展开法 径向展开法（圆形展开法）
免疫层析各种方法法原理
免疫层析各种方法法原理免疫层析（immunoassay）是一种通过对生物分子（一般是蛋白质）与抗体之间的特异性相互作用进行检测和定量分析的方法。
免疫层析常被用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
根据原理和方法的不同，免疫层析可以分为几种类型：夹心免疫层析、双抗体免疫层析、竞争免疫层析和流动免疫层析等。
夹心免疫层析（sandwich immunoassay）是一种常见的免疫层析方法，也被称为“间接法”。
其基本原理是，在待测物（通常是蛋白质）的测定物质表面上固定一定的抗体（特异性抗体），然后再添加待测物和另外一种特异性抗体来夹持待测物。
通过特异性抗体和待测物的结合，形成“夹心复合物”，从而实现对待测物的检测和定量分析。
双抗体免疫层析（double antibody immunoassay）是另一种常见的免疫层析方法。
其原理是采用两种不同的抗体：一种抗体被固定在固相（如试纸、载体等）上，另一种抗体与待测物结合后与固相上的抗体形成“桥梁”，最终形成可视化的标记物。
这种方法广泛用于快速疾病诊断和生物分子检测。
流动免疫层析（flow immunoassay）是一种在毛细管或纸张状固支持介质上进行的免疫层析技术。
流动免疫层析常用于家庭自检、迅速检测和快速诊断等场景。
其原理是通过特异性抗体与待测物结合，形成可视化的标记物，该标记物会沿着固支持物的方向进行迁移。
根据标记物的颜色或信号强度来判定待测物的存在与浓度。
以上所述的免疫层析方法仅为常用的几种，还有其他的变种方法和技术。
免疫层析作为一种广泛使用的分析技术，具有快速、准确和灵敏度高的特点，被广泛应用于医疗诊断、临床检验、食品安全、环境污染、农业生产等领域。
随着技术的进步和创新，免疫层析在未来可能会有更多的应用发展和改进。
实验柱层析和薄层层析
实验柱层析和薄层层析层析法是通过分离混合物组分的一种方法，主要有柱层析和薄层层析两种。
本文将介绍它们的原理、步骤和应用。
实验柱层析原理实验柱层析是一种液相色谱分离技术，基于混合物组分在固定相和流动相之间相互分配的差异进行分离。
实验柱层析一般采用正交试验法，即通过改变柱填料、流动相、流速和溶质质量浓度等参数，以缩小响应面，得到最佳分离条件。
步骤1.选择合适的柱径和柱高，并选用合适的柱填料。
2.准备流动相，并过滤除杂质。
将柱填料与流动相充分浸泡，使柱填料达到平衡状态。
3.将混合物加到柱顶，并开始淋洗。
此时各组分在流动相和固定相之间交替分配，被固定相吸附或溶解，同时前进，终于分离。
4.根据检测结果，确定样品组分并计算出分离效果和纯度。
应用实验柱层析作为一种分离技术，广泛应用于医药、化学、生物学等领域。
常见的应用包括：1.分离蛋白质、核苷酸等生物大分子。
2.对化合物进行分离、纯化和定量分析。
3.分离和提取天然产物和药物。
薄层层析原理薄层层析是一种比较简单、快速的分离方法，其原理与柱层析类似，只是采用了薄层硅胶或氧化铝等作为固定相，可直接对液态和固态样品进行分离。
步骤1.准备薄层柱。
2.准备固定相毛细管与混合样品。
3.在薄层柱上涂上一层液态固定相，然后将其晾干。
4.将样品分别点于薄层柱的一端，放入发展槽中，加入足量发展剂。
5.等到液面距离薄层柱顶端约0.5cm时取出，划线，停发展，晾干。
6.在笼罩于发展剂蒸汽中的小钵中烘干至静止。
应用薄层层析作为快速分离、纯化和检测生物和化学样品的一种常用手段，其应用包括：1.对合成的物质进行纯化和分离。
2.植物药的含量测定。
3.对复杂化学物质进行溶剂系统选择和定性分析。
实验柱层析和薄层层析都是常见的层析法，虽然原理类似但有各自的优缺点和应用场景。
在实际应用中，需要根据具体的分离任务选择合适的方法。
4层析法
颗粒粒径：几十~几百µ m
间隙：几~几十µ m 孔隙的孔径：nm级
固定相（凝胶）
三维空间网状结构
分子筛效应： 按分子大小不同，在凝胶受到的 阻滞作用有差异，从而造成各组分在 凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。
①
蛋白质混合物上柱；
②
开始洗脱，小分子进入凝胶 颗粒内，大分子被排阻在颗 粒外； 小分子被滞留而移动慢，大 分子移动快，大小不同的分 子开始分开； 大小不同的分子完全分开；
分配系数（Kd）
样品中各组分的流出顺序，可用分配系数 Kd来量度： 凝胶内部溶质的浓度 Kd = 凝胶外部溶质的浓度
0≤Kd≤l
每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数
Ve=Vo+KdVi （1） Kd=0，Ve=Vo 分子完全被排阻于凝胶颗粒之外 全部分布于流动相中 最先流出 （2）Kd=1，Ve=Vo+Vi 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内部扩散 在两相分配的比值为1，最后流出 特点：与被分离物质分 子的大小和凝胶颗粒孔 隙的大小有关
溶液中长期使用。
聚丙烯酰胺凝胶的性质
③
琼脂糖凝胶： Bio-Gel-A（美国，Bio-Rad）
商品名称：Sepharose（瑞典，pharmacia）
型号：2B，4B，6B;
Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M，150M。
型号含义：琼脂糖浓度为2%，4%，6%; 阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。
或与配体的亲和特性，而将待分离物质从亲和吸附剂
上洗脱下来。
a. 选择与配体有亲和力的物质进行洗脱；
b. 选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。
特异性洗脱
优点：
特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而
蛋白质层析法
蛋白质层析法是一种用于分离和纯化蛋白质的技术，它基于蛋白质在不同条件下在固定相和流动相中的分配系数不同来实现分离。
层析技术的基本原理是将混合物中的各组分根据其物理或化学性质（如分子大小、电荷、亲和性等）在不同相中的不同分布和迁移速率来实现分离。
以下是一些常见的蛋白质层析技术：
1. **凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography）**：
- 也称为分子筛层析，利用凝胶的多孔结构将分子按大小分离。
小分子可以进入凝胶内部的孔隙，而大分子则被排阻在外部，因此迁移速度不同。
2. **离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）**：
- 根据蛋白质的电荷性质（如阴离子或阳离子交换树脂）来分离蛋白质。
带正电的蛋白质可以与阴离子交换树脂结合，而带负电的蛋白质则与阳离子交换树脂结合。
3. **亲和层析（Affinity Chromatography）**：
- 利用蛋白质与特定配体（如金属离子、生物大分子等）的特定相互作用来分离蛋白质。
4. **反相层析（Reverse Phase Chromatography）**：
- 基于蛋白质在不同极性溶剂中的不同保留行为来实现分离。
通常使用非极性固定相（如C-18柱）和极性流动相。
5. **尺寸排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC）**：
- 也称为凝胶渗透层析，分离蛋白质混合物中的不同分子量蛋白质。
6. **疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）**：
- 利用蛋白质与固定相之间的疏水作用来分离蛋白质。
五种层析方法和原理
五种层析方法和原理五种层析方法和原理1. 列点 1•新华字典定义：层析方法是一种通过分析物质内部不同成分在不同条件下的分布情况，从而推断物质组成、性质和结构的方法。
•原理：层析方法基于物质成分在固定相和流动相之间的分配行为。
固定相通常是固体或涂覆在固体上的物质，而流动相则是向上或向下流动的溶剂。
2. 列点 2•薄层层析法：–原理：薄层层析法是一种将样品溶解在溶剂中后涂覆在薄层板的表面上，然后通过毛细作用将溶剂上升至薄层表面，样品成分分离的方法。
根据样品成分的亲疏水性质和与固定相的相互作用，不同成分会以不同的速度在薄层板上移动，从而实现分离。
–应用：薄层层析法常用于化学品分析、食品检测和药物分析等领域。
3. 列点 3•气相层析法：–原理：气相层析法是利用气体（流动相）和涂覆在固体或涂覆在固体上的涂层（固定相）之间的分配作用，使样品成分在涂层上分离的方法。
样品经过蒸发后进入气化室，在高温和惰性气体的作用下，样品成分分解为气体状态，然后进入色谱柱，通过不同成分与固定相的相互作用，实现分离。
–应用：气相层析法广泛应用于环境监测、食品安全检测和生物医药领域。
4. 列点 4•液相层析法：–原理：液相层析法是通过溶液中样品成分与固定相之间的相互作用，实现样品分离的方法。
当溶液通过柱子时，样品成分会根据其与固定相的相互作用力的强度和性质不同，在固定相上停留的时间也不同，从而实现分离。
–应用：液相层析法广泛应用于药物分析、食品检测和环境监测等领域。
5. 列点 5•离子交换层析法：–原理：离子交换层析法利用带电粒子（离子）之间的静电相互作用，在一定条件下，使样品中的离子与固定相中的带电粒子发生相互作用，从而实现分离。
不同离子会在不同条件下被吸附或释放，从而实现分离。
–应用：离子交换层析法常用于水质分析、药物分析和环境监测等领域。
通过以上列点方式，我们对五种层析方法的原理和应用作了简要的介绍。
这些层析方法在不同领域的分析和检测中扮演重要角色，为我们获取准确的数据和信息提供了有效手段。
9种层析分离纯化方法详解
9种层析分离纯化方法详解层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。
当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。
与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。
反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
按层析原理可将层析分为以下9种：1、亲和层析利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。
将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。
改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。
亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。
具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。
亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
亲和层析纯化的分离原理特点：亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。
2、离子交换层析采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。
主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。
不同蛋白质的等电点（pI，isoelectric point）特性，使在不同pH缓冲液条件下所带正/负净电荷不同，选择不同的离子交换柱实现分离。
层析的原理和应用
层析的原理和应用1. 层析的概念和基本原理层析（Chromatography）是一种将混合物中的组分分离和提纯的技术方法。
它基于组分之间在固定相和流动相之间的相互作用力的不同，使各种组分在系统中以不同速度迁移，达到分离的目的。
层析技术广泛应用于化学、生物、环境等领域。
层析技术的基本原理是利用流动相在固定相上的移动来实现物质的分离。
固定相通常是具有一定吸附性或分配性的材料，如硅胶、纸张、亲水性基质等。
流动相则是将待分离的混合物溶解在溶剂中，通过与固定相的相互作用，使各组分在固定相上以不同速率迁移。
2. 层析技术的分类和应用层析技术根据其基本原理和操作方式的不同，可以分为多种类型。
以下是其中几种常见的层析技术及其应用：2.1 薄层层析法（TLC）薄层层析法是一种在薄层材料上进行的层析技术。
常用的薄层材料包括硅胶和氧化铝等。
它具有简单、快速、经济的特点，广泛应用于药物分析、食品安全检测、环境监测等领域。
2.2 柱层析法柱层析法是将固定相填充在柱中，通过流动相沿着柱内固定相的分布，实现各组分的分离。
根据固定相的不同，柱层析法又可分为凝胶柱层析和高效液相层析等。
柱层析法在药物分离纯化、天然产物提取、有机合成等领域具有广泛应用。
2.3 气相层析法（GC）气相层析法是将待分离的混合物蒸发为气体状态，通过在柱中固定相的分离，最终使各组分在检测器上进行定性和定量分析。
气相层析法广泛应用于石油化学、环境监测、食品安全等领域。
2.4 液相层析法（LC）液相层析法是将待分离混合物溶解于液相，在柱中利用固定相进行分离。
液相层析法根据流动相的不同，可分为常压液相层析和高效液相层析等。
液相层析法在制药、生物、环保等领域具有广泛应用。
2.5 离子层析法（IC）离子层析法是利用不同组分之间的化学亲合性进行分离的一种层析技术。
它广泛应用于水质分析、环境监测、生物学研究等领域，尤其是对离子的分析具有很高的选择性和灵敏度。
3. 层析技术的优点和局限性层析技术具有许多优点，使其成为众多分析方法中的重要手段。
常用的蛋白质纯化方法和原理
常用的蛋白质纯化方法和原理蛋白质的纯化是生物化学研究中非常重要的一步，纯化蛋白质可以用于结构解析、功能研究、动态过程研究等各种生物学实验。
常用的蛋白质纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、逆渗透法和层析法等。
下面将对这些方法的原理和步骤进行详细阐述。
1. 盐析法盐析法是根据蛋白质在溶液中的溶解性随盐浓度的变化而变化的原理进行蛋白质的纯化。
该方法是利用蛋白质在高盐浓度下与水结合能力降低，使其从溶液中沉淀出来。
应用盐析法时，需要先调节溶液的盐浓度使蛋白质溶解，然后逐渐加入盐使其过饱和，蛋白质便会析出。
最后通过离心将蛋白质的沉淀物分离，得到纯化的蛋白质。
2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是利用凝胶的pores 来分离蛋白质的一种方法。
凝胶通常是聚丙烯酰胺（也称作Polyacrylamide）或琼脂糖。
研究者将蛋白质样品加入到过滤膜上，较小的蛋白质能够通过pores，较大的分子则被排出。
通过选择不同大小的凝胶孔径，可以根据蛋白质的大小来选择合适数目的过滤膜。
凝胶过滤法需要进行缓冲液体积的连续换流，将蛋白质与其他杂质分离开来。
3. 离子交换色谱法离子交换色谱法是利用蛋白质与离子交换基质之间静电吸引力的不同而分离的方法。
离子交换基质通常是富含正离子或负离子的高分子材料。
在离子交换色谱法中，样品溶液在特定的pH 下流经离子交换基质，带有不同电荷的蛋白质能够与基质发生反应，吸附在基质上。
为了获得纯化蛋白质，需要通过梯度洗脱，逐渐改变缓冲液pH 或离子浓度，使吸附在离子交换基质上的蛋白质逐渐释放出来。
4. 亲和色谱法亲和色谱法是利用蛋白质与特定的配体相互作用特异性进行分离的方法。
配体可以是天然物质，如金属离子、辅酶或抗体，也可以是人工合成的结构。
在亲和色谱法中，样品溶液经过含有配体的固定相，与配体发生特异性相互作用，蛋白质与其它组分分离。
然后可以通过改变某些条件（如pH、温度或离子浓度）来洗脱纯化的蛋白质。
常用的柱层析方法
常用的柱层析方法体积排阻（Size Exclusion）层析也称分子筛、凝胶过滤层析或凝胶渗透层析。
其工作原理是利用蛋白质分子量或分子外形的差异实现分别。
体积排阻层析柱的柱床由多孔介质填料组成，当样品从层析柱的顶端向下运动时，大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒而快速洗脱，小的蛋白质分子能够进入凝胶颗粒内，其在凝胶内部的迁移被延迟。
因此，蛋白质从柱中被洗脱的挨次普通按分子量由高到低。
体积排阻层析主要用来从蛋白质溶液中去除低分子量的缓冲液成分和盐。
(1) 挑选适当的层析柱假如需要从复杂原料中将全部较大分子量的分子（如大于5000Da )的物质与小分子（5000Da以下）物质分开，可以挑选排阻极限小的层析柱，如Sephadex G-25填料的柱子；假如要分别相对分子量相差不大的柱子，可按照各种凝胶的排阻范围举行挑选。
固然也可以购买填料自己装柱，但试验结果的重复性、稳定性不如预装柱。
(2）挑选适当的缓冲液了解样品的稳定性，挑选保证样品性质稳定的pH和离子强度的缓冲液。
须要时，可以取少量样品举行测试。
多数状况下可用水作缓冲液，为了避开非特异性吸附或者对于一些在纯水中溶解度较低的蛋白质，常采纳缓冲盐溶液举行洗脱。
对于一些吸附性强的物质也可采纳水和有机溶剂的混合物举行洗脱。
(3）样品的处理样品在上样前普通要举行离心或过滤处理，以去除影响层析柱分别效果的杂质并可防止柱子堵塞。
少量样品普通在1000g离心15 min，细胞裂解液在4000-5000g离心30min，去除脂质和细胞碎片。
挑选过滤的滤膜孔径与填料颗粒的孔径大小相关。
对于与滤膜有非特异性结合的样品，应用离心代替过滤。
(4）上样量为了达到良好的分别效果，上样量必需保持较小的体积，普通为柱体积的2％-5%。
(5）洗脱与收集洗脱过程中应保持流速稳定，不宜过快。
收集时应该按照样品的量和试验的目的挑选适当的组分来收集。
【关键词】常用柱层析办法上一篇：下一篇：第1页共1页。
实验五层析实验
C2分5B配%：层一物析本碘质〔醋在实p酸氨Ba钾相rt验it溶〔基ion液流是c移5动h滴r相o将，m换〕同a中tGo置反g的r4la浓0up响℃h度与y水〕，浴丙中然保酮温后3酸0分用在钟纸。肝层匀析浆法中检的查谷反-丙响转体氨系酶中的A作la的用生下成进。行 精0本1氨实m酸 验ol是以由/L，碱天于p性冬影H氨氨=谷7基酸响. 酸〔氨氨，Aspp酸I〕基=1和0、.移精氨丙换酸〔酮过Ar酸g程〕混在的合物肝观为匀例察，浆利，用中磺因酸可此型阳循在离子其反交换他响树代脂体〔谢国系产途中732径树添脂分加〕将解一二者和碘分别转醋从化混酸合，物(或中别离。 一溴醋酸)以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。 3 cm为宜，等干后，在1、2号原点上，再重复点一次(注意，不可调错)，然后分别点上谷氨酸、丙氨酸，作为对照，干后置层析缸中
【操作步骤】
1．层析薄板的制作： 称取硅胶G 2g置研钵中参加0.3%羧甲基纤维素8mL，研匀后迅速 倒在8 cm×12 cm玻片上，水平放置，使分布均匀，待其凝固后， 置100℃烘箱中烘干备用。 2．点样及展层： 分别用毛细玻管吸取各种脂质的标准液及试样，在薄板的一端1.5 cm高度处取间距为1 cm点样，待溶剂蒸发后置于盛有展开剂的标 本缸中，点样一端起点以下，浸入展开剂中。注意：点样处切勿浸 入展开剂中。
实验五层析实验
层析法又称色谱法〔Chromatography〕
是利用混合物中各组分理化性质〔如溶解度、极性、吸附力、亲和力、 电荷和分子量等〕的差异，将多组分混合物中的物质进行别离、分析 和纯化的一种技术
是利用混合物中各组分在两相〔固定相和流动相〕间进行分配。当流 动相携带混合物经过固定相时，即与固定相相互作用，由于各组分的 理化性质、分子结构等的不同，使得待别离物质与固定相的作用程度 存在着差异〔即不同组分具有不同的分配系数〕，不同组分在固定相 中的滞留时间不同，从而随流动相移动的速率也有所不同，最终到达 各组分彼此别离的目的。
各类层析色谱分析技术完全讲解
层析介质与生物大分子的关系
大孔径的，亲水性好的球形材料。 多糖类凝胶层析介质最常用
Sephadex
Sepharose Bio-Gel
缺点：刚性差，不耐压，分离时间长
层析介质的性能
层析介质的形状：球形，不定形 技术指标
粒度大小：粒度小，分离效果好，但流速慢
均匀度：均匀，流速快，峰值集中 机械强度：强度高，流速快，保留值小，柱效高 理化性质：稳定，非特异性吸附少，亲水性好，耐酸碱和有机溶剂 吸附容量：单位质量或体积的层析介质吸附流动相中溶质的质量。
流动相
流动相
缓冲溶液：根据待分离物质的性质（等电点、极
无机化合物：无机盐类、无机酸类、络合物类等 有机化合物：烷烃类、有机酸和有机胺类、杂环类 生物大分子：核酸和核苷酸类、蛋白质、酶及肽类、多 活体生物：
糖及寡糖类、激素类 病毒、细菌、细胞器等
分析的参数
常见的层析分离法分析技术，是以混合物中分离 单一成分，制备一定量的产品为主，以分析鉴定 化合物的性质，获得分析参数为辅。
原理
根据物料中各组分对固定相(吸附剂) 的吸附程度不 同，以及其在相应的流动相(溶剂)中溶解度的差异 来实现。经反复的吸附—解吸—再吸附—再解吸的 过程，达到分离目的。 无化学键引入，只存在相对较弱的氢键力、范德华 力和偶极力相互作用。
吸附力的产生
吸 附
吸附：任何两相都可以形成界面，其中一相的 物质或溶解在其中的溶质在另一相表面上发生 密集行为。
薄层层析法
纸层析法
薄膜层析法
常用的层析方法
常用的层析方法层析填料是决定拄效的主要因素。
填料应具有的性能是不溶于所使用的流动相中，不使欲分离的物质破坏或分解、惰性大，可逆性强，吸附容量大，同时颗粒直径范围要狭．因此在选择填料时事先应对其性能有充分的了解，下面将按常用填料名称分类介绍。
1 硅胶层析（1）性质层析硅胶为一多孔性物质，可用通式Si02·xH20表示．它具有多孔性的硅氧环的交键结构，由于其骨架表面具有很多游离(I)、键合(Ⅱ)和键合—活性(III)状态的硅醇基·(silanol)基团它能够通过氢键与极性或不饱和分子相互作用，同时能吸附多量的水分．当加热活化(100一110℃)时，硅胶表面因氢键所吸附的水分能可逆地被除去；但温度升高至500℃时，硅胶表面的硅醇基进一步脱水缩合转变为硅氧烷键即硅氧环表面(A)及稠合环氧环烷(B)，从而丧失了因氢键吸附水分的活性不再具有吸附剂的性质．若用水处理亦不能恢复其吸附活性加热至1100℃时则结合水失尽．由于硅胶的吸附能力与硅羟基数量有关，因此活化时不宜在较高温度进行，一般在170℃以上即有少量结合水失去．硅胶的吸附性能取决于硅胶中硅羟基的数目，其次是含水量，它随着水分的增加而降低(表l—3)．若吸水量超过12％，吸附力极弱，不能用作吸附层析，只可用作分配层析的载体．硅胶的表面积、表面结构、微孔体积及微孔半径均直接影响着层析分离的效果(生产都得测出型号)．另一方面因它具有弱的非特异性吸附，能同样吸附极性、非极性饱和和不饱和分子，所以硅胶具有吸附层析与分配层析的双重性．同时硅胶又是一种弱酸，其表面的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，解离常数为10 -6—10 -8，是一种弱酸性阳离子交换剂，当遇到较强的碱性化合物时，则可因离子交换作用而吸附碱性化合物。
硅胶表面的硅羟基能与各种醇如氰乙醇、正辛醇、聚乙二醇在一定温度下加热脱水后生成单分子键合固定相(Si—O—C型)，与十八烷基三氯硅烷生成烷基化学键合相(Si—O—Si—C 型)．另外用S0Cl2将硅胶表面氯化后，与各种有机铵反应生成具有Si—O—Si≡N键的各种不同极性基团的化学键合相，这大大有助于提高分离选择，在液相色谱中占有极为重要的地位，并普遍用于高效液相层析．层析硅胶应是中性无色颗粒，由于制备过程中接触强酸，常带有酸性，故在使用前应检查其水浸液的酸度，不低于pH5时才可使用．否则应用水洗至中性，再在110℃活化24h．在特殊情况下，硅胶须经6N*盐酸及氯仿等有机溶剂预洗，除去其中所含的铁离子及有机脂溶性杂质．硅胶在甲醇、水等强极性溶剂中有一定的溶解性，约为0.01％．当溶液在pH9以上则溶解度急剧上升，此点在选择溶剂时应注意，否则会将流分中溶解硅胶误认为植物成分．硅胶层析有时可以加入一种复合试剂，以改良吸附性能，提高分离效果．通常用硝酸银处理硅胶对不饱和烃类有极好的分离作用．改良吸附剂制备一般用1—10%复合试剂的水或丙酮溶液，与硅胶混匀，待稍干后于110℃干燥即可．硅胶层析适用范围广，能用于非极性化合物也能用于极性化合物，如芳香油，萜类，甾体，生物碱，强心甙，蒽酮类，酸性、酚性化合物，磷脂类，脂肪酸，氨基酸以及一系列合成产物等的分离．(2)层析柱的制备与加样硅胶装柱一般用湿法，即将硅胶混悬于装柱溶剂中，不断搅拌，待内中空气泡除去后，连同溶剂一起倾入层析柱中，层析柱中硅胶段直径与长度之比一般为1：20—30．若硅胶的颗粒较细，而粒度分布范围狭，则可采用短柱(1：5)，这样不仅增大了截面积，而且也增加了样品的载量．硅胶最好一次倾入，否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段现象，影响分离效果．另亦可采用干法装往，将所需硅胶一次倾入柱中，然后礅紧至硅胶高度不改变为止。
免疫层析各种方法法原理
免疫层析各种方法法原理免疫层析法（immunochromatography）是一种广泛应用于生物医学领域的免疫分析技术。
它基于抗原抗体反应的特异性，通过将抗体固定在固相支持材料上，实现对目标分子的检测和测定。
免疫层析法具有操作简便、实时性强和可视化结果等优点，在快速诊断、环境监测、食品安全等领域有广泛的应用。
免疫层析法的基本原理是将液相中的目标分子与固相上的特异性抗体发生反应，从而实现目标分子的检测和分离。
免疫层析法常用的方法包括间接免疫层析、竞争免疫层析和直接免疫层析。
间接免疫层析法是最常见的免疫层析方法。
其基本原理是将目标物质与标记物结合形成复合物，然后将复合物与固相上的抗体相互结合，从而实现目标物质的检测和测定。
间接免疫层析法通常使用胶体金或者其他标记物质进行标记，在免疫层析试纸上可见金红色线条显示结果。
竞争免疫层析法是通过竞争分子与目标分子在固相上的抗体结合来实现检测和测定的方法。
它的原理是将标记的检测物与待测物在固相上的抗体竞争结合，形成竞争复合物，进而通过与检测物竞争亲和力的程度确定目标物质的浓度或者存在与否。
竞争免疫层析法通常使用竞争物与待检测物在固相上的抗体结合，从而实现结果的测定。
直接免疫层析法是将目标物质直接与固相上的抗体相互结合，从而实现检测和测定的方法。
它的原理是将液相中的目标分子直接与固相上的抗体结合形成复合物，然后通过可视化或其他方法来判断复合物的形成情况，从而进行目标物质的检测和测定。
除了以上三种方法之外，还有一些衍生的免疫层析方法。
例如，双向免疫层析法，它的原理是将待测物与标记物在液相中预先形成复合物后加样，这种方法可以大大提高灵敏度和准确性。
另外，还有一种称为流动免疫层析法的方法，它基于待测物与经过标记的抗体结合后，形成可见线条或者其他显示方式的反应结果。
总之，免疫层析法是一种通过特异性抗体与目标分子结合形成复合物来实现检测和测定的免疫分析方法。
通过不同的方法和策略，可以实现对不同分子的快速、准确和可视化的检测。
四种蛋白纯化的有效方法
四种蛋白纯化的有效方法四种蛋白纯化的有效方法在进行蛋白质研究和酶工程等领域的实验过程中，常常需要将目标蛋白从复杂的混合物中纯化出来。
蛋白纯化的目的是获取高纯度的目标蛋白样品，以便进一步进行结构和功能研究。
然而，由于蛋白质的复杂性以及其在混合物中的低浓度，蛋白纯化常常面临一系列的挑战。
为了克服这些挑战，科学家们开发了多种蛋白纯化的方法。
在本文中，我们将介绍四种常见而高效的蛋白纯化方法，并探讨其原理和适用性。
1. 亲和层析法：亲和层析法是一种利用目标蛋白与配体之间的特异性结合进行纯化的方法。
这种方法基于目标蛋白与配体之间的亲和力，通过设计具有高亲和性的配体来选择性地结合目标蛋白。
在实验中，我们可以将配体固定于固相材料上，例如琼脂糖或石蜡烃树脂，并将载有目标蛋白的混合物与这些固定化的亲和基质进行接触。
随后，非特异性蛋白质被洗脱，而目标蛋白则被保留下来。
目标蛋白可以通过改变条件（例如改变pH值或添加竞争性配体）来洗脱。
亲和层析法的优点在于具有高选择性和高纯度的优势。
然而，由于亲和剂的设计和合成需要具有相关专业知识，并且选择适当的配体是关键。
亲和层析法在不同的纯化过程中的适用性会有所不同。
2. 凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）：凝胶过滤层析法是通过分子量的差异将混合物中的蛋白质分离的一种方法。
凝胶过滤层析法是利用凝胶材料，例如琼脂糖或琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶，通过分子在凝胶孔隙中的渗透性而将蛋白分离开来。
较大的蛋白分子无法进入凝胶孔隙，因此会在凝胶的表面留下。
较小的蛋白分子则能够渗透进入凝胶孔隙中，因此会相对于较大的蛋白分子更早地溢出。
凝胶过滤层析法的优点在于操作简单、速度快，且可以对蛋白进行某种程度的分离。
然而，该方法的分离效果受到蛋白质在凝胶中的体积效应的限制，因此对于体积较大的蛋白分子，凝胶过滤层析可能无法实现理想的分离效果。
3. 离子交换层析法：离子交换层析法是一种基于蛋白与离子交换材料之间的电荷相互作用进行纯化的方法。
四种层析方法
四种层析方法层析方法是一种将混合物中的化合物分离出来的方法。
这种技术通过利用化合物在固定相和移动相之间的不同亲和性来实现分离。
层析方法因其简单性和广泛的适用性而成为化学、生物化学和制药学中最基本的分离技术之一。
本文将介绍四种常见的层析方法，包括薄层层析法、气相层析法、离子交换层析法和凝胶层析法。
这些方法将被讨论其原理、应用、实施步骤和优缺点。
一、薄层层析法薄层层析法（TLC）是一种快速、低成本的液相分离技术。
该技术将被分析物和固定相通过一个毛细管作为裂隙分裂（slit split），使用一层非极性或极性的固定相作为分离基质，包括硅胶、氧化铝和氢氧化铝。
被分离的化合物随着移动液相在固定相上移动，不同化合物基于其不同亲和性分配到不同位置上。
该方法的实施步骤包括样品的准备、涂抹和显色步骤。
样品通常被溶解在一个合适的溶剂中，并用玻璃毛细管将其施加到固定相上。
一旦样品施加到固定相上，被分离的化合物将随着移动液相在固定相上移动。
显色可以通过利用化学试剂或紫外线进行检测。
TLC 广泛应用于化学、生物化学和制药学中，用于分析中等大小的有机和无机化合物，如氨基酸、脂肪酸、天然产物和药物。
优点：TLC是一种快速、低成本的分离技术，对于中等大小的化合物具有很好的分离效果。
TLC可以用于大规模样品纯化，并且可以被用于对化合物混合物进行初步分析的快速筛选。
缺点：TLC存在分离效率低和灵敏度低的问题，并且与其他层析技术相比，其分辨率相对较低。
TLC在数据分析方面存在可重复性差的问题。
二、气相层析法气相层析法（GC）是一种对挥发性和半挥发性化合物进行分离的技术。
此方法使用长列的液体或固定相，将待分离的化合物从液态或气态的样品中吸附并分离出来。
通过加热样品，在固定相中获得了一个气态分离的组分，可以将化合物通过检测器进行检测。
该方法通常使用非极性液态或固态固定相，如聚硅氧烷或聚乙二醇。
GC也可以选择更具有极性的固定相，从而实现对更极性化合物的分离。
常用的层析分析方法
常用的层析分析方法在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。
一、吸附层析1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。
2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。
这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。
3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。
这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。
因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。
二、离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。
离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
`三、凝胶过滤凝胶过滤又叫分子筛层析，其原因是凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部。
当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
四、亲和层析亲和层析的原理与众所周知的抗原一抗体、激素一受体和酶一底物等特异性反应的机理相类似，每对反应物之间都有一定的亲和力。
正如在酶与底物的反应中，特异的废物(S ‘)才能和一定的酶(E)结合，产生复合物(E－S‘)一样。
在亲和层析中是特异的配体才能和一定的生命大分子之间具有亲和力，并产生复合物。
而亲和层析与酶一底物反应不同的是，前者进行反应时，配体(类似底物)是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。
实质上亲和层析是把具有识别能力的配体L(对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等)以共价键的方式固化到含有活化基团的基质M(如活化琼脂糖等)上，制成亲和吸附剂M－L，或者叫做固相载体。
3-13-常见分离纯化技术原理
常见分离纯化技术原理---介绍离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、分配层析和电泳原理1、离子交换层析法⏹原理:根据离子间作用力的不同而将物质分离的方法⏹离子交换剂可解离出阴离子或阳离子，当待分离的溶液中含有阳离子时可以与阳离子交换剂的阳离子交换吸附在离子交换介质上，带电量不同的物质与离子交换剂的结合力不同，解离的条件不同，可通过改变条件，促使其解离和分部收集待分离物。
Sampleapplication and wash Elution Equilibration Regeneration-------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++anion exchanger bead ----------离子交换层析步骤和发生的变化2、凝胶过滤层析技术●概念（排阻层析，分子筛层析）：当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离的技术。
●原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外,在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
⏹凝胶过滤法测定相对分子量◆蛋白质分子通过凝胶的洗脱体积取决于它的斯脱克半径；◆如果未知蛋白与理想的非水化球体有相同的洗脱体积，则认为这种蛋白质具有与球体相同的的斯脱克半径；◆因此，实验中只要测得标准蛋白的洗脱体积，再测得未知蛋白的洗脱体积就可以得到它的相对分子量。
3、疏水作用层析⏹非极性氨基酸残基组成的疏水区域可使蛋白质结合非极性分子，利用这种相互作用蛋白质可被吸附在基质上。
⏹在不带电荷的载体上偶联疏水基团而形成疏水吸附剂⏹利用载体和样品疏水基团间的相互作用使它们吸附在一起，然后改变层析条件，减弱疏水作用，使吸附的蛋白质从吸附剂上解吸下来。
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层析技术的应用一、层析技术的原理和分类（一）层析技术的原理层析法是目前广泛应用的一种分离技术。
本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。
现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。
层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。
当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。
与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。
反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
（二）层析法分类见表16-5～7（三）层析法的特点与应用表16-5 按两相所处状态分类液体液-液层析法气-液层析法固定相固体液-固层析法气-固层析法层析法是根据物质的理化性质不同而建立的分离分析方法。
根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可以定性及定量。
层析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量，同时绘出层析图。
层析仪与电子计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。
由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。
近年来，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。
在医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也得到了广泛的应用。
表16-6 按层析原理分类名称分离原理吸附层析法组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂，各能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同凝胶层析法固定相是多孔凝胶，各组份的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度不同亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离表16-7 按操作形式不同分类名称操作形式柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离薄层层析法将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离薄膜层析法将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离二、层析法实验技术（一）凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。
它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
⒈凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。
如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。
如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。
一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于K d不同，最后得到分离。
⒉柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm 则稀释现象严重。
长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
⒊凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。
自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。
加热法既可节省时间又可消毒。
凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。
稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。
在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。
平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。
⒋加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。
一般样品体积不大于凝胶总床体积的5％-10％。
样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2。
样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。
⒌凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。
为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02％的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。
如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。
湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。
⒍凝胶层析的应用⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。
本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。
适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。
柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。
凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。
测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。
（二）离子交换层析法离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。
⒈离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。
溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。
阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。
洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。
已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。
为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。
柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。
⒉加样与洗脱加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH 值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。
样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。
为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。
柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1％-5％。
洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。
为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。
由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。
最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，洗脱装置见图16-6。
两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。
第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1式中A1、A2分别代表两容器的截面积：C1、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。
当A1＝A2时为线性梯度，当A1＞A2时为凹形梯度，A1＞A2时为凸形梯度。
洗脱时应满足以下要求：①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。
②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。
③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。
目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。
图16-6 梯度洗脱示意图⒊洗脱馏份的分析按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。
依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。
⒋离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。